一种癌症相关蛋白及其抗体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种癌症相关蛋白及其抗体和应用。

背景技术

肝细胞癌相关蛋白1(hepatocellular carcinoma related protein 1,HCRP1)被认为是一种抑癌基因。HCRP1是ESCRT-I复合体中的一个重要组成亚基。人体内多种受体是在ESCRT-I复合体的结合下，并转运至MVBs，最后在溶酶体参与下进行降解。Xu等通过PCR技术提出并命名了HCRP1，并证明了它是一种抑癌基因。Bache等研究证实HCRP1是人ESCRT-I复合体中的一个亚基，其功能对于表皮生长因子受体(EGFR)的降解至关重要。EGFR为跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)，在调控多种细胞过程中起着重要作用，尤其在肿瘤细胞的生长和侵袭中起关键作用。多项研究显示，HCRP1在肝癌、卵巢癌、乳腺癌以及泌尿系肿瘤(肾癌、前列腺癌)等多种恶性肿瘤中均有低表达或缺失表达，而在正常组织或细胞中却明显高表达。但是，目前，缺少针对HCRP1的诊断试剂，尤其是免疫学诊断试剂。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种HCRP1及其单克隆抗体和制备方法；本发明的目的之二，提供了一种使用本发明制备的单克隆抗体和HCRP1制备用于HCRP1检测的试剂盒。

一方面，本发明提供了一种检测癌症相关蛋白表达水平的试剂盒，所述蛋白为HCRP1蛋白，所述的试剂盒包括有效量的HCRP1蛋白、两株有效量的抗HCRP1蛋白单克隆抗体和配套的检测试剂，所述两株抗HCRP1蛋白单克隆抗体为单克隆抗体1和单克隆抗体2，所述的编码单克隆抗体1的重链可变区和轻链可变区序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述的编码单克隆抗体2的重链可变区和轻链可变区序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选地，本发明所述的有效量的HCRP1蛋白为使用HCRP1蛋白配制的校准品，所述校准品浓度分别为3000pg/ml、500pg/ml、100pg/ml、25pg/ml、5pg/ml、2.5pg/ml、0pg/ml。

优选地，本发明所述单克隆抗体1识别的抗原表位的氨基酸序列为MHSDLGKIIQSLLDEFWKNPPVLAP。

优选地，本发明所述单克隆抗体2识别的抗原表位的氨基酸序列为IEELARKNLLLEPSLEAKRQTVLDK。

优选地，本发明所述的单克隆抗体1偶联磁微粒，所述的偶联磁微粒的单克隆抗体1使用时的浓度为0.5mg/ml。

优选地，本发明所述的单克隆抗体2标记吖啶酯，所述标记吖啶酯的单克隆抗体2使用时的稀释倍数为500倍。

优选地，本发明所述的配套的检测试剂包括洗涤液和吖啶酯发光液。

优选地，本发明所述的洗涤液为TBST缓冲液。

再一方面，本发明还提供了一种所述的抗HCRP1蛋白单克隆抗体1和抗HCRP1蛋白单克隆抗体2在制备HCRP1蛋白检测试剂中的应用

本发明筛选的HCRP1蛋白的3条多肽(用于制备单克隆抗体)，具有较好的抗原性，为HCRP1蛋白的研究提供了重要参考。

本发明在HCRP1蛋白抗原多肽2、抗原多肽6和抗原多肽7的基础上筛选了3株特异性的单克隆抗体，为建立HCRP1蛋白的检测提供了良好的工具。其中单克隆抗体1和单克隆抗体2均具有良好的特异性和敏感性以及配对检测的适配性，适用于HCRP1蛋白的检测。

本发明在研究的HCRP1蛋白和单克隆抗体的基础上，开发了用于HCRP1蛋白检测的试剂盒。本发明的试剂盒具有灵敏度高、线性范围宽、检测速度快、检测准确度高的优点。

附图说明

图1HCRP1蛋白蛋白无序区分析结果，分值越高代表该位置为无序区的概率越大，0.5作为是否为无序区的分界线。

图2三株单克隆抗体SDS-PAGE检测图，其中1是单克隆抗体2，2是单克隆抗体2，3是单克隆抗体3。

图3本试剂盒标准曲线。

图4本试剂盒与ELISA检测结果比较。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：抗HCRP1单克隆抗体的制备

1.1抗原多肽的设计

首先对HCRP1蛋白的氨基酸序列进行分析。选择NP_001350100.1作为本研究的目的蛋白，对其无序区进行分析。结果显示(图1)，其中aa70～aa100、aa120～aa160、aa210～aa260的无序区的概率比较大，选择剩余的序列设计抗原多肽，具体如表1所示。

表1抗原多肽设计结果

1.2单克隆抗体的制备

(1)动物免疫将上述制备的抗原多肽与BSA偶联后作为抗原，分别对6周龄的BALB/c雌性小鼠进行免疫。

1)初次免疫，抗原均为50μg/只，加弗氏完全佐剂皮下多点注射，1ml/只。

2)间隔2周后进行第二次免疫，剂量途径与初次免疫一致，但佐剂更换为弗氏不完全佐剂。

3)间隔1周后进行第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，如果效价较高，3～5天后取脾进行细胞融合。

(2)细胞融合

1)饲养细胞的制备在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。

2)小鼠腹腔巨噬细胞的准备：用6-10周龄的BALB/c小鼠。拉颈处死，浸泡于75％的酒精，消毒3min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用吸管注入6ml培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。放入10ml离心管，1200rpm离心5min。用20％小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1*10

3)骨髓瘤细胞的准备于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养。融合当天，将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管内。1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。加入30ml不完全培养基，离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％台酚蓝染液作活细胞计数后备用。

4)脾细胞的准备取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠1×10

5)细胞融合将1×10

6)杂交瘤细胞的选择HCRP1蛋白(购自上海康朗生物科技有限公司)用包被液稀释至1μg/ml。以100μl/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜。弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，拍干。每孔加100μl封闭液37℃封闭1小时；洗涤液洗3次；每孔加100μl待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1小时；洗涤，拍干。加5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μl，37℃孵育0.5小时，洗涤，拍干。加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100μl，37℃10分钟。以2M H

7)杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)制备小鼠脾细胞为饲养细胞。制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度。按每毫升加入5×10

(3)单克隆抗体的生产及纯化

1)单克隆抗体的生产成年BALB/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5ml。7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×10

2)单克隆抗体的纯化(辛酸-硫酸铵沉淀法)腹水4℃12000rpm离心15min，去除杂质。取1份腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，按每毫升稀释腹水加33μl辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，室温混合30min，4℃静置2小时，取出12000离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤，于50倍体积的0.01MPH7.4 PBS中4℃透析6h，在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。4℃静置1h以上，10000g离心30分钟，弃上清。沉淀溶于适量PBS中，于50-100倍体积的PBS中透析过夜。取少量透析后样品适当稀释后，分装后于-70℃以下保存备用。

按照上述的方法，将8个抗原多肽分别免疫后，经过检测分析，共筛选到3株杂交瘤细胞(命名为杂交瘤细胞1～3)和3株单克隆抗体(命名为单克隆抗体1～3)，其对应的抗原多肽如表2所示。

表2单克隆抗体制备结果

实施例2：抗HCRP1单克隆抗体检验

2.1纯度检验：取20μl样品，经过5*loading buffer处理及煮沸后制备样品，使用SDS-PAGE进行纯度检验。结果显示(图2)，三株单克隆抗体的SDS-PAGE纯度均大于90％。

2.2浓度检验：取20μl样品，按照BCA试剂盒说明书对其浓度进行检测，并根据纯度检测的结果，计算单克隆抗体的实际浓度(BCA浓度*纯度)。经过检测，单克隆抗体1～3的浓度分别为1.36mg/ml、1.52mg/ml和1.45mg/ml。

2.3单克隆抗体的配对检验：使用双抗体夹心法进行配对检验。

(1)使用商品化的HRP标记试剂盒对3株单克隆抗体进行HRP标记，并使用直接ELISA方法(使用HCRP1蛋白(购自上海康朗生物科技有限公司)包被酶标板，用包被液稀释至1μg/ml，以100μl/孔加入酶标板孔中；然后将HRP标记的单克隆抗体进行梯度稀释，一般稀释倍数为5000、10000、20000等，将其加到酶标板中，0.1ml/孔，37℃孵育30min后加底物检测OD450nm值，以OD450nm值≥1.1为判定标准)确定HRP标记的单克隆抗体的稀释倍数，通过检测，3株单克隆抗体的稀释倍数均为20000倍。

(2)使用3株单克隆抗体分别包被酶标板(100ng/孔/0.1ml)，使用HCRP1蛋白作为样品(稀释至10ng/ml后使用)，0.1ml/孔，37℃孵育1h后，分别交叉加入(1)中HRP标记的单克隆抗体，其稀释倍数均为20000倍，0.1ml/孔，37℃孵育30min后加底物检测OD450nm值，比较OD450nm值的高低来判定配对效果(OD450nm值越高，说明配对效果越好)。结果见表3所示，确定最终的配对抗体为单克隆抗体1和单克隆抗体2，其中单克隆抗体1作为包被抗体，单克隆抗体2作为检测抗体。

表3单抗抗体配对检测结果(OD450nm值)

2.4序列分析使用常规的实验方法或委托第三方公司对制备的两株单克隆抗体进行重链可变区和轻链可变区的分析和测定。结果显示，经过检测和分析，编码单克隆抗体1的重链可变区和轻链可变区序列分别如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示；编码单克隆抗体2的重链可变区和轻链可变区序列分别如SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示。

实施例3：HCRP1蛋白检测方法的建立和试剂盒的制备

在实施例1～2制备的单克隆抗体和HCRP1蛋白的基础上，开发了一种HCRP1蛋白检测的试剂盒。

3.1校准品配制

使用HCRP1蛋白(购自上海康朗生物科技有限公司)为母液，使用稀释液(含1％BSA的TBST缓冲液)将其稀释为7个梯度，分别为3000pg/ml、500pg/ml、100pg/ml、25pg/ml、5pg/ml、2.5pg/ml、0pg/ml。

3.2磁微粒偶联单克隆抗体1

将直径为0.1微米的四氧化三铁微球用戊二醛进行活化，室温混匀4小时后，用TBST缓冲液清洗三次，并用该溶液进行重悬，浓度为100mg/ml；然后每毫升悬液中加入单克隆抗体1 0.1mg，于37℃混匀温育3～8小时；用等体积的含2％BSA的TBST缓冲液于37℃封闭2小时；最后，用含1％BSA TBST缓冲液清洗三次，并用含1％BSA TBST缓冲液配制一定浓度的工作液(一般按照单克隆抗体的浓度将其稀释至0.5mg/ml)，置于2～8℃保存备用。

3.3吖啶酯标记单克隆抗体2

取10μl稀释吖啶酯母液(2.5mg/ml)，加入90μl无水DMSO稀释10倍，配成吖啶酯工作液(0.25mg/ml)。使用0.2M NaHCO

3.4试剂盒检测

检测试剂盒制备：将3.2偶联磁微粒的单克隆抗体2稀释至0.5mg/ml，标记为试剂R1；将3.3标记吖啶酯的单克隆抗体2稀释500倍，标记为试剂R2；其中稀释液均为含1％BSATBST缓冲液。

检测步骤：1)10μl样本+50μl试剂R1+50μl试剂R2+90μl洗涤液；2)37℃混合孵育10min(37℃1000rpm)；3)洗涤液清洗3次，每次500μl；4)加入200μl吖啶酯发光液，化学发光仪立即检测RLU值。其中洗涤液为TBST缓冲液，样本可以为血清、全血、组织液和细胞培养液等。

实施例4：试剂盒性能评价

4.1试剂盒线性范围：使用制备的试剂盒按照3.4的试验步骤对3.1制备的校准品进行检测。结果显示(图3和表4)，该试剂盒在2.5pg/ml～3000pg/ml浓度范围内具有良好线性和均匀性，说明本试剂盒的线性范围宽。

表4定标结果

4.2试剂盒灵敏度：对S0进行20次重复测试，取S0测定的平均值加上3倍的标准偏差，即为本试剂盒的检测限。经过检测和计算，本试剂盒的检测限为0.5pg/ml，说明本试剂盒的灵敏度较高。

4.3样本检测结果比较：选择市场购买的ELISA检测试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)和本发明的试剂盒对样品进行检测比较。结果显示(图4和表5)，本试剂盒与ELISA试剂盒检测结果的符合性很高，R

表5样品检测结果比较

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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。