一种含干细胞外泌体提取物的制剂及其用于生发或皮肤再生修复的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种含干细胞外泌体提取物的制剂及其用于生发或皮肤再生修复的应用。

背景技术

间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有强大的增殖能力和多向分化能力，且能分泌各种功能性因子，能够促进毛发和皮肤的再生，在治疗脱发和皮肤组织损伤领域有良好的的应用推广前景。间充质干细胞的外泌体是其向外界环境中分泌的一种纳米囊泡结构，含有蛋白质、脂质、mRNA等生物活性物质，可以直接进入靶细胞中，将其内容物转移到靶细胞内，与直接采用间充质干细胞进行治疗相比具有更稳定、吸收利用效果更好等优势，备受研究者的关注。综上，开发修复效果更好的间充质干细胞外泌体提取物制剂，成为当前生发或皮肤再生修复研究领域的热点。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种含干细胞外泌体提取物的制剂及其用于生发或皮肤再生修复的应用。

本发明提出的一种含干细胞外泌体提取物的制剂，包括间充质干细胞外泌体提取物和溶剂；

所述间充质干细胞外泌体提取物的制备方法为：

将纳米羟基磷灰石加入含10％胎牛血清的基础培养基中分散均匀得到混合培养基质，将所述混合培养基质加入培养容器中，然后接种P1-P3代间充质干细胞，在37℃、5％CO

优选地，所述混合培养基质中，纳米羟基磷灰石的浓度为10-15μg/mL。

优选地，所述基础培养基为α-MEM培养基或者DMEM培养基。

优选地，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞或者胎盘间充质干细胞，但不限于以上几种。

优选地，所述间充质干细胞接种的细胞密度为2-8×10

优选地，所述离心去除细胞和细胞碎片的步骤包括：于4℃下，先以300g的转速离心10-15min，然后以2000g的转速离心10-15min，再以10000g的转速离心30-40min。

优选地，所述超速离心的条件为：于4℃下，以100000g的转速离心2-3h。

优选地，每mL所述制剂含10-500μg所述间充质干细胞外泌体提取物。

优选地，所述含干细胞外泌体提取物的制剂还包括功能添加剂，所述功能添加剂为当归多糖、人参多糖、铁皮石斛多糖中的至少一种；优选地，每mL所述制剂含所述功能添加剂20-50μg。

优选地，所述溶剂为生理盐水。

本发明还公开了所述的含干细胞外泌体提取物的制剂用于生发或皮肤再生修复的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明通过在培养基中加入适量纳米羟基磷灰石对间充质干细胞进行诱导培养使其发生成骨分化，成骨分化诱导一段时间后的间充质干细胞外泌体中细胞因子Wnt3α的表达量增加，可以通过激活上调靶细胞中的Wnt/β-catenin信号通路达到促进头发再生的效果，同时Wnt/β-catenin信号通路的增强也有助于皮肤的创口愈合。因此，本发明的间充质干细胞外泌体提取物能够显著提升其在生发和皮肤修复方面的效果；进一步地，通过在制剂中加入功能添加剂例如当归多糖、人参多糖、铁皮石斛多糖，其能够上调碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)的表达，通过对这些关键细胞因子的分泌量增加来进一步改善制剂对头发再生和创口愈合的疗效。综上，本发明的含干细胞外泌体提取物的制剂对生发和皮肤的再生修复方面取得了疗效的显著提升，在治疗脱发和皮肤组织损伤领域有着良好的的应用前景。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

一种含干细胞外泌体提取物的制剂，包括脂肪间充质干细胞外泌体提取物100μg/mL、余量为生理盐水；

脂肪间充质干细胞的原代、传代培养方法如下：

将脂肪组织清洗、消毒后粉碎，用0.2％的Ⅰ型胶原酶在37℃下消化50min，然后加入含0.2％胎牛血清的α-MEM培养基终止消化，过滤除去脂肪组织残块，然后以1500g的转速离心5min，将得到的沉淀物细胞用含10％胎牛血清的α-MEM培养基重悬，置于培养箱中在37℃、5％CO

脂肪间充质干细胞外泌体提取物的制备方法为：

将纳米羟基磷灰石加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基中分散均匀得到混合培养基质，将混合培养基质加入24孔培养板中，然后以4×10

实施例2

一种含干细胞外泌体提取物的制剂，包括脂肪间充质干细胞外泌体提取物100μg/mL、当归多糖35μg/mL、余量为生理盐水；

脂肪间充质干细胞的原代、传代培养方法同实施例1。

脂肪间充质干细胞外泌体提取物的制备方法为：

将纳米羟基磷灰石加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基中分散均匀得到混合培养基质，将混合培养基质加入24孔培养板中，然后以4×10

实施例3

一种含干细胞外泌体提取物的制剂，包括脂肪间充质干细胞外泌体提取物100μg/mL、当归多糖20μg/mL、铁皮石斛多糖15μg/mL、余量为生理盐水；

脂肪间充质干细胞的原代、传代培养方法同实施例1。

脂肪间充质干细胞外泌体提取物的制备方法为：

将纳米羟基磷灰石加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基中分散均匀得到混合培养基质，将混合培养基质加入24孔培养板中，然后以4×10

实施例4

一种含干细胞外泌体提取物的制剂，包括脂肪间充质干细胞外泌体提取物10μg/mL、当归多糖50μg/mL、余量为生理盐水；

脂肪间充质干细胞的原代、传代培养方法同实施例1。

脂肪间充质干细胞外泌体提取物的制备方法为：

将纳米羟基磷灰石加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基中分散均匀得到混合培养基质，将混合培养基质加入24孔培养板中，然后以2×10

实施例5

一种含干细胞外泌体提取物的制剂，包括脐带间充质干细胞外泌体提取物500μg/mL、当归多糖50μg/mL、余量为生理盐水；

脐带间充质干细胞的原代、传代培养方法如下：

取新鲜脐带经过消毒、清洗后，剔除血管，剪成块状，将得到的组织块置于培养皿中，加入浓度为0.125％的胰蛋白酶，在37℃水浴下消化20min，然后离心，弃去上清液，将得到的组织块用PBS洗涤后置于培养皿中，加入浓度为0.2％的胶原酶，在37℃水浴下消化1.5h，然后离心，弃去上清液，然后用PBS洗涤，置于培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO

脐带间充质干细胞外泌体提取物的制备方法为：

将纳米羟基磷灰石加入含10％胎牛血清的DMEM培养基中分散均匀得到混合培养基质，将混合培养基质加入24孔培养板中，然后以8×10

对比例1

一种含干细胞外泌体提取物的制剂，包括脂肪间充质干细胞外泌体提取物100μg/mL、余量为生理盐水；

脂肪间充质干细胞的原代、传代培养方法同实施例1。

脂肪间充质干细胞外泌体提取物的制备方法为：

将含10％胎牛血清的α-MEM培养基加入24孔培养板中，然后以4×10

试验例

(1)小鼠毛发生长试验

将50只C57/BL6小鼠分为5组，每组10只，分别是试验组1-4和对照组，乙醚麻醉后用松香和石蜡1：1的混合物热融化，涂于小鼠背部，凝固后揭去，将其背部毛发拔除，脱毛区域为2cm×2cm，然后在试验组1-4的小鼠脱毛处分别涂抹实施例1-3和对比例1的制剂，在对照组的小鼠脱毛处涂抹生理盐水，涂抹量为0.1ml/次，每日涂抹两次，肉眼观察小鼠的毛发生长情况。记录并计算各组小鼠出现新生毛发的时间。结果见表1。

表1

(2)小鼠皮肤创面愈合试验

将50只BALB/c小鼠分为5组，每组10只，分别是试验组1-4和对照组，在背部去除一个圆形皮片，直径为6mm，然后在试验组1-4的小鼠创面处分别注射实施例1-3和对比例1的制剂0.1ml，同时在创面处喷洒实施例1-3和对比例1的制剂0.1ml，在对照组的小鼠创面处注射并喷洒生理盐水，于7d时测量并记录创面大小，计算创面愈合率。结果见表2。

表2

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。