尿调蛋白Sda抗原糖基化检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及尿调蛋白Sda抗原糖基化检测方法及试剂盒。

背景技术

糖基化是蛋白重要的翻译后修饰，糖基化异常可辅助疾病诊断并参与疾病发生发展过程。尿调蛋白是正常人尿液中含量最丰富的蛋白质，它主要表达在肾脏髓袢升支粗段，N-糖含量丰富(占分子量30％)，在多种肾脏疾病中发挥了重要作用。尿调蛋白水平改变可作为生物标志物辅助肾脏疾病诊断。疾病状态下，尿调蛋白糖基化改变可早于蛋白水平。尿调蛋白N-糖修饰末端中含有一种特殊的Sda抗原。它的结构组成为GalNAcβ(1,4)[Neu5Acα(2,3)]Galβ(1,4)GlcNAcβ(1,3)Gal。Sda抗原为尿调蛋白表达的特殊抗原，Sda抗原合成的限速酶β-1,4N-乙酰胺基半乳糖基转移酶2在胃肠道细胞和肾脏外髓(由表达尿调蛋白的髓袢升支粗段组成)特异性表达。

目前用于尿调蛋白糖基化检测的技术手段包括质谱检测，液相色谱检测，凝集素芯片检测和核磁共振检测。其中基质辅助激光解吸电离与飞行时间联用质谱分析技术由于操作简单，且能提供丰富的糖型信息等优点，往往是N-糖分析的首选。但是，质谱依赖分子量进行N-糖链预测，而N-糖链的多样性导致质谱结果的精确性不足。质谱检测需要蛋白样本量较大，耗时较长，不便于临床检测推广。凝集素芯片技术是近年研发的用于糖基化检测的新技术。凝集素是一种可以特异性识别并结合糖的蛋白质。凝集素芯片是一种高通量实验方法。它是将多种凝集素同时预包被在同一玻璃板上，将预先进行抗体或染料标记的待测物加入凝集素芯片板上，即可利用凝集素对糖的特异性识别得出信号结果。自2005年报导以来，凝集素芯片被广泛应用于癌症、细菌、真菌、干细胞及糖尿病等相关研究中。但是作为一项高通量新技术，它的费用昂贵，更适用于科学研究而非临床检测。此外，现有的质谱检测和凝集素芯片检测技术均需对尿调蛋白进行分离纯化以排除其他蛋白干扰，无法直接使用尿液标本检测。尿调蛋白纯化需要收集大量尿液进行蛋白提取，更增加了检测的复杂程度。

发明内容

本发明基于凝集素检测原理及Sda抗原特殊性，提供了更加快速简单且花费少的Sda糖基化检测方法及试剂盒。

第一方面，本发明要求保护一种用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒。

本发明要求保护的用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒，包括标准抗原、捕获物和检测物。所述标准抗原为健康人尿调蛋白；所述捕获抗物为抗尿调蛋白抗体；所述检测物为经生物素标记的能够识别Sda的凝集素。

进一步地，所述抗尿调蛋白的抗体可为抗尿调蛋白的多抗。当然，也可以为具有等同效果的抗尿调蛋白的单抗。

在本发明的具体实施方式中，所述抗尿调蛋白上的抗体具体为Meridian公司生产的货号为K90071C-1绵羊抗人尿调蛋白多抗。

进一步地，所述能够识别Sda的凝集素可为DBA(Vectorlabs，B-1035-5)。当然，也可以为具有等同效果的能够识别Sda的其他凝集素。

更进一步地，所述酶联免疫试剂盒中还可含有辣根过氧化物酶标记的亲和素和/或样本稀释液。

其中，所述亲和素为具有亲和素结合特性的物质。具体的，所述具有亲和素结合特性的物质可为链霉亲合素、卵白亲合素、卵黄亲合素或类亲合素。

在本发明的具体实施方式中，所述亲和素具体为链霉亲和素。

其中，所述样本稀释液为缓冲液。

在本发明的具体实施方式中，所述缓冲液为0.01M pH 7.4的PBS缓冲液。

当然，所述酶联免疫试剂盒中还可含有如下中的至少一种：酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液。

在本发明的具体实施方式中，所述铺板缓冲液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

在本发明的具体实施方式中，所述洗涤液为仅含有0.1％体积百分含量Tween 20的pH为7.4的磷酸盐缓冲液(即0.1％PBST)。

在本发明的具体实施方式中，所述封闭液为仅含有10g/L BSA的pH为7.4的磷酸盐缓冲液(即1％BSA)。

在本发明的具体实施方式中，所述显色液为四甲基联苯胺(TMB)。

在本发明的具体实施方式中，所述终止液为1M H

第二方面，本发明要求保护前文所述的酶联免疫试剂盒在检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量中的应用。

在所述应用中，以尿液为待测样本，经缓冲液稀释后进行检测。

在本发明的具体实施方式中，所述缓冲液为0.01M pH 7.4的PBS缓冲液。

在所述应用中，尿液标本不能用超纯水稀释，超纯水稀释检测体系测不出。

在所述应用中，可使用不同浓度的所述标准抗原对应检测出Sda抗原含量作为标准曲线(所述标准抗原为健康人尿调蛋白)。

第三方面，本发明要求保护前文所述的酶联免疫试剂盒在制备用于辅助诊断与尿调蛋白上的Sda糖抗原异常表达相关疾病的产品中的应用。

本发明的有益效果：与现有的技术方案相比，该检测方法无需收取大量尿标本进行蛋白纯化，可直接使用少量尿液标本直接进行检测，这大大简化了检测流程。该检测方案要求设备及试剂简单易获取，使用该检测方法耗时少，花费低，便于临床开展。Sda抗原表达水平在肾损伤时发生改变，快速便捷的检测方法为临床早期诊断治疗争取了宝贵的时间。

附图说明

图1为本发明用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的检测原理示意图。

图2为本发明检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的标准曲线。纵轴：Y(实测OD450值)；横轴：X(Sda糖抗原浓度U/μl)。

图3为使用本发明实施例建立的方法检测急性肾损伤AKI患者和健康人尿液中尿调蛋白上Sda糖抗原含量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的制备及使用方法

一、用于检测尿液中尿调蛋白(UMOD)上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的制备

本发明所提供的用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的ELISA试剂盒，包括：标准抗原、捕获物、检测物，以及酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)、显色液和终止液等。其中，所述标准抗原为健康人尿调蛋白(健康人尿调蛋白含有正常含量的Sda糖基化)；所述捕获物为抗尿调蛋白的抗体(Meridian公司尿调蛋白多抗K90071C-1)，所述检测物为经生物素标记的能够识别Sda的凝集素DBA。检测原理图如图1所示。

(一)常规器材和试剂

1、ELISA板(96孔酶标板)，Thermo公司。

2、铺板缓冲液：碳酸盐缓冲液pH 9.6。

3、洗涤液：仅含有0.1％体积百分含量Tween 20的pH为7.4的磷酸盐缓冲液(即PBST缓冲液)，简称0.1％PBST。

4、封闭液：仅含有10g/L BSA的pH为7.4的磷酸盐缓冲液，简称1％BSA。

5、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Vectorlabs SA-5014-1)。

6、显色底物：四甲基联苯胺(TMB)。

7、终止液：1M H

8、样本稀释液：0.01M pH 7.4的PBS缓冲液。

(二)标准抗原(健康人尿调蛋白)样品制备以及纯度检测

健康人尿调蛋白样品制备：

1)留取健康人24h尿液，准备缓冲液0.02M PBS，0.1M PB。

2)将20g硅藻土与24h尿混合，4℃搅拌20min，加入铺有18.5cm Whatman滤纸的布氏漏斗中，真空泵抽吸。

3)过滤完后，用800ml PBS润洗硅藻土。

4)硅藻土抽水分后取出，与150ml超纯水混合，置于4℃冷库中搅拌30min。

5)分装混合液至50ml高速离心管，天平配平后高速离心，20000g，20min，4℃。

6)离心结束后，取出离心管，留上清，弃沉淀(动作轻柔，硅藻土易上浮)。向上清中加入0.1M PB和NaCl分别至浓度0.025M/0.14M(通常PB加入46ml，NaCl加入1.5g)。混合液置于4℃搅拌20min。

7)将混合液加入铺有Whatman滤纸的7cm布氏漏斗中过滤，200ml PBS冲洗。

8)再次抽干硅藻土，将硅藻土与50ml超纯水混合，置于4℃冷库中搅拌30min。

9)混合液装入50ml高速离心管中，天平配平后高速离心，20000g，20min，4℃。

10)离心后上清装入透析袋中(截流量30kD)，体积不超过2/3，封闭两端后置于5L去离子水中透析4℃过夜。

11)第二天，将透析后液体取出，使用0.2μM滤器过滤液体，去除杂质。

12)超滤浓缩，使用截流量30kD超滤管(Millipore)对蛋白进行浓缩。3000rpm，4℃，观察浓缩状态，调整离心时间。

13)浓缩后，使用nanodrop及BCA试剂盒检测蛋白浓度。

14)考马斯亮蓝/银染检测蛋白纯度。

15)标本分装，冻干存于-80℃冰箱。

考马斯亮蓝检测纯度

1)配制10％SDS-PAGE胶，电泳液。

2)样品准备2-4μg蛋白样品，加水和5×loading缓冲液配成合适体积。还原样品需煮沸10min，非还原样本无需煮沸。

3)上样，电泳，恒压80V，样品到达分离胶层后，调电压至120V。

4)电泳后取出凝胶，将上层的浓缩胶和底部loading切除。

5)考马斯亮蓝染色，30min-1h。

6)脱色，每隔20-30min换一次脱色液，此后，4℃过夜脱色。拍照保存。

(三)检测物(经生物素标记的能够识别Sda的凝集素DBA)

DBA为商品化试剂，来自Vectorlabs B1035-5。

二、检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的使用方法

1、采用标准抗原制作标准曲线

(1)准备系列浓度的尿调蛋白(含Sda糖抗原)标准品溶液：依次稀释步骤一制备得到的标准抗原(健康人尿调蛋白)浓度为2000pg/μl、1000pg/μl、500pg/μl、250pg/μl、100pg/μl、50pg/μl、10pg/μl，并以稀释液作为空白孔(0pg/μl)。

(2)将Meridian公司尿调蛋白多抗(货号为K90071C-1绵羊抗人尿调蛋白多抗)用pH9.6的碳酸氢盐缓冲液1:4000(体积比)稀释后，预包被在检测板上，4℃过夜。实验体系为100μl。

(3)1％BSA封闭，37℃，孵育60min。

(4)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；将步骤(1)中准备好的系列浓度的尿调蛋白上的Sda糖抗原标准品溶液上样，37℃，孵育60min。

(5)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；1:2000(体积比)稀释生物素标记的DBA(Vectorlabs，B-1035-5)，上样，100μl/孔，37℃，60min。

(6)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；1:2000(体积比)稀释辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，上样，100μl/孔，37℃，50min。

(7)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；TMB显色液室温显色10-20min，1M H2SO4硫酸终止。

(8)酶标仪450nm处读数。

(9)前述各系列浓度的标准品中，尿调蛋白上的Sda浓度分别对应以2000U/μl、1000U/μl、500U/μl、250U/μl、100U/μl、50U/μl、10U/μl、0U/μl(标准品中每1pg尿调蛋白所携带的Sda含量判定为1U)。分别以上述该值为横坐标，以其对应OD450值为纵坐标，作图得到标准曲线(如图2和表1所示)。

表1、尿调蛋白Sda糖抗原浓度计算方程，四参数Logistic曲线拟合

2、待测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的测定

将步骤1中的标准抗原(正常糖基化尿调蛋白)替换为待测人尿液样本，经0.01MpH7.4的PBS缓冲液10倍(体积)稀释后进行检测(注意尿液标本不能用超纯水稀释，超纯水稀释检测体系测不出)，将所得的OD450值代入步骤1所得的标准曲线，从而获得待测人尿液样本中尿调蛋白上的Sda糖抗原的含量。

实施例2、检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的应用实例

使用实施例1建立的方法检测急性肾损伤AKI患者和健康人尿液中尿调蛋白上Sda糖抗原含量。

一、病例纳入

1、人群纳入标准

急性肾损伤(AKI)患者：17例，符合48小时内血肌酐上升≥0.3mg/dL(26.5μmol/L)或者尿量<0.5mL/kg/h持续6小时。

健康对照(CK)：17例，体检肾功能正常，无肾脏基础疾病、无泌尿系统感染，年龄>18岁的健康成年人。

2、人群排除标准

(1)术前肾脏病史

(2)泌尿系感染

(3)手术为肾脏手术。

3、受试者基本信息

10例急性肾损伤患者均为手术后(非肾脏手术)，5例男性，5例女性，平均年龄57±4岁，符合急性肾损伤的标准。

10例健康对照为体检肾功能正常，体检肾功能正常，无肾脏基础疾病、无泌尿系统感染的实验室工作人员。

二、样本采集与处理

针对后续不同的检测方法，采集的尿液量不同，具体如下：

1、凝集素芯片和生物素直接标记尿调蛋白的凝集素-ELISA方法检测需要尿量至少1000毫升，留尿后立即处理样本，提取并纯化尿调蛋白。

尿调蛋白提取方法：

1)将20g硅藻土与尿液混合，4℃搅拌20min，加入铺有18.5cm Whatman滤纸的布氏漏斗中，真空泵抽吸。

2)过滤完后，用800ml PBS润洗硅藻土。

3)硅藻土抽水分后取出，与150ml超纯水混合，置于4℃冷库中搅拌30min。

4)分装混合液至50ml高速离心管，天平配平后高速离心，20000g，20min，4℃。

5)离心结束后，取出离心管，留上清，弃沉淀(动作轻柔，硅藻土易上浮)。向上清中加入0.1M PB和NaCl分别至浓度0.025M/0.14M(通常PB加入46ml，NaCl加入1.5g)。混合液置于4℃搅拌20min。

6)将混合液加入铺有Whatman滤纸的7cm布氏漏斗中过滤，200ml PBS冲洗。

7)再次抽干硅藻土，将硅藻土与50ml超纯水混合，置于4℃冷库中搅拌30min。

8)混合液装入50ml高速离心管中，天平配平后高速离心，20000g，20min，4℃。

9)离心后上清装入透析袋中(截流量30kD)，体积不超过2/3，封闭两端后置于5L去离子水中透析4℃过夜。

10)第二天，将透析后液体取出，使用0.2μM滤器过滤液体，去除杂质。

11)超滤浓缩，使用截流量30kD超滤管(Millipore)对蛋白进行浓缩。3000rpm，4℃，观察浓缩状态，调整离心时间。

12)浓缩后，使用nanodrop及BCA试剂盒检测蛋白浓度。

13)考马斯亮蓝/银染检测蛋白纯度。

15)标本分装，冻干存于-80℃冰箱。

考马斯亮蓝检测纯度：

1)配制10％SDS-PAGE胶，电泳液。

2)样品准备2-4μg蛋白样品，加水和5×loading缓冲液配成合适体积。还原样品需煮沸10min，非还原样本无需煮沸。

3)上样，电泳，恒压80V，样品到达分离胶层后，调电压至120V。

4)电泳后取出凝胶，将上层的浓缩胶和底部loading切除。

5)考马斯亮蓝染色，30min-1h。

6)脱色，每隔20-30min换一次脱色液，此后，4℃过夜脱色。拍照保存。

2、利用生物素标记的DBA直接检测尿调蛋白上Sda抗原的含量：需要留取尿液5毫升，2500rpm离心20min，分离上清，取一份体积的上清，加9份体积的0.01MPBS缓冲液，直接用稀释后样品用于检测，亦可将上清分装冻存于-80℃冰箱供未来检测使用，冻存样本溶解后，直接用0.01MPBS缓冲液，(按照样本:缓冲液1:9体积比)稀释。

三、样本检测

使用实施例1建立的方法。

四、数据处理

每份样本重复两次，取均值。健康人组和AKI组采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

五、结果与分析

急性肾损伤AKI患者(N＝17例)，正常对照(N＝17例)使用该方法检测尿调蛋白上Sda抗原浓度。AKI患者(54.9+/-43.9U/ml)明显低于正常对照(169.6+/-111.5U/ml)，P＝0.026。具体参见图3。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。