磁珠法检测维生素K1与K2的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分析技术领域，涉及维生素的检测，尤其涉及磁珠法检测维生素K1与K2的试剂盒及方法。

背景技术

维生素K均是2-甲基-1,4-萘醌的衍生物。广泛存在于自然界的维生素K有维生素K1、维生素K2。维生素K1又称为植物甲萘醌或叶绿醌，主要存在于深绿色的蔬菜(比如甘蓝、菠菜、莴苣等)和植物油中。维生素K2是肠道细菌的产物。维生素K3是人工合成的水溶性甲萘醌，可口服及注射。最重要的是维生素K1和K2。

维生素K控制着凝血因子Ⅱ(凝血酶原)凝血因子Ⅶ(转变加速因子前体)Ⅸ(cnvisma5)因子，为血浆促凝血酶原成份。依赖维生素K的凝血因子是蛋白质C，蛋白质S和蛋白质Z，蛋白质C和蛋白质S是促凝血素，正常骨骼中代谢所需的两种骨基质蛋白质是维生素K依赖的，维生素K的两种蛋白质是骨钙素(BGP)和基质蛋白(MGP)钙结合蛋白对调节骨和肌体钙起着十分重要的作用，它可以增加骨密度，防止骨质疏松，对骨刺、动脉硬化钙斑及组织钙沉积硬化有清洁剂的作用，值得进一步研究讨论。羧化反应和维生素K循环，这是维生素K的利用途径，大剂量的维生素K(1－10mg)能克服香豆素的阻断，它是通过肝脏还原酶再生维生素K氢醌。维生素K溶于线粒体膜的类脂中，起着电子转移作用，维生素K被体酶还原而产生的半氢醌自由基，阻止细胞增殖，并能提高对放射线的敏感性，可作为肿瘤放射治疗的增敏剂使用。维生素K有选择性直接松弛平滑肌，同时对乙酰胆硷引起的平滑肌收缩有显著的抑制作用，并有镇痛镇静的效果，并能增强水杨酸和吗啡药物的镇静镇痛效果。

人体维生素K的需要量非常少，但它却是维护血液功能正常凝固，减少生理期大量出血，还可防止内出血及痔疮。经常流鼻血的人，应该多从天然食物中摄取维生素K。维生素K主要在小肠被吸收，随着乳糜微粒而代谢。体内维生素K的储存量有限，脂类吸收障碍引发的首个脂溶性维生素缺乏症便是维生素K缺乏症。维生素K是临床常用的一种止血药。自1974年以来，中国国内学者通过一系列实验研究和临床观察，发现维生素K还有明显的解痉止痛作用。近年来，广大的医务工作者在临床观察中发现维生素K还对毛细支气管炎、支气管哮喘、喘息性气管炎以及气管炎等均有明显的止喘作用；对小儿腹泻有一定的治疗作用；对某些细菌也有一定的抑制作用。准确定量维生素K1,K2在人体内的水平，有助于指导医生合理补充多种维生素矿物质，改善人体营养素的营养状况，保证国民的正常生长发育，骨骼发育，智力发育，以及改善免疫功能都是有益的。

在人体维生素检测K1,K2常用方法主要包括，蛋白沉淀法，液液萃取法，固相萃取法。蛋白沉淀法通常使用有机溶剂沉淀蛋白取上清液上机分析，样本净化效率低，容易造成色谱柱的堵塞和质谱仪器的污染。液液萃取法通常使用正相的有机溶剂(正己烷，甲基叔丁基醚)，样品需要氮吹，有机溶剂容易挥发，对实验室环境及人员不友好。固相萃取法同时使用SPE板净化样本，样本净化效果较好，但是SPE固相填料容易被有机溶剂溶胀，批次间的均一性较差，SPE固相萃取方法耗材成本较高，不适用大批量临床样本检测。例如专利CN113933410B公开的“一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法”,使用正己烷强挥发性有机溶剂，方法需要沉淀蛋白，萃取，氮吹，复溶，操作复杂，对实验人员身体造成一定影响。例如Yoshitomo Suhara,Maya Kamao,Naoko Tsugawa,et al公开的“Method for theDetermination of Vitamin K Homologues in Human Plasma Using High-PerformanceLiquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry”文章，该方法通过Sep Pak silicaSPE板净化富集，转移至96孔板，上机测试。SPE板使用的溶剂量比较大，易于造成SPE板的膨胀，导致结果的不均一。

目前没有针对于人血清中维生素K1,K2共同检测的试剂盒，检测耗时时间长，操作繁琐，对技术人员要求较高，无法配合自动化使用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明首先提供了一种基于磁性法的自动样本前处理检测性维生素K1K2的试剂盒，使用磁珠法测定K1K2，代替蛋白沉淀，液液萃方式，减小传统方法在提取维维生素K时，基质对维生素K1K2的干扰。

其次，本发明提供了一种磁珠自动化定量测定维生素K1,K2的液相色谱串联质谱方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种磁珠法检测维生素K1与K2的试剂盒，所述试剂盒包括内标液、淋洗液、洗脱液、校准品溶液与磁珠，所述磁珠为磁性载体核心和包裹在外层修饰的壳层构成；其中，内标为vitamin K1-D7与Vitamin K2-D7，内标液包括30-60％甲醇、0.1-0.5％十二烷基磺酸钠与1-5％的聚乙二醇。

作为本发明的一种优选方案，所述淋洗液为40-70％甲醇水溶液。

作为本发明的一种优选方案，所述洗脱液为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇中一种或多种。

作为本发明的一种优选方案，所述校准品溶液包括系列浓度的vitamin K1,Vitamin K2的混合溶液。

作为本发明的一种优选方案，所述校准品溶液包括系列浓度已知的20ng/mL的vitaminK1，40ng/mL的vitaminK2。

作为本发明的一种优选方案，所述磁珠的磁性载体核心为Fe

本发明还提供了使用上述试剂盒的磁珠法检测维生素K1与K2的方法，包括以下步骤：

1)在离心管中加入血清和内标液，1100rpm涡旋30s,离心后的上清液转移至新的离心管中，加入磁珠液，1100rpm涡旋30s,使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去离心管所有液体；

2)在离心管中加入淋洗液，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去离心管所有液体；再次加入淋洗液，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去离心管所有液体；

3)在离心管中加入洗脱液，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，收集离心管所有液体至96孔板，上液相色谱串联质谱仪检测。

作为本发明的一种优选方案，所述血清的加入量为200μL，内标液的加入量为50μL，淋洗液的加入量为1000μL、洗脱液的加入量为100μL、校准品溶液的加入量为200μL、磁珠的加入量为5mg。

作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，色谱条件为：色谱柱：2.1*50mm,1.7μm的Waters BEH C18+在线过滤器；流速：0.4mL/min；柱温：50℃；进样：20μL；

梯度洗脱程序为：0-0.8min，5％的流动相A与95％的流动相B；

0.8-3min，5％的流动相A与95％的流动相B；

3-3.5min，0％的流动相A与100％的流动相B；

3.5-3.6min，0％的流动相A与100％的流动相B；

3.6-4min，5％的流动相A与95％的流动相B；

在第4min，5％的流动相A与95％的流动相B。

作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，质谱条件为：ESI+；毛细管电压：3.0Kv；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/h；锥孔电压：50v；扫描模式：多反应监测模式。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明提供的试剂盒应用测定维生素K1K2的含量，与现有的方法相比，简化了样本的前处理流程，简化了试验的操作，提高临床检测的通量。

2)本发明使用磁珠法测定维生素K1K2，代替蛋白沉淀，液液萃方式，减小传统方法在提取维维生素K时，基质对维生素K1K2的干扰。

附图说明

图1是维生素K1的线性图。

图2是维生素K2的线性图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明中，所用到的原料与试剂或者设备均可从市场购得。

本发明首先提供了一种磁珠法检测维生素K1与K2的试剂盒，所述试剂盒包括内标液、淋洗液、洗脱液、校准品溶液与磁珠，所述磁珠为磁性载体核心和包裹在外层修饰的壳层构成；其中，内标为vitamin K1-D7与Vitamin K2-D7，内标液包括30-60％甲醇、0.1-0.5％十二烷基磺酸钠与1-5％的聚乙二醇。

淋洗液为40-70％甲醇水溶液。

洗脱液为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇中一种或多种。

校准品溶液包括系列浓度的vitamin K1,Vitamin K2的混合溶液。

校准品溶液包括系列浓度已知的20ng/mL的vitaminK1，40ng/mL的vitaminK2。

磁珠的磁性载体核心为Fe

实施例1

本实施例公开了通过上述试剂盒检测维生素K1与K2的方法，包括以下步骤：

1)在离心管中加入血清和内标液，1100rpm涡旋30s,离心后的上清液转移至新的离心管中，加入磁珠液，1100rpm涡旋30s,使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去离心管所有液体。

2)在离心管中加入淋洗液，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去离心管所有液体；再次加入淋洗液，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去离心管所有液体；

3)在离心管中加入洗脱液，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，收集离心管所有液体至96孔板，上液相色谱串联质谱仪检测。

血清的加入量为200μL，内标液的加入量为50μL，淋洗液的加入量为1000μL、洗脱液的加入量为100μL、校准品溶液的加入量为200μL、磁珠的加入量为5mg。

其中，色谱条件的设置：

色谱柱：Waters BEH C18(2.1*50mm,1.7μm)+在线过滤器；流速：0.4mL/min；柱温：50℃；进样：20μL

梯度洗脱程序见表1。

表1.梯度洗脱程序

质谱条件的设置：

离子源参数见表2。

表2.离子源参数

扫描模式：多反应监测(MRM)见表3。

表3.多反应监测

参见图1与图2，图1是通过本发明方法得到的维生素K1的线性图，图2是通过本发明方法得到的维生素K2的线性图。

对本发明方法进行维生素K1，维生素K2的回收率测试，结果见表4。

表4.维生素K1、K2回收率％

对本发明方法进行低浓度批内批间差，结果见表5。

表5.维生素K1、K2批内、批间CV％(低浓度)

对本发明方法进行高浓度批内批间差，结果见表6。

表6.维生素K1、K2批内、批间CV％(高浓度)

可见，批内和批间CV均小于10％。

本发明提供的试剂盒应用测定维生素K1K2的含量，与现有的方法相比，简化了样本的前处理流程，简化了试验的操作，提高临床检测的通量。本发明使用磁珠法测定维生素K1K2，代替蛋白沉淀，液液萃方式，减小传统方法在提取维维生素K时，基质对维生素K1K2的干扰。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。