基于ERA技术的对虾桃拉综合征病毒快速检测方法及引物与探针组合

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于ERA技术的对虾桃拉综合征病毒快速检测方法及引物与探针组合。

背景技术

桃拉综合征俗称“红尾病”，是一种严重传染性对虾疾病，急性期以虾体变红、软壳，过渡期以角质上皮不规则黑化为特征。2008年《中华人民共和国农业部公告》将其列为二类动物疫病。OIE将其列为必须申报的疾病。其致病病原体为桃拉综合征病毒(Taurasyndrome virus,TSV)，属于单链RNA病毒，暂归于小RNA病毒科，可在细胞质中增殖，主要感染14～40日龄的仔虾，部分稚虾或成虾也易感染。对虾感染病毒后死亡率高达60％～95％，与对虾白斑综合征病毒(WSSV)、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)一起被FAO称为“影响世界对虾养殖的三大病害”。TSV主要感染南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、褐对虾(Penaeus aztecus)、蓝脚细对虾(LitopenaeusStylirostris)，其中以南美白对虾最为敏感，因为该病毒可在宿主体内迅速增殖并向外释放。近年来，由于我国成功引进南美白对虾，其产量占全国总对虾产量的50％以上，若该病在我国流行并蔓延，将对我国的对虾养殖业造成沉重的打击。据报道，TSV已在我国广东、广西、海南、福建等省沿海海水对虾养殖密集区有发生。由于目前尚无治疗TSV的有效方法，只能通过即时检测和综合防控，才能避免病原体的流行与扩散。

目前，国内外已有多种方法用于TSV的检测，如组织切片病理观察、普通PCR、qRT-PCR、LAMP、液相芯片技术等，但这些方法操作繁琐、耗时长、检测仪器昂贵，在养殖场应用中存在很多困难，不适合现场快速筛查。因此，需开发一种快速简便的检测方法，对TSV的防控具有重要意义。本发明建立了ERA恒温荧光检测TSV的方法，快速方便，准确可靠，可满足养殖场现场检测需求。

酶促重组等温扩增(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)是一种恒温扩增技术，在含模板的反应体系内添加3种蛋白(DNA重组酶、单链结合蛋白和具有聚合链置换功能的DNA聚合酶)，并加入特异性引物和探针，可在恒温状态下一定时间内完成核酸扩增。与其他恒温扩增技术相比，ERA可在25～45℃条件下进行扩增反应，不需要热变性，对硬件设备要求低，并且核酸扩增速度较快，可在20min内获得目的扩增产物，能够在现场检测快速出具报告，极大缩短了检测时间。

发明内容

本发明为解决现有技术中出现的问题，提供了一种对虾桃拉综合征病毒恒温荧光检测方法及引物与探针组合，可以明显缩短对虾TSV的检测时间；同时操作简单，灵敏度高、特异性强，满足快速检测的需求，为对虾养殖中TSV的监测提供了一种有效手段。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明目的之一是，提供一种对虾桃拉综合征病毒ERA恒温荧光检测专用引物与探针组合，包括：对虾桃拉综合征病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，所述对虾桃拉综合征病毒正反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中，探针的33位碱基T标记荧光基团(6FAM-dT)，34位碱基G由四氢呋喃连接子(THF)替换，35位碱基T标记荧光淬灭基团(BHQ1-dT)，3'末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(C3-SPACER)。在ERA体系中引入带荧光标记的探针，配合相应扩增引物，可以有效提高ERA检测的特异性。

另一方面，本发明还进一步提供一种基于ERA技术的对虾桃拉综合征病毒快速检测方法，其步骤如下：

1)提取待测样本的RNA，并进行反转录获得cDNA；

2)以该cDNA为模板，采用上述引物与探针进行ERA扩增，检测扩增体系中荧光信号的变化；

3)结果判定。

优选的，样本若为成虾则取对虾鳃组织、血淋巴或虾肝胰腺组织，若为仔虾则取甲壳下组织。

优选的，ERA扩增的温度为36～42℃。

优选的，ERA扩增的温度为42℃，反应时间为20min，共40个循环。

优选的，ERA反应体系中引物浓度为500nM，探针浓度为120nM。

优选的，步骤3)结果判定为：

根据最终荧光扩增曲线分析待测样本，荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾桃拉综合征病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾桃拉综合征病毒阴性结果。

与现有技术相比，本发明的有益成果在于：

操作简便。本发明涉及的检测方法可摆脱对大型仪器及专业检测实验室的依赖，无需专业操作人员，可用于实地检测，有实际的使用需求。

高效快速。本发明涉及的检测方法整个过程可在半小时内完成，提高对虾桃拉综合征病毒检测的效率。

高特异及灵敏性。本发明涉及的检测方法对对虾常见病原基因组DNA，包括桃拉综合征病毒(TSV)、肝肠胞虫(EHP)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原菌、传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、白斑综合症病毒(WSSV)及健康对虾样品，均不发生非特异性扩增；检测灵敏性为10

成本低。本发明所使用的设备结构简单，检测成本低，适合水产类对成本敏感的客户，适合推广使用。

附图说明

图1为针对TSV的ERA扩增条件温度优化结果。其中，温度梯度为：30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃。

图2为针对TSV的ERA反应体系引物浓度优化结果。其中，反应体系中引物加量分别为1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL。

图3为针对TSV的ERA反应体系探针浓度优化结果。其中，反应体系中探针加量分别为0.6μL、0.8μL、1.0μL。

图4为本发明的灵敏性检测结果。其中，模板浓度分别为10

图5为本发明的特异性检测结果。其中，包含桃拉综合征病毒(TSV)、对虾肝肠胞虫(EHP)、白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原菌和健康对虾的DNA；NTC为阴性对照。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的ERA荧光型核酸扩增试剂盒是苏州先达基因科技有限公司的产品，产品货号为KS103。

实施例1：引物探针设计

本发明以对虾桃拉综合征病毒衣壳蛋白2基因为检测靶基因(其Genebank数据库中登录号为AY826052)，设计了一组引物和探针，引物和探针的序列如表1所示。上述引物和探针均由生工生物工程(上海)股份公司合成。

表1引物和探针序列

实施例2：ERA扩增条件温度优化

为确定实施例1中引物探针组合在ERA扩增反应中的最适温度，使用ERA荧光型核酸扩增试剂盒进行反应试验，操作如下。

操作步骤：该反应体系为50μL，其中包含各2.1μL(10μM)的正、反向引物，0.6μL(10μM)的探针，20μL的溶解剂，2μL的阳性标准品，加无菌水至48μL。混匀后，将48μL预混液转移至每管冻干粉中，振荡混匀并短暂离心，使冻干粉充分溶解。对于每份样本，在反应管盖上加上2μL激活剂，通过短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂振荡混匀并再次快速离心。将反应管迅速放入实时荧光定量PCR仪中，分别在30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃条件下进行扩增，每30秒采集一次FAM通道荧光值。

该体系中所涉及的阳性标准品为包含TSV检测靶基因的重组质粒，将质粒进行10倍梯度稀释，选择浓度为10

温度优化结果如图1所示。根据比较Ct值大小及荧光强度高低，来确定扩增反应中的最适温度。结果表明，ERA反应体系在36～42℃能进行较好扩增，推荐温度为42℃。

实施例3：ERA反应体系中引物探针浓度优化

为确定ERA扩增反应中引物探针最适浓度，我们测试了不同引物浓度(1.5μL，2.0μL，2.5μL，3.0μL)和探针浓度(0.6μL，0.8μL，1.0μL)，操作如实施例2，反应在42℃下进行。

引物探针浓度优化结果分别如图2和图3。结果表明，ERA反应体系中引物最适浓度为500nM，探针最适浓度为120nM。

实施例4：ERA检测灵敏性试验

为确定对虾桃拉综合征病毒ERA扩增反应的灵敏性，以阳性标准品为模板，并将其10倍梯度稀释(1×10

检测结果如图4所示。结果表明：本发明的对虾桃拉综合征病毒ERA检测方法的灵敏性为10

实施例5：ERA检测特异性试验

为确定对虾桃拉综合征病毒ERA扩增反应的特异性，分别以桃拉综合征病毒(TSV)、对虾肝肠胞虫(EHP)、白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原菌和健康对虾的DNA进行检测。

检测结果如图5所示。结果表明：本发明的对虾桃拉综合征病毒ERA检测方法仅对TSV基因出现正常扩增，EHP、WSSV、IHHNV、AHPND、健康对虾样品及阴性对照(无菌水)均未出现扩增。上述结果说明，本发明的设计的引物与探针不与其他病原发生交叉反应，不会出现假阴性，特异性强。

实施例6：桃拉综合征病毒的ERA恒温荧光检测方法

1)提取待测样本对虾的RNA，并进行反转录获得cDNA；

1.1样本选择：若为成虾则取对虾鳃组织、血淋巴或虾肝胰腺组织，若为仔虾则取甲壳下组织。

1.2样本cDNA获取：采用核酸快提试剂盒、传统方法获取等。

2)以该cDNA为模板，采用实施例1中引物对和荧光探针进行ERA扩增，用荧光检测装置检测扩增体系中荧光信号的变化；

2.1按照以下所述制备每份样本的预混液：

表2反应体系

将预混液充分振荡混匀并短暂离心。

2.2对于每份样本，将48μL预混液转移至每管冻干粉中。振荡混匀并短暂离心。

2.3对于每份样本，在反应管盖上加上2μL激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀并再次快速离心

2.4将反应管放入荧光检测装置，在42℃下反应20min，每30秒采集一次FAM通道荧光值。(检测设备：任何能激发和检测所选荧光团，并能将温度稳定于36-42℃的荧光检测仪都适用，如GS8荧光恒温扩增仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光定量PCR仪等。)

2.5反应结束后，保存数据并弃置样本管。

3)结果判定。根据比较Ct值大小及荧光强度高低对对虾中的桃拉综合征病毒进行定性检测。

其结果判定根据最终荧光扩增曲线分析待测样本，荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾桃拉综合征病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾桃拉综合征病毒阴性结果。

本发明选取桃拉综合征病毒衣壳蛋白2基因作为检测的靶基因，针对靶基因序列设计了ERA检测专用引物和探针，并建立桃拉综合征病毒的ERA检测方法。通过实验证明：本发明的桃拉综合征病毒ERA检测方法可在36～42℃下30min内完成检测，最适温度为42℃，灵敏性为10

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。