一种检测血清visfatin的荧光方法

技术领域

本专利涉及一种基于非线性杂交链式反应的荧光检测方法，特别涉及一种检测血清visfatin浓度的荧光检测方法。

背景技术

代谢性疾病是指由于物质合成或分解代谢异常而引起的一类疾病，包括糖尿病、高血压、肥胖、血脂异常和心脑血管疾病。由于营养结构的变化，代谢性疾病的发病率呈流行趋势。visfatin是新近发现的一种多功能蛋白质细胞因子，主要由内脏脂肪组织分泌。研究表明，内脂素不仅与糖尿病密切相关，而且在高脂血症、心血管疾病等的发生发展中也起着重要作用。因此，血清内脂素可能为代谢性疾病的治疗提供新的靶点，有望成为新的生物标志物。

另一方面，杂交链式反应由于具有无酶、恒温、扩增效率高等优点，在医学检测分析领域具有重要意义，然而，传统的杂交链式反应只能提供线性的组装过程，其分析灵敏度还需要进一步提高。而非线性杂交链式反应在开发基于多种检测方法的生物传感器方面有诸多优势，其具有简单、灵敏度高、成本低、特异性好等优点。

当前，visfatin的检测主要依赖于酶联免疫法。该方法虽然具有应用范围广、选择性好等优点，但其主要利用抗体抗原间的相互作用，然而，由于大多数抗体是蛋白质，所以不够稳定，检测起来有一定难度。同时该方法受多种因素的干扰，容易产生假阳性。因此，需要一种具有高特异性、稳定性和抗干扰物质存在的新方法。

发明内容

1.一种检测血清visfatin浓度的荧光检测方法具体包括以下步骤：

(1)探针制备首先进行非线性杂交链式反应系统的DNA序列的设计和优化，将visfatin适体和各条核酸链从-20℃转移至室温，简单离心；将visfatin适体和触发DNA的混合物加热一段时间，缓慢冷却至室温，得到杂交的visfatin适体和触发DNA双链；将一定浓度的A链和B链的混合物分别加热一段时间，随后缓慢冷却至室温，分别制得底物1和底物2。

(2)磁珠与底物的结合将一定体积的底物1和底物2(底物先经高温变性一段时间，然后缓慢冷却至室温)分别加入已活化的磁珠悬液中，去除上清，在结合缓冲液中室温振摇孵化一段时间，形成了固定在磁珠表面的底物1、底物2以及各自多余的B链，磁分离磁珠悬液，移除上清，去除未结合的游离底物和未结合的B链，然后将功能化磁珠加入一定体积PBS清洗，而后磁分离，重复清洗三次，每次室温孵育一段时间，4℃保存，用于后续实验。

(3)功能化磁珠的封闭功能化磁珠用一定体积封闭缓冲液重悬，室温下轻微振荡封闭一段时间，封闭磁珠表面未结合的活性位点，封闭完成后，磁分离磁珠悬液，移除上清后加入一定体积PBS，重复清洗三次，每次几分钟，然后加入结合缓冲液重悬磁珠，4℃保存，用于后续实验。

(4)退火后的底物1和底物2分别与羧基化的磁珠结合、封闭后重悬，分别加入一定浓度助剂1、助剂2，即形成了溶液1、溶液2，将适量体积的溶液1和溶液2新鲜混合，加入少量适体和触发DNA双链，然后分别加入少量不同浓度的visfatin，一定温度下孵育一定时间，触发DNA从适体和触发DNA双链中释放出来并引发一系列的自组装行为形成树状DNA大分子，随后磁分离磁珠悬液，分别检测上清中的荧光强度，选择最佳孵育时间和温度后，整个反应体系分别加入不同浓度visfatin反应，获得了不同强度的荧光检测信号。

所述步骤(2)中检测血清visfatin浓度的荧光检测方法，所用的底物的量为10μL-20μL。

所述步骤(2)中检测血清visfatin浓度的荧光检测方法，所用的结合缓冲液浓度为5mM-10mMMgCl

所述步骤(2)中检测血清visfatin浓度的荧光检测方法，所用的底物和磁珠的振摇孵化时间为30min-12h。

所述步骤(3)中检测血清visfatin浓度的荧光检测方法，所用的封闭缓冲液浓度为PBS+5mM-10mMMgCl

所述步骤(3)中检测血清visfatin浓度的荧光检测方法，所用的封闭时间为3h-6h。

所述步骤(4)中检测血清visfatin浓度的荧光检测方法，所用的反应体系孵育时间为20min-100min。

所述步骤(4)中检测血清visfatin浓度的荧光检测方法，所用的反应体系孵育温度为25℃-50℃。

制备好的荧光树枝状纳米结构储存在4度冰箱里。

本发明对此检测方案的重复性进行了验证，选取2个加入了不同visfatin浓度的反应体系，每个反应体系重复测定三次，计算方差和平均值。结果如表1。

表1非线性杂交链式反应荧光体系的重复性实验数据

表1表明，该反应体系具有良好的重复性，基本满足临床检测的需求。

本发明的优势是：①该检测方案操作简单、快速，无需使用繁杂的仪器设备，也无需蛋白酶等复杂的标记，在稍高的温度下即可自动发生反应，可达到较为理想的检测效果。②该发明检测成本低廉，无需价格昂贵且不易保存的抗体即可完成，仅需要纯化合成优化的碱基序列和适体序列。适体粉末相对于抗体，价格低廉，保存方便，同时具有和靶标结合的高特异性。③磁珠和底物的结合，在加入检测靶标后，有效将反应体系的荧光终产物保留在上清液，而无靶标加入的情况下，上清液中不会检测到荧光，所以这一设计大大降低了反应的非特异性信号。④该体系反应的灵敏度很高，在极少样品加入的情况下便可检测到较强的荧光信号。⑤临床标本成分复杂，影响因素多，此检测方案对临床标本的检测响应迅速且检测结果稳定，进一步表明此方法具有高灵敏性、高稳定性、高特异性，在生物医学检测领域有广阔的应用前景。

附图说明

图1是不同孵育时间下底物和磁珠结合后响应吸光度值的变化曲线

图2是不同反应时间下反应体系的上清液中响应荧光强度的变化曲线

图3是响应荧光值随反应温度的变化曲线

图4是响应荧光强度随visfatin浓度的变化曲线

具体实施例1

制备检测visfatin的荧光生物传感器，按以下步骤操作：

(1)探针制备首先进行非线性杂交链式反应系统的DNA序列的设计和优化，将visfatin适体和各条核酸链从-20℃转移至室温，简单离心；将visfatin适体和触发DNA的混合物90℃加热3min，缓慢冷却至室温，得到杂交的visfatin适体和触发DNA双链；将A链(1.5μM)和B链(2μM)的混合物分别90℃加热3min，随后缓慢冷却至室温，分别制得底物1和底物2。

(2)磁珠与底物的结合将10μL的底物1和底物2(底物先经高温变性一段时间，然后缓慢冷却至室温)分别加入已活化的磁珠悬液中，去除上清，在结合缓冲液中室温振摇孵化30min、1h、3h，形成了固定在磁珠表面的底物1、底物2以及各自多余的B链，磁分离磁珠悬液，移除上清，去除未结合的游离底物和未结合的B链，然后将功能化磁珠加入100μLPBS清洗，而后磁分离，重复清洗三次，每次室温孵育3min，4℃保存，用于后续实验。

(3)功能化磁珠的封闭功能化磁珠用100μL封闭缓冲液重悬，室温下轻微振荡封闭3h，封闭磁珠表面未结合的活性位点，封闭完成后，磁分离磁珠悬液，移除上清后加入一定体积PBS，重复清洗三次，每次3min，然后加入结合缓冲液重悬磁珠，4℃保存，用于后续实验。

(4)退火后的底物1和底物2分别与羧基化的磁珠结合、封闭后重悬，分别加入2.5μM助剂1、助剂2，形成溶液1、溶液2，将25μL的溶液1和50μL溶液2新鲜混合，加入10μL适体和触发DNA双链，然后加入10μLvisfatin，45℃下孵育1h，触发DNA从适体和触发DNA双链中释放出来并引发一系列的自组装行为形成树状DNA大分子，随后磁分离磁珠悬液，整个反应体系加入100ng/mLvisfatin反应，分别检测上清中的荧光强度，获得了不同强度的荧光检测信号。

由附图1明显看出，横坐标单位(nm)；纵坐标单位(1)，孵育时间从下到上分别为：30min、1h、3h,随着底物和磁珠的孵育时间延长，260nm处的吸光逐渐增加。

具体实施例2

制备检测visfatin的荧光生物传感器，按以下步骤操作：

(1)探针制备首先进行非线性杂交链式反应系统的DNA序列的设计和优化，将visfatin适体和各条核酸链从-20℃转移至室温，简单离心；将visfatin适体和触发DNA的混合物90℃加热3min，缓慢冷却至室温，得到杂交的visfatin适体和触发DNA双链；将A链(1.5μM)和B链(2μM)的混合物分别90℃加热3min，随后缓慢冷却至室温，分别制得底物1和底物2。

(2)磁珠与底物的结合将10μL的底物1和底物2(底物先经高温变性一段时间，然后缓慢冷却至室温)分别加入已活化的磁珠悬液中，去除上清，在结合缓冲液中室温振摇孵化6h，形成了固定在磁珠表面的底物1、底物2以及各自多余的B链，磁分离磁珠悬液，移除上清，去除未结合的游离底物和未结合的B链，然后将功能化磁珠加入100μLPBS清洗，而后磁分离，重复清洗三次，每次室温孵育3min，4℃保存，用于后续实验。

(3)功能化磁珠的封闭功能化磁珠用100μL封闭缓冲液重悬，室温下轻微振荡封闭3h，封闭磁珠表面未结合的活性位点，封闭完成后，磁分离磁珠悬液，移除上清后加入一定体积PBS，重复清洗三次，每次3min，然后加入结合缓冲液重悬磁珠，4℃保存，用于后续实验。

(4)退火后的底物1和底物2分别与羧基化的磁珠结合、封闭后重悬，分别加入2.5μM助剂1、助剂2，形成溶液1、溶液2，将25μL的溶液1和50μL溶液2新鲜混合，加入10μL适体和触发DNA双链，然后加入10μLvisfatin，45℃下孵育40min、60min、80min，触发DNA从适体和触发DNA双链中释放出来并引发一系列的自组装行为形成树状DNA大分子，随后磁分离磁珠悬液，整个反应体系加入100ng/mLvisfatin反应，分别检测上清中的荧光强度，获得了不同强度的荧光检测信号。

由附图2可直观地看出，横坐标单位(a.u.)；纵坐标单位(分钟)，体系反应时间由左到右分别为：40min、60min、80min，反应时间在40min到80min范围内有较好的响应荧光值，80min对应的荧光值与60min时的荧光值没有明显差异，考虑到节约检测时间，提高效率，所以通常取1h作为反应时间效果较为理想。

具体实施例3

制备检测visfatin的荧光生物传感器，按以下步骤操作：

(1)探针制备首先进行非线性杂交链式反应系统的DNA序列的设计和优化，将visfatin适体和各条核酸链从-20℃转移至室温，简单离心；将visfatin适体和触发DNA的混合物90℃加热3min，缓慢冷却至室温，得到杂交的visfatin适体和触发DNA双链；将A链(1.5μM)和B链(2μM)的混合物分别90℃加热3min，随后缓慢冷却至室温，分别制得底物1和底物2。

(2)磁珠与底物的结合将10μL的底物1和底物2(底物先经高温变性一段时间，然后缓慢冷却至室温)分别加入已活化的磁珠悬液中，去除上清，在结合缓冲液中室温振摇孵化6h，形成了固定在磁珠表面的底物1、底物2以及各自多余的B链，磁分离磁珠悬液，移除上清，去除未结合的游离底物和未结合的B链，然后将功能化磁珠加入100μLPBS清洗，而后磁分离，重复清洗三次，每次室温孵育3min，4℃保存，用于后续实验。

(3)功能化磁珠的封闭功能化磁珠用100μL封闭缓冲液重悬，室温下轻微振荡封闭3h，封闭磁珠表面未结合的活性位点，封闭完成后，磁分离磁珠悬液，移除上清后加入一定体积PBS，重复清洗三次，每次3min，然后加入结合缓冲液重悬磁珠，4℃保存，用于后续实验。

(4)退火后的底物1和底物2分别与羧基化的磁珠结合、封闭后重悬，分别加入2.5μM助剂1、助剂2，形成溶液1、溶液2，将25μL的溶液1和50μL溶液2新鲜混合，加入10μL适体和触发DNA双链，然后加入10μLvisfatin，分别在37℃、45℃、50℃下孵育60min，触发DNA从适体和触发DNA双链中释放出来并引发一系列的自组装行为形成树状DNA大分子，随后磁分离磁珠悬液，整个反应体系加入100ng/mLvisfatin反应，分别检测上清中的荧光强度，获得了不同强度的荧光检测信号。

体系的反应温度对自组装反应的影响很大，温度过低，可能不会触发核酸链的自发杂交过程；而温度过高则会影响靶标蛋白的活性，进一步影响与适体的结合效率，随后的靶DNA序列的释放也会受到影响，从而改变荧光信号。通过附图4可以看出，横坐标单位(℃)；纵坐标单位(a.u.)，从左到右的反应温度分别为37℃、45℃、50℃，反应体系的最佳杂交温度为45℃，此时的荧光信号强度达到最高。

具体实施例4

制备检测visfatin的荧光生物传感器，按以下步骤操作：

(1)探针制备首先进行非线性杂交链式反应系统的DNA序列的设计和优化，将visfatin适体和各条核酸链从-20℃转移至室温，简单离心；将visfatin适体和触发DNA的混合物90℃加热3min，缓慢冷却至室温，得到杂交的visfatin适体和触发DNA双链；将A链(1.5μM)和B链(2μM)的混合物分别90℃加热3min，随后缓慢冷却至室温，分别制得底物1和底物2。

(2)磁珠与底物的结合将10μL的底物1和底物2(底物先经高温变性一段时间，然后缓慢冷却至室温)分别加入已活化的磁珠悬液中，去除上清，在结合缓冲液中室温振摇孵化6h，形成了固定在磁珠表面的底物1、底物2以及各自多余的B链，磁分离磁珠悬液，移除上清，去除未结合的游离底物和未结合的B链，然后将功能化磁珠加入100μLPBS清洗，而后磁分离，重复清洗三次，每次室温孵育3min，4℃保存，用于后续实验。

(3)功能化磁珠的封闭功能化磁珠用100μL封闭缓冲液重悬，室温下轻微振荡封闭3h，封闭磁珠表面未结合的活性位点，封闭完成后，磁分离磁珠悬液，移除上清后加入一定体积PBS，重复清洗三次，每次3min，然后加入结合缓冲液重悬磁珠，4℃保存，用于后续实验。

(4)退火后的底物1和底物2分别与羧基化的磁珠结合、封闭后重悬，分别加入2.5μM助剂1、助剂2，形成溶液1、溶液2，将25μL的溶液1和50μL溶液2新鲜混合，加入10μL适体和触发DNA双链，然后加入10μLvisfatin，45℃下孵育60min，触发DNA从适体和触发DNA双链中释放出来并引发一系列的自组装行为形成树状DNA大分子，随后磁分离磁珠悬液，整个反应体系加入1ng/mLvisfatin反应，分别检测上清中的荧光强度，获得了不同强度的荧光检测信号。

由附图4可以看出，横坐标单位(nm)；纵坐标单位(a.u.)，低浓度的visfatin能够产生较强的荧光强度，这也表示所研究的检测方法具有高灵敏度，能够满足临床检测需求。