CNN2-B探针在动脉粥样硬化斑块特异性识别中的应用

技术领域

本发明涉及荧光探针技术领域，且特别涉及CNN2-B探针在动脉粥样硬化斑块特异性识别中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化(AS)是致死性心血管病的重要病因。由于传统诊断成像技术的局限，目前，研究者们聚焦于研究动脉粥样硬化斑块的荧光成像新模式，因而需要开发针对斑块的特异性识别探针。

现有的可用于识别斑块的有机小分子探针通常依赖于脂质的标记，如油红O。然而，脂质探针对其他载脂细胞器和组织细胞没有选择性，例如不能区分泡沫细胞和脂肪细胞，因而动脉壁附近的脂肪组织会严重干扰斑块的检测，造成假阳性结果。因此，研究出一种针对斑块识别的高选择性荧光探针对于动脉粥样硬化斑块特异性识别具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供CNN2-B探针在动脉粥样硬化斑块特异性识别中的应用，该CNN2-B探针为ONOO

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出CNN2-B探针在动脉粥样硬化斑块特异性识别中的应用，所述CNN2-B探针的结构式为：

本发明实施例的CNN2-B探针在动脉粥样硬化斑块特异性识别中的应用的有益效果是：

本发明的CNN2-B探针为ONOO

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1A为本发明实施例1的CNN2-B探针在不同响应体系中的荧光强度对比图；

图1B为反应时间对本发明实施例1的CNN2-B探针的荧光强度影响的趋势图；

图2A为LDs mimics浓度变化对本发明实施例1的CNN2-B的荧光强度影响的趋势图；

图2B为ONOO

图3为本发明实施例1的CNN2-B对有机生物活性分子和无机离子的选择性对比图；

图4A为本发明实施例1的CNN2-B及其响应产物CNN2的荧光共定位图；

图4B为分别采用本发明实施例1的CNN2-B和Mito-Tracker对A549细胞进行染色后的荧光分布图；

图5为分别采用本发明实施例1的探针CNN2-B和探针HPF对不同刺激下的小鼠巨噬细胞进行染色后的荧光分布图；

图6为本发明实施例1的CNN2-B的荧光强度随时间的变化图；

图7为采用不同荧光探针对斑块进行染色后的荧光分布图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的CNN2-B探针在动脉粥样硬化斑块特异性识别中的应用进行具体说明。

本发明提出CNN2-B探针在动脉粥样硬化斑块特异性识别中的应用，所述CNN2-B探针的结构式为：

进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述CNN2-B探针为脂质和ONOO

进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述应用包括CNN2-B探针体外测试、CNN2-B探针细胞水平测试和CNN2-B探针动物水平测试。

进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述CNN2-B探针体外测试的探针溶液选自CNN2-B探针的PBS缓冲液，其中，所述CNN2-B探针的PBS缓冲液还包含二甲基亚砜，所述CNN2-B探针的PBS缓冲液中，所述CNN2-B探针的浓度为9.5～10.5μmol/L，PBS缓冲液的pH＝7.4，所述二甲基亚砜的质量分数为0.08～0.12％。优选地，CNN2-B探针的PBS缓冲液中，CNN2-B探针的浓度为10μmol/L，PBS缓冲液的pH＝7.4，所述二甲基亚砜的质量分数为0.1％。

进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述CNN2-B探针细胞水平测试包括以下步骤：

将CNN2-B探针溶液与细胞在培养基上共孵育50～70min，除去含有探针的所述培养基后，采用荧光显微镜进行观察。

进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述CNN2-B探针溶液的浓度为9.5～10.5μmol/L，所述荧光显微镜的激发通道选择λ

进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述CNN2-B探针动物水平测试包括以下步骤：

配置CNN2-B探针的PBS溶液作为探针溶液，然后将滤纸放入所述探针溶液中浸泡8～12s，取出并贴敷于待观察组织表面，静置4～6min后，除去滤纸，即可在活体成像系统中进行连续观察，其激发通道选择λ

进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述CNN2-B探针的PBS缓冲液还包含二甲基亚砜，所述CNN2-B探针的PBS缓冲液中，所述CNN2-B探针的浓度为9.5～10.5μmol/L，PBS缓冲液的pH＝7.4，所述二甲基亚砜的质量分数为0.08～0.12％。优选地，CNN2-B探针的PBS缓冲液中，CNN2-B探针的浓度为10μmol/L，PBS缓冲液的pH＝7.4，所述二甲基亚砜的质量分数为0.1％。

本发明的过氧亚硝酸盐及脂质双响应的荧光探针CNN2-B通过脂质以及过氧亚硝酸盐这两种标志物的交叉识别，从而可更加精准的判断动脉粥样硬化斑块的位置。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的一种CNN2-B探针，其合成方法参考“a selective fluorescentturn-on probe for imaging peroxynitrite in living cells and drug-damagedliver tissues”；Peng Wang.et al，《Talanta》，(204)2019，第431-437页。该CNN2-B探针的结构式为：

试验例1

本试验例对实施例1的CNN2-B探针的ONOO

ONOO

配制1 mM的实施例1的CNN2-B探针母液备用。在3 mL体系中使CNN2-B终浓度达到10μM，分别加入10μM的ONOO

如图1A所示为实施例1的CNN2-B探针在不同响应体系中的荧光强度对比图。从图1A可以看出，探针在10μM ONOO

如图1B为反应时间对实施例1的CNN2-B探针的荧光强度影响的趋势图。从图1B可以看出，CNN2-B探针的双响应具有时间依赖性，在250分钟内随着时间的延长，荧光逐渐得到释放。

试验例2

本试验例对实施例1的CNN2-B探针的ONOO

配制1mM的实施例1的CNN2-B探针母液备用。在3mL体系中使CNN2-B终浓度达到10μM，分别加入0～10μM的ONOO

如图2A所示为LDs mimics浓度变化对实施例1的CNN2-B的荧光强度影响的趋势图。从图2A可以看出，在固定输入10μM ONOO

如图2B所示为ONOO

试验例3

本试验例在体外对实施例1的CNN2-B的响应选择性进行分析，具体包括以下步骤：

配制1mM的实施例1的CNN2-B探针母液备用。在3mL体系中使CNN2-B终浓度达到10μM，在10μM的ONOO

如图3所示为实施例1的CNN2-B对有机生物活性分子和无机离子的选择性对比图。其中，图3A为实施例1的CNN2-B对有机生物活性分子的选择性对比图。图3B为实施例1的CNN2-B对无机离子的选择性对比图。从图3可以看出，CNN2-B探针基本只与ONOO

试验例4

本试验例对实施例1的CNN2-B的细胞器定位情况进行分析，其中，选用A549细胞评估探针的细胞器定位情况，具体步骤包括：

培养A549细胞，实施例1的CNN2-B给药浓度为10μM，首先与线粒体探针或脂滴探针共孵育1小时，取出固定，DAPI染色后进行共聚焦成像；其次，使用100μM SIN-1预给药30分钟，后加入10μM CNN2-B与其他细胞器探针共孵育1小时，取出固定，DAPI染色后进行共聚焦成像。

如图4A所示为实施例1的CNN2-B及其响应产物CNN2的荧光共定位图。从图4A可以看出CNN2-B主要定位于线粒体，而CNN2-B的响应产物CNN2主要定位于脂滴。

如图4B所示为分别采用实施例1的CNN2-B和Mito-Tracker对A549细胞进行染色后的荧光分布图。从图4B可以看出，CNN2-B在细胞里响应ONOO

试验例5

本试验例对实施例1的CNN2-B特异性识别泡沫细胞进行研究，具体包括以下步骤：

培养小鼠巨噬细胞Raw 264.7，使用4μg/mL的氧化型低密度脂蛋白刺激细胞24小时，使其形成泡沫细胞，或加入4μg/mL LPS、100Nm PMA诱导细胞炎症状态，加入10μM CNN2-B或HPF孵育1小时，取出固定，DAPI染色后进行共聚焦成像。

如图5所示为分别采用实施例1的探针CNN2-B和探针HPF对不同刺激下的小鼠巨噬细胞进行染色后的荧光分布图。其中，图5A所示为采用实施例1的探针CNN2-B和DAPI对不同刺激下的小鼠巨噬细胞进行染色后的荧光图像；图5B所示为采用探针HPF和DAPI对不同刺激下的小鼠巨噬细胞进行染色后的荧光图像。从图5可以看出，CNN2-B可对泡沫细胞进行特异性成像，而不受其他炎症信号的干扰。

试验例6

本试验例对实施例1的CNN2-B特异性识别动脉粥样硬化斑块进行研究，采用颈动脉结扎配合高脂饮食制备颈动脉粥样硬化模型，具体步骤包括：

颈动脉结扎术后，高脂饮食4周，诱导ApoE小鼠定点形成动脉粥样硬化斑块。手术暴露颈动脉血管，配制10μM实施例1的CNN2-B的PBS溶液，取一小片滤纸粘上CNN2-B溶液，于血管处外部孵育10分钟，除去滤纸，进行活体成像观察。

如图6所示为实施例1的CNN2-B的荧光强度随时间的变化图。从图6可以看出，CNN2-B原位给药后，随着时间的延长，逐渐显现出血管壁上的斑块位置。

如图7所示为采用不同荧光探针对斑块进行染色后的荧光分布图。从图7可以看出，CNN2-B主要定位于斑块内部的脂滴上。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。