一种引物对及其在BCG-CpG-DNA佐剂质控方法中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是疫苗佐剂的质量控制，具体的，本发明涉及一种引物对及其在BCG-CpG-DNA佐剂质控方法中的应用。

背景技术

佐剂在疫苗中的作用或不可缺，在佐剂免疫功能方面，从最早使用的铝佐剂，作为目前唯一广泛使用的疫苗佐剂，其安全性毋庸置疑，但其对仅能增强体液免疫，不能增强细胞免疫。进入新时代由于新技术如分子纯化、重组技术、分析生化学等的发展，人们对免疫机制认识的深刻，对开发新的免疫佐剂日益迫切。

近年来科研人员为寻找更加高效、安全的新型佐剂进行了大量研究。许多试验证实细菌DNA在体外对细胞免疫有免疫增强效果，目前研究较多的CpG-DNA是含有非甲基化CpG(胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸)基序的DNA，有较强的免疫增强活性。用人工合成的CpG寡聚核苷酸为佐剂研究结果显示，具有增强细胞免疫和体液免疫的双重效果。BCG-CpG-DNA是从卡介菌(BCG)提取的天然CpG-DNA其具有CpG良好的免疫刺激活性，且BCG在世界范围内沿用多年而证明该佐剂具有良好的安全性，CpG-DNA佐剂与铝佐剂具有协同作用，是一种有前途的新佐剂，可用于预防和治疗用疫苗中的佐剂。

然而，BCG-CpG-DNA佐剂是从天然卡介菌菌体采用机械随机破碎，经离子交换和置换层析，最后经中空纤维柱超滤获得的分子量片段分布于2～10kb的核酸片段，现有质控指标主要以非甲基化的CpG含量、核酸含量及纯度来衡量，不能充分的反应CpG-DNA佐剂不同分子量的分布情况，即未对2～10kb分子量片段分布的范围进行质控研究，需要开展DNA指纹图谱和定量质控。

现有技术存在的缺点：(1)BCG-CpG-DNA佐剂是从卡介菌破碎菌体中提取的DNA片段，采用的机械破碎具有随机性，难以建立并质控批间的差异；(2)目前该佐剂质控指标仅包括CpG含量和核酸纯度，现有方法中需要对样品进行甲基化处理，和高效液相上机等复杂操作，这种质控方法存在操作步骤繁琐、对操作人员试验技术要求极高、耗时周期长等缺点。

目前公开数据信息尚未查询到以长链PCR扩增技术对BCG-CpG-DNA佐剂进行有效的质控，并评价其核酸分布的均一性。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明提供了一种引物对及其在BCG-CpG-DNA佐剂质控方法中的应用。具体的，

本发明第一方面，提供一种引物对，其中，所述引物对中的引物至少具有29bp，用于扩增BCG-CpG-DNA佐剂中的质控片段，所述质控片段根据卡介菌基因组DNA确定，所述质控片段为卡介菌基因组DNA片段，大小为2-6.0kb。

优选地，所述质控片段大小包括2-6.0kb，例如2.0kb、2.5kb、3.0kb、3.5kb、4.0kb、4.5kb、5.0kb、5.5kb、6.0kb，或上述数值的任一范围，例如3.0-6.0kb，3.0-5.0kb等等。

优选地，所述引物具有高的Tm值，所述Tm值至少为60℃。

优选地，所述引物对包括一对或者多对，用于扩增一个或者多个质控片段。

更优选地，所述多个质控片段，包括例如至少2个片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等等；更优选地，质控片段包括2-10，进一步优选为3-7，例如5个质控片段。

更优选地，所述引物对为多对时，可用于扩增的质控片段具有相同或者不同大小。

更优选地，所述质控片段大小相同，根据卡介菌基因组DNA将其分为4-7个区段，优选为5个区段，每个区段扩增其3.0kb、5.0kb和/或6.0kb的质控片段。

或者，所述质控片段大小不同，可以在同一区段内选择大小不同的质控片段，也可以在不同区段内选择大小不同的区段。

进一步优选地，扩增每一区段中不同大小的质控片段采用相同的上游引物。

(1)SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；

(2)SEQ ID No:1和SEQ ID No:3；

(3)SEQ ID No:1和SEQ ID No:4；

(4)SEQ ID No:6和SEQ ID No:7；

(5)SEQ ID No:6和SEQ ID No:8；

(6)SEQ ID No:6和SEQ ID No:9；

(7)SEQ ID No:11和SEQ ID No:12；

(8)SEQ ID No:11和SEQ ID No:13；

(9)SEQ ID No:11和SEQ ID No:14；

(10)SEQ ID No:16和SEQ ID No:17；

(11)SEQ ID No:16和SEQ ID No:18；

(12)SEQ ID No:16和SEQ ID No:19；

(13)SEQ ID No:21和SEQ ID No:22；

(14)SEQ ID No:21和SEQ ID No:23；和/或，

(15)SEQ ID No:21和SEQ ID No:24。

优选地，所述引物对包括上述任意一对或者多对组合。

例如所述引物对可用于扩增任意区段的3.0kb、5.0kb或者6.0kb的质控片段。或者，

所述引物对可用于扩增5个区段中的所有3.0kb的质控片段，扩增5个区段中的所有5.0kb的质控片段，或者扩增5个区段中的所有6.0kb的质控片段。或者，

上述质控片段的任意组合。

本发明第二方面，提供一种BCG-CpG-DNA佐剂中质控片段或其检测试剂在BCG-CpG-DNA佐剂质控中的应用，其中，所述质控片段根据卡介菌基因组DNA确定，所述质控片段为卡介菌基因组DNA片段，大小为2-6.0kb。

优选地，所述质控片段大小包括2-6.0kb，例如2.0kb、2.5kb、3.0kb、3.5kb、4.0kb、4.5kb、5.0kb、5.5kb、6.0kb，或上述数值的任一范围，例如3.0-6.0kb，3.0-5.0kb等等。

优选地，所述质控片段包括一个或者多个，例如至少2个片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等等；更优选地，质控片段包括1-10，进一步优选为1-5个质控片段。

更优选地，所述质控片段具有相同或者不同大小。

更优选地，所述质控片段相同，根据卡介菌基因组DNA将其分为4-7个区段，优选为5个区段，每个区段扩增其3.0kb、5.0kb和/或6.0kb的质控片段。

进一步优选地，所述质控片段来自于相同或者不同的区段。

优选地，所述检测试剂包括扩增所述质控片段的引物对。

更优选地，所述引物对如本发明第一方面所定义。

本发明第三方面，提供一种BCG-CpG-DNA佐剂的质控方法，所述质控方法包括，

1)根据卡介菌基因组DNA确定质控片段，所述质控片段为卡介菌基因组DNA片段，大小为2-10.0kb；

2)对质控片段进行检测；

3)分析不同批次的BCG-CpG-DNA佐剂中质控片段的检测结果。

优选地，所述步骤1)中的质控片段大小包括2-10.0kb，例如2.0kb、2.5kb、3.0kb、3.5kb、4.0kb、4.5kb、5.0kb、5.5kb、6.0kb，或上述数值的任一范围，例如3.0-6.0kb，3.0-5.0kb等等。

优选地，所述步骤1)中的质控片段包括一个或者多个质控片段，例如至少2个片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等等；更优选地，所述步骤2中的多个质控片段包括1-10，进一步优选为1-5个质控片段。

优选地，所述步骤质控片段为多个时，所述质控片段的大小都相同或者不同。

在一个具体的实施方式中，所述质控片段的大小为3.0kb、5.0kb和/或6.0kb。

优选地，所述质控片段为多个时，所述质控片段的核苷酸序列相同或者不同。

可以根据卡介菌基因组DNA序列分为不同的区段，不同区段选取不同的质控片段，例如，将卡介菌基因组DNA序列分为4-7个区段，每个区段选取不同的3.0kb、5.0kb和/或6.0kb的片段作为质控片段。

或者，所述质控片段大小不同，可以在同一区段内选择大小不同的质控片段，也可以在不同区段内选择大小不同的区段。

在一个具体的实施方式中，将卡介菌基因组DNA序列分为5个区段，对每个区段中的3.0kb、5.0kb和/或6.0kb中的一个或者多个质控片段进行检测。

更为优选地，所述同一区段中不同大小的质控片段具有相同结构的上游序列。

优选地，所述步骤2)中的检测方法包括长链PCR技术、荧光定量PCR对质控片段进行检测。

更优选地，所述长链PCR方法包括对多个质控片段设计多对引物对，扩增上述不同质控片段。

进一步优选地，所述引物对如本发明第一方面所定义。

优选地，所述步骤3)的检测结果分析包括经灰度扫描和相对定量比值来评估不同批次BCG-CpG-DNA的质控片段的均一性。

进一步优选地，所述检测结果分析包括以其中某一批次的质控片段表达量为参考条带，其他批次质控片段相对于所述参考条带的相对表达量进行表示。

本发明的有益技术效果：

1、首次对采用卡介菌基因组DNA片段本身作为质控片段的可行性进行了验证，不需要对佐剂进行甲基化处理和高效液相上机等复杂操作，本发明的方法操作简单，可行，本发明的质控方法提高了质控的效率，降低了成本；

2、本发明采用长链聚合酶链式(PCR)反应技术，基于BCG-CpG-DNA佐剂生产用菌种全基因组测序已获取，从全基因组5'→3'端依次选取五区段处基因序列设计多对特异性引物，通过长链PCR技术，扩增出不同质控片段(3kb、5kb和/或6kb)，提高了检测的特异性，所述方法可用于BCG-CpG-DNA佐剂核酸分布均一性质控。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1所示为以7批BCG-CpG-DNA佐剂为模板的不同区段的3kb质控片段经引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中(a)～(e)分别代表1/5～5/5区段)。

图2所示为以7批BCG-CpG-DNA佐剂为模板的不同区段的5kb质控片段经引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中(a)～(e)分别代表1/5～5/5区段)。

图3所示为以7批BCG-CpG-DNA佐剂为模板的不同区段的6kb质控片段经引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中(a)～(e)分别代表1/5～5/5区段)。

图4所示为以7批BCG-CpG-DNA佐剂为模板的不同区段的7kb质控片段经引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中(a)～(e)分别代表1/5～5/5区段)。

图5所示为不同区段的3kb质控片段引物对PCR产物灰度扫描结果，其中(a)～(e)分别代表1/5～5/5区段)。

图6所示为不同区段的5kb质控片段引物对PCR产物灰度扫描结果，其中(a)～(e)分别代表1/5～5/5区段)。

图7所示为不同区段的6kb质控片段引物对PCR产物灰度扫描结果，其中(a)～(e)分别代表1/5～5/5区段)。

图8所示为不同区段的7kb质控片段引物对PCR产物灰度扫描结果，其中(a)～(e)分别代表1/5～5/5区段)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

双48孔快速PCR仪(美国Bio-Rad伯乐)；

核酸水平电泳槽(北京六一公司)；

全自动免染凝胶成像系统(美国Bio-Rad伯乐)；

PCR扩增LA Taq、DNA Marker等(宝日医生物技术(北京)有限公司)；

引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

实施例1

本发明的BCG-CpG-DNA佐剂质控方法中，通过根据已完成的卡介菌全基因组DNA序列信息，利用prime 5.0软件设计引物对，再筛选出适宜的热循环反应体系，采用长链PCR扩增技术，在一定反应条件下进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测目的质控分子量大小，电泳图谱经Image Lab 3.0扫描，比对其他区段泳道与参考条带相对灰度比值，比较分析各区段同一分子量质控片段灰度比值。

具体实施方案如下：

1.引物对设计：根据卡介菌全基因组序列，从5’到3’端，平均分成五个区段，再分别根据各区段序列设计引物对，扩增每个区段中的目的质控片段大小分别约为3kb、5kb、6kb和7kb。具体引物如下表：

表1：引物序列信息

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/>

2.PCR扩增模板的制备：BCG-CpG-DNA佐剂为1mg/ml，取佐剂进行100倍稀释，即得PCR扩增模板。使用时按50μl反应体积加入5μl作为DNA模板。

3.PCR扩增获取各分子量质控片段：以上稀释后的BCG-CpG-DNA佐剂为模板，组成如下反应体系1×LA PCR缓冲液(Mg

4.PCR扩增程序为：94℃预变性1min，10个循环(98℃20s，68℃4min)，15个循环(98℃20s，68℃(4～8)min+15s/循环)，72℃10min；4℃保温。

5.琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物及灰度扫描

取产物3μl经1.0％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，拍照保存。经Image Lab 3.0对琼脂糖凝胶电泳进行灰度扫描。

具体的：

以7批次的BCG-CpG-DNA佐剂为模板，1/5-5/5区段的3kb质控分子量片段上下游引物，进行长链PCR，扩增程序见4.PCR扩增程序，PCR结束后取5μl PCR产物加1μl 6×LoadingBuffer均匀混合后上样，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1(a)-图1(e)：

其它质控片段1/5-5/5区段的5、6和7kb琼脂糖凝胶电泳检测结果分别见图2-4。

以1/5区段中的3kb质控片段为例，PCR扩增图谱经Image Lab 3.0软件对进行灰度扫描，以泳道4为参考条带(记为灰度值为1.00)。其他泳道1～3，5～7分别是已不同批次佐剂为模板的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。对应的灰度值分别为0.90、1.11、1.03、0.99、1.16和0.95(参见图5(a))。

灰度扫描结果：以其中1批为参考条带，3kb质控片段1/5区段引物对以其他批次CpG佐剂为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳与参考条带的灰度比值在0.90～1.16之间，即与参考条带灰度比值基本一致。可实现BCG-CpG-DNA佐剂核酸不同片段均一性检测质控。

其它质控片段中质控片段的相对灰度扫描结果具体如图5-8和表2：

表2：不同区段的不同质控片段的灰度扫描结果

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以上结果说明，采用卡介菌基因组DNA的片段，尤其是3.0kb、5.0kb、6.0kb在佐剂中比较均一的表达，其相对值最高值和最低值差值不超过1.0，可以很好评估BCG-CpG-DNA佐剂的稳定性，或者核酸均一性，使得其成为质控片段具有可行性。而7kb由于DNA片段过大，在经机械破碎后的BCG-CpG-DNA佐剂中不是均一的存在，不同批次之间的差异比较大，最高值和最低值差值大于1.0，并不适合作为质控指标。

本发明通过不同质控分子量片段来评价不同批次BCG-CpG-DNA佐剂分布的均一性，预期的结果为以不同批次佐剂为模板，各区段不同质控片段均能扩增出特异性目的条带，且以其中一批为参考条带，其他批次目的条带的灰度扫描相对定量比值在一定范围内，结果提示，采用卡介菌基因组DNA片段本身作为质控片段具有可行性。不同批次佐剂核酸分子量分布均一性良好。

同时，本发明的方法操作方便，数据可视，评估便捷。

该实施方案仅为常规PCR扩增，整个试验周期时长约为5h，而前期采用甲基化的操作，从样品的处理至上高效液相色谱分离操作，整个周期耗时约24h，本发明的方法提高了质控的效率，降低了成本。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。