引物探针组合、试剂及应用

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及引物探针组合、试剂及应用。

背景技术

宫颈癌是影响全球妇女的常见癌症之一，且研究已表明99.7％的宫颈癌都是由人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)造成的，HPV还可以导致其他多种癌症的发生，比如阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和口咽癌等。

HPV是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV的E6和E7基因是致癌基因，能够调控p53和pdz结构域蛋白，并靶向成视网膜母细胞瘤蛋白家族(retinoblastoma protein，pRb)发挥作用。

检测HPV的方法主要有巴氏涂片、原位杂交、细胞学检测、HPV核酸检测等，并且p16免疫组织染色也可以作为潜在的替代标记以检测HPV。目前，HPV核酸检测以及TCT检测是比较有效的检测方法，在宫颈癌筛查中发挥着很大的作用。

然而，当需要在单个反应管中同时检测多个突变或多个样本时，实时PCR在技术上会有所限制。这些限制可以通过PCR后、基于探针的荧光熔解曲线分析(fluorescencemelting curve analysis，FMCA)来解决，该技术基于熔解温度(Melting Temperature，Tm)的偏移来检测多个突变。如果使用不同荧光基团标记的多个探针，则可以检测到的突变数量将会进一步增加。

有文献报道，从低级别病变逐步发展为癌的过程中，HPV基因组会发生整合。在整合过程中，E6/E7基因持续存在，L1基因可能会丢失，在检测过程中存在漏检风险。研究发现，HPV18的L1/E1区更容易丢失，几乎所有的HPV18阳性的宫颈癌中病毒基因组会整合到人基因组上，而HPV16阳性的宫颈癌中也有≤60％的病毒基因组发生整合，因此检测mRNA则会有更高的灵敏度。

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术检测HPV核酸的方法，但分型有限，而多色熔解曲线技术的应用则可以解决这一问题。现有技术专利公开以mRNA为模板进行扩增，虽能进行多个分型，但引物探针设计难度大、成本较高，反应体系成分复杂。而以DNA为模板进行扩增，存在漏检风险，尤其是HPV16与HPV18型的漏检，对后续诊断治疗影响很大。

目前，市面上熔解曲线产品一般以DNA或RNA为靶标进行核酸检测，不同程度上存在灵敏度低、特异性低等缺点。

现有技术存在的问题还包括：

1)分型有限。大部分HPV分型试剂采用分管的形式，成本较高；

2)需-20℃储存。目前市面同类试剂盒一般是储存在-20℃条件下；

3)操作复杂。大部分试剂原理复杂、引物探针设计难度大。

发明内容

有鉴于此，本发明提供的引物探针组合、试剂及应用，能在单个反应中简便、快速、准确地检测多个型别的HPV DNA与mRNA，以达到分型的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物，包括引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6、引物7、引物8、引物9、引物10、引物11、引物12、引物13、引物14、引物15、引物16或引物17；

所述引物1具有：

(1)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物2具有：

(4)、如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或

(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物3具有：

(7)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或

(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或

(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物4具有：

(10)、如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或

(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或

(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物5具有：

(13)、如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或

(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或

(15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物6具有：

(16)、如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或

(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(16)的相同或相似；或

(18)、与如(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物7具有：

(19)、如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或

(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(19)的相同或相似；或

(21)、与如(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物8具有：

(22)、如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或

(23)、如(22)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(22)的相同或相似；或

(24)、与如(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物9具有：

(25)、如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；或

(26)、如(25)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(25)的相同或相似；或

(27)、与如(25)或(26)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物10具有：

(28)、如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；或

(29)、如(28)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(28)的相同或相似；或

(30)、与如(28)或(29)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物11具有：

(31)、如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；或

(32)、如(31)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(31)的相同或相似；或

(33)、与如(31)或(32)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物12具有：

(34)、如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；或

(35)、如(34)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(34)的相同或相似；或

(36)、与如(34)或(35)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物13具有：

(37)、如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；或

(38)、如(37)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(37)的相同或相似；或

(39)、与如(37)或(38)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物14具有：

(40)、如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；或

(41)、如(40)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(40)的相同或相似；或

(42)、与如(40)或(41)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物15具有：

(43)、如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；或

(44)、如(43)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(43)的相同或相似；或

(45)、与如(43)或(44)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物16具有：

(46)、如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列；或

(47)、如(46)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(46)的相同或相似；或

(48)、与如(46)或(47)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述引物17具有：

(49)、如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；或

(50)、如(49)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(49)的相同或相似；或

(51)、与如(49)或(50)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述多个为2个至7个。

本发明还提供了探针，包括探针1、探针2、探针3或探针4；

所述探针1具有：

(52)、如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或

(53)、如(52)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(52)的相同或相似；或

(54)、与如(52)或(53)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述探针2具有：

(55)、如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；或

(56)、如(55)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(55)的相同或相似；或

(57)、与如(55)或(8)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述探针3具有：

(58)、如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；或

(59)、如(58)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(58)的相同或相似；或

(60)、与如(58)或(59)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述探针4具有：

(61)、如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；或

(62)、如(61)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(61)的相同或相似；或

(63)、与如(61)或(62)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；

所述多个为2个至7个。

本发明还提供了引物探针组，包括组合1、组合2、组合3、组合4、组合5、组合6、组合7、组合8或组合9中的一种或多种；

所述组合1包括上述引物1、上述引物2和上述探针1；

所述组合2包括上述引物1、上述引物3和上述探针1；

所述组合3包括上述引物1、上述引物4和上述探针1；

所述组合4包括上述引物5、上述引物6和上述探针2；

所述组合5包括上述引物5、上述引物7和上述探针2；

所述组合6包括上述引物8、上述引物9和上述探针2；

所述组合7包括上述引物10、上述引物11和上述探针3；

所述组合8包括上述引物12、上述引物13和上述探针3；

所述组合9包括上述引物14、上述引物15和上述探针3。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组中所述探针1的5’端标记FAM、3’端标记BHQ1。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组中所述探针2的5’端标记ROX、3’端标记BHQ2。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组中所述探针3的5’端标记CY5、3’端标记BHQ2。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组，还包括组合10；

所述组合10包括上述引物16、上述引物17和上述探针4。

在本发明的一些具体实施方案中，上述引物探针组中所述探针4的5’端标记HEX、3’端标记BHQ1。

本发明还提供了上述引物、上述探针或上述引物探针组在如下方面中的应用：

(I)、检测HPV；和/或

(II)、对HPV进行分型；和/或

(III)、制备检测HPV的试剂、试剂盒或装置；和/或

(IV)、制备对HPV进行分型的试剂、试剂盒或装置；

所述HPV包括HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 45、HPV 52、HPV 58、HPV59或HPV 68中的一种或多种。

本发明还提供了试剂，包括上述引物、上述探针或上述引物探针组，以及可接受的辅料或助剂。

在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂包括：

限制性引物的浓度为0.02～0.05μM；和/或

非限制性引物的浓度为0.2～1μM；和/或

所述探针的浓度为0.2～0.4μM；

所述限制性引物包括上述引物1、上述引物5、上述引物8、上述引物10、上述引物12、上述引物14或上述引物16；

所述非限制性引物包括上述引物2、上述引物3、上述引物4、上述引物6、上述引物7、上述引物9、上述引物11、上述引物13、上述引物15或上述引物17。

本发明还提供了试剂盒，包括上述试剂，以及可接受的辅料或助剂。

在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂盒包括：PCR反应液1、PCR反应液2、阴性对照和阳性对照；

所述PCR反应液1包括：

(a)、pH为8.3的Tricine；和/或

(b)、DMSO；和/或

(c)、NaN

(d)、UNG酶；和/或

(e)、DNA聚合酶；和/或

(f)、dNTP；

所述DNA聚合酶包括rTth DNA聚合酶；

所述PCR反应液2包括Mn(OAc)

所述阴性对照包括含有内标特异性靶标DNA片段的假病毒溶液；

所述阳性对照包括含有内标特异性靶标DNA片段、HPV E6/E7或L1区域特异性靶标片段的假病毒溶液。

本发明还提供了HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 45、HPV 52、HPV 58、HPV 59或HPV 68的分型方法，包括利用上述引物探针组以及扩增试剂对样品进行扩增，获得熔解曲线以及熔解峰对应的温度，在阴性对照和阳性对照成立时，通过比较，获得分型结果；

其中，所述探针1的荧光通道为通道1、所述探针2的荧光通道为通道2、所述探针3的荧光通道为通道3、所述探针4的荧光通道为通道4；

所述比较包括：

(i)、若所述通道1的熔解峰对应的温度落入70±1.5℃内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV16阳性；和/或

(ii)、若所述通道1的熔解峰对应的温度落入60±1.5内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV33阳性；和/或

(iii)、若所述通道1的熔解峰对应的温度落入50±1.5℃内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV58阳性；和/或

(iv)、若所述通道2的熔解峰对应的温度落入69±1.5℃内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV18阳性；和/或

(v)、若所述通道2的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV45阳性；和/或

(vi)、若所述通道2的熔解峰对应的温度落入50±1.5℃内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV59阳性；和/或

(vii)、若所述通道3的熔解峰对应的温度落入67±1.5℃内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV31阳性；和/或

(viii)、若所述通道3的熔解峰对应的温度落入63±1.5℃内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV52阳性；和/或

(ix)、若所述通道3的熔解峰对应的温度落入49±1.5℃内，且所述通道4的熔解峰对应的温度落入61±1.5℃内，则所述样品呈HPV68阳性。

本发明的引物探针组和试剂盒有如下效果：

本发明能够在单个反应中简便、快速、准确地检测多个型别的HPV DNA与mRNA，以达到分型的目的。本发明运用不对称PCR技术-熔解曲线技术，可以在单管中对HPV 16、18、31、33、45、52、58、59、68型这9种型别的DNA与mRNA片段进行荧光PCR检测、分型。

灵敏度实验表明，使用TE溶液将第二代人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品中在检测范围内的HPV型别稀释至1×10

特异性实验表明，使用TE溶液将第二代人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品中不在检测范围内的HPV型别稀释至1×10

重复性实验表明，采用本发明的引物探针组对HPV 16、18、31、33、45、52、58、59、68型进行检测，结果显示各型别Tm值差值较小、重复性较好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示HPV 16型在FAM通道的Tm值及熔解曲线；

图2示HPV 33型在FAM通道的Tm值及熔解曲线；

图3示HPV 58型在FAM通道的Tm值及熔解曲线；

图4示HPV 18型在ROX通道的Tm值及熔解曲线；

图5示HPV 45型在ROX通道的Tm值及熔解曲线；

图6示HPV 59型在ROX通道的Tm值及熔解曲线；

图7示HPV 31型在CY5通道的Tm值及熔解曲线；

图8示HPV 52型在CY5通道的Tm值及熔解曲线；

图9示HPV 68型在CY5通道的Tm值及熔解曲线；

图10示内标在HEX通道的Tm值及熔解曲线；

图11示HPV 16、33、58型混合阳性假病毒在FAM通道的熔解曲线；

图12示HPV 18、45、59型混合阳性假病毒在ROX通道的熔解曲线；

图13示HPV 31、52、68型混合阳性假病毒在CY5通道的熔解曲线；

图14示HPV 58型在FAM通道的Tm值及熔解曲线；

图15示HPV 52型在CY5通道的Tm值及熔解曲线；

图16示HPV 18型在ROX通道的Tm值及熔解曲线；

图17示HPV 16型在FAM通道的Tm值及熔解曲线；

图18示HPV 68型在CY5通道的Tm值及熔解曲线；

图19示HPV 18、45、59型在ROX通道的Tm值及熔解曲线；

图20示HPV 16、33、58型在FAM通道的Tm值及熔解曲线；

图21示HPV 58型在FAM通道的Tm值及熔解曲线；

图22示HPV 52型在CY5通道的Tm值及熔解曲线；

图23示HPV 59型在ROX通道的Tm值及熔解曲线。

具体实施方式

本发明公开了引物探针组合、试剂及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

现有的熔解曲线产品一般以DNA或RNA为靶标进行核酸检测，不同程度上存在操作复杂，灵敏度低、特异性低等缺点，而本发明的引物探针组合或试剂，部分型别以E6/E7mRNA为模板，部分型别以L1区DNA为模板，则分型的同时可以兼顾灵敏度，避免漏检情况的发生，利于后面的疾病的诊断治疗等。目前市面同类试剂盒一般是储存在-20℃条件下，而本发明的试剂可以实现2～8℃保存1年。大部分试剂原理复杂、引物探针设计难度大、操作复杂，而本发明操作简单，易于实现。

本发明的目的在于能够在单个反应中简便、快速、准确地检测多个型别的HPV DNA与mRNA，以达到分型的目的。本发明运用不对称PCR技术-熔解曲线技术，可以在单管中对HPV 16、18、31、33、45、52、58、59、68型这9种型别的DNA与mRNA片段进行荧光PCR检测、分型。

具体地：

1、引物探针设计

本发明中针对高流行率的HPV16、18、31、33、45、52、58、59、68型的E6/E7或L1区段设计特异性引物与探针，FAM、ROX通道检测E6/E7 mRNA，CY5通道检测L1 DNA。

本发明提供了一种引物组，包括10个引物对中的至少1个引物对，引物、探针序列如下：

(1)用于检测HPV16型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、5所示；

(2)用于检测HPV33型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、3、5所示；

(3)用于检测HPV58型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、4、5所示；

(4)用于检测HPV18型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6、7、11所示；

(5)用于检测HPV45型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6、8、11所示；

(6)用于检测HPV59型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示；

(7)用于检测HPV31型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、13、18

所示；

(8)用于检测HPV52型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14、15、18所示；

(9)用于检测HPV68型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16、17、18所示。

(10)用于检测内标的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19、20、21所示。

SEQ ID NO:1：TGCGACGTGAGGTATATGACTTTG

SEQ ID NO:2：GTTGTTCCATACAAACTATAACA

SEQ ID NO:3：AGATAAGAACCGCAAACACAGT

SEQ ID NO:4：GATAGCAATCGTAAACACACT

SEQ ID NO:5：AGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTG

(5’端标记FAM，3’端标记BHQ1)

SEQ ID NO:6：CCGACGAGCCGAACCACA

SEQ ID NO:7：GGACACACAAAGGACAGGGTGTTC

SEQ ID NO:8：CGGACACACAAAGGACAAGGTGCT

SEQ ID NO:9：GTTTCTTCCCAGGCTGCTACTGAT

SEQ ID NO:10：ATTTGAAAAGGTGCTAGATGCCG

SEQ ID NO:11：ATGTTGTGTATGTGTTGTAAGT

(5’端标记ROX，3’端标记BHQ2)

SEQ ID NO:12：GGATTTCCTGATACATCTTTT

SEQ ID NO:13：CAGGACCACCGGCATATCTATTA

SEQ ID NO:14：GGTTTTCCAGATACATCT

SEQ ID NO:15：GGTTTACCAGCATATTTGTTACTG

SEQ ID NO:16：GGGTTTCCCTACCTGATCCTAAT

SEQ ID NO:17：CAGTAACAAATATGCTGGTAAACC

SEQ ID NO:18：TAATCCTGAAACTCAACGCTTAGTTTG

(5’端标记CY5，3’端标记BHQ2)

SEQ ID NO:19：CTACTCCCAGGAGCAGGGAG

SEQ ID NO:20：GTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTG

SEQ ID NO:21：GGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCT

(5’端标记HEX，3’端标记BHQ1)

所述探针的Taqman探针，长度为10～40bp，优选为20～30bp。

所述探针的5’端可标记为荧光报告基团，可为FAM、HEX、JOE、HEX、ROX或CY5；3’端可标记为荧光淬灭基团，可为BHQ1或BHQ2；

优选地，检测HPV16、HPV33、HPV58的Taqman探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ1；

优选地，检测HPV18、HPV45、HPV59的Taqman探针5’端标记ROX，3’端标记BHQ2；

优选地，检测HPV31、HPV52、HPV68的Taqman探针5’端标记CY5，3’端标记BHQ2；

优选地，检测内标的Taqman探针5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。

其中，所述引物和探针组合中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQIDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19为限制性引物，所述限制性引物的浓度为0.02～0.05μM；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20为非限制性引物，所述非限制性引物的浓度为0.2～1μM；所述探针的浓度为0.2～0.4μM。

本发明提供了一种检测HPV DNA与mRNA的引物、探针组合及分型试剂，包括PCR反应液1、PCR反应液2，阴性对照、阳性对照。

所述PCR反应液1中含有Tricine(pH 8.3)、DMSO、NaN

一些具体实施例中，所述PCR反应液1包括：Tricine(pH 8.3)100mM、DMSO 2％、NaN

所述DNA聚合酶为rTth DNA聚合酶。

阴性对照：所述阴性对照为含有内标特异性靶标DNA片段的假病毒溶液。

阳性对照：所述阳性对照为含有内标特异性靶标DNA片段、HPV E6/E7或L1区域特异性靶标片段的假病毒溶液。

2、核酸提取：

采用磁珠法提取样本核酸，并同时提取阴性对照、阳性对照。核酸提取完成后，可立即用于PCR检测，或将提取的核酸转移至离心管中，于-20℃保存，用于后续核酸检测。

3、反应体系配制：

反应体系为40μL。按顺序向扩增管中分别加入10μL PCR反应液1、5μL PCR反应液2，25μL核酸提取物，盖紧反应管，做好标记，瞬时离心，转移至PCR扩增区进行PCR检测。

4、上机检测：

在宏石SLAN 96上进行检测。项目类型选择“标准熔解曲线”，且同时选择FAM、HEX、ROX及Cy5通道；熔解曲线参数选择“Step Mode”，然后将“扫描间隔”设置为0.5℃，“恒温”设置为15s。PCR扩增程序如下：50℃2min；60℃30min；95℃3min；95℃15s，60℃30s，进行45个循环；熔解曲线分析步骤程序设置为：95℃2min；40℃2min，逐步升温至80℃，在此过程中每上升0.5℃采集荧光信号1次。

5、结果分析：

扩增反应结束后，仪器自动保存结果，可利用软件自动分析，也可手动调节基线及阈值线值进行分析。

阴性对照：FAM、ROX、CY5通道无熔解峰；

阳性对照：FAM、ROX、CY5通道均有熔解峰，且分型结果分别为HPV16、HPV18、HPV31。

各型别在各通道中的Tm值范围如表1所示：

表1

1)阴性、阳性对照均满足要求后，再对样本结果进行分析，若阴性、阳性对照不满足要求，则此次试验无效，需重新进行试验；

2)若内标在对应Tm值处有熔解峰，且FAM、ROX、CY5通道各型别在对应Tm值处有熔解曲线，则可判断为相应型别阳性；

3)若内标在对应Tm值处有熔解峰，且FAM、ROX、CY5通道各型别在对应Tm值处无熔解曲线，则可判断为相应型别阴性；

4)若内标在对应Tm值处无熔解峰，则此次试验不具备参考性，需重新进行试验。

如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：检测HPV DNA与mRNA的引物、探针试剂组合1

(一)引物、探针试剂组合1

针对高流行率的HPV16、18、31、33、45、52、58、59、68型的E6/E7或L1区段设计特异性引物与探针，FAM、ROX通道检测E6/E7mRNA，CY5通道检测L1 DNA。

引物、探针序列如下：

(1)用于检测HPV16型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、5所示；

(2)用于检测HPV33型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、3、5所示；

(3)用于检测HPV58型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、4、5所示；

(4)用于检测HPV18型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6、7、11所示；

(5)用于检测HPV45型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6、8、11所示；

(6)用于检测HPV59型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示；

(7)用于检测HPV31型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、13、18所示；

(8)用于检测HPV52型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14、15、18所示；

(9)用于检测HPV68型的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16、17、18所示。

(10)用于检测内标的引物对、探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19、20、21所示。

SEQ ID NO:1：TGCGACGTGAGGTATATGACTTTG

SEQ ID NO:2：GTTGTTCCATACAAACTATAACA

SEQ ID NO:3：AGATAAGAACCGCAAACACAGT

SEQ ID NO:4：GATAGCAATCGTAAACACACT

SEQ ID NO:5：AGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTG

(5’端标记FAM，3’端标记BHQ1)

SEQ ID NO:6：CCGACGAGCCGAACCACA

SEQ ID NO:7：GGACACACAAAGGACAGGGTGTTC

SEQ ID NO:8：CGGACACACAAAGGACAAGGTGCT

SEQ ID NO:9：GTTTCTTCCCAGGCTGCTACTGAT

SEQ ID NO:10：ATTTGAAAAGGTGCTAGATGCCG

SEQ ID NO:11：ATGTTGTGTATGTGTTGTAAGT

(5’端标记ROX，3’端标记BHQ2)

SEQ ID NO:12：GGATTTCCTGATACATCTTTT

SEQ ID NO:13：CAGGACCACCGGCATATCTATTA

SEQ ID NO:14：GGTTTTCCAGATACATCT

SEQ ID NO:15：GGTTTACCAGCATATTTGTTACTG

SEQ ID NO:16：GGGTTTCCCTACCTGATCCTAAT

SEQ ID NO:17：CAGTAACAAATATGCTGGTAAACC

SEQ ID NO:18：TAATCCTGAAACTCAACGCTTAGTTTG

(5’端标记CY5，3’端标记BHQ2)

SEQ ID NO:19：CTACTCCCAGGAGCAGGGAG

SEQ ID NO:20：GTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTG

SEQ ID NO:21：GGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCT

(5’端标记HEX，3’端标记BHQ1)

所述探针的Taqman探针长度为20～30bp。

检测HPV16、HPV33、HPV58的Taqman探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ1；

检测HPV18、HPV45、HPV59的Taqman探针5’端标记ROX，3’端标记BHQ2；

检测HPV31、HPV52、HPV68的Taqman探针5’端标记CY5，3’端标记BHQ2；

检测内标的Taqman探针5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。

其中，所述引物和探针组合中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQIDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19为限制性引物，所述限制性引物的浓度为0.02～0.05μM；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:20为非限制性引物，所述非限制性引物的浓度为0.2～1μM；所述探针的浓度为0.2～0.4μM。

检测HPV DNA与mRNA的引物、探针组合及分型试剂组合1包括PCR反应液1、PCR反应液2，阴性对照、阳性对照。

所述PCR反应液1包括：Tricine(pH 8.3)100mM、DMSO 2％、NaN

所述DNA聚合酶为rTth DNA聚合酶。

阴性对照：所述阴性对照为含有内标特异性靶标DNA片段的假病毒溶液。

阳性对照：所述阳性对照为含有内标特异性靶标DNA片段、HPV E6/E7或L1区域特异性靶标片段的假病毒溶液。

(二)检测方法

1、核酸提取：

采用磁珠法提取样本核酸，并同时提取阴性对照、阳性对照。核酸提取完成后，可立即用于PCR检测，或将提取的核酸转移至离心管中，于-20℃保存，用于后续核酸检测。

2、反应体系配制：

反应体系为40μL。按顺序向扩增管中分别加入10μL PCR反应液1、5μL PCR反应液2，25μL核酸提取物，盖紧反应管，做好标记，瞬时离心，转移至PCR扩增区进行PCR检测。

3、上机检测：

在宏石SLAN 96上进行检测。项目类型选择“标准熔解曲线”，且同时选择FAM、HEX、ROX及Cy5通道；熔解曲线参数选择“Step Mode”，然后将“扫描间隔”设置为0.5℃，“恒温”设置为15s。PCR扩增程序如下：50℃2min；60℃30min；95℃3min；95℃15s，60℃30s，进行45个循环；熔解曲线分析步骤程序设置为：95℃2min；40℃2min，逐步升温至80℃，在此过程中每上升0.5℃采集荧光信号1次。

4、结果分析：

扩增反应结束后，仪器自动保存结果，可利用软件自动分析，也可手动调节基线及阈值线值进行分析。

阴性对照：FAM、ROX、CY5通道无熔解峰；

阳性对照：FAM、ROX、CY5通道均有熔解峰，且分型结果分别为HPV16、HPV18、HPV31。

各型别在各通道中的Tm值范围如表1所示：

表1

1)阴性、阳性对照均满足要求后，再对样本结果进行分析，若阴性、阳性对照不满足要求，则此次试验无效，需重新进行试验；

2)若内标在对应Tm值处有熔解峰，且FAM、ROX、CY5通道各型别在对应Tm值处有熔解曲线，则可判断为相应型别阳性；

3)若内标在对应Tm值处有熔解峰，且FAM、ROX、CY5通道各型别在对应Tm值处无熔解曲线，则可判断为相应型别阴性；

4)若内标在对应Tm值处无熔解峰，则此次试验不具备参考性，需重新进行试验。

(三)实验结果

取含有HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58、HPV59、HPV68中的一种或多种型别的阳性假病毒样本按(二)所述检测方法进行检测。结果见图1～13。

实施例2：检测HPV DNA与mRNA的引物、探针试剂组合2

仅调整PCR反应液1中引物探针量，其余条件与实施例1一致。

所述PCR反应液1包括：Tricine(pH 8.3)100mM、DMSO 2％、NaN

取含有HPV58、HPV52中的一种阳性假病毒样本进行检测。结果见图14、图15。

实施例3：检测HPV DNA与mRNA的引物、探针试剂组合3

仅调整PCR反应液1中引物探针量，其余条件与实施例1一致。

所述PCR反应液1包括：Tricine(pH 8.3)100mM、DMSO 2％、NaN

取含有HPV18、HPV16中的一种阳性假病毒样本进行检测。结果见图16、图17。

实施例4：灵敏度与特异性实验

灵敏度实验：使用TE溶液将第二代人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品中在检测范围内的HPV型别稀释至1×10

表2

特异性实验：使用TE溶液将第二代人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品中不在检测范围内的HPV型别稀释至1×10

表3

实施例5：重复性实验

1、各反应液中各成分使用量与专利中实施例1中描述一致，检测68型样本，三个复孔，结果如图18所示，表明各型别Tm值差值较小、重复性较好。

2、各反应液中各成分使用量与专利中实施例1中描述一致，检测18、45、59型混合样本，三个复孔，结果如图19所示，表明各型别Tm值差值较小、重复性较好。

3、各反应液中各成分使用量与专利中实施例1中描述一致，检测16、33、58型混合样本，两个复孔，结果如图20所示，表明各型别Tm值差值较小、重复性较好。

对比例：其它引物探针组合

各反应液中各成分使用量与专利中实施例1中描述一致，且按实施例1所述检测方法进行检测，各型别引物组均做多组，择优选择，选择熔解峰高度较高的一组进行多重组合。

1、58型引物组合

HPV58型实验组为最终选用的序列组合，另两组对照组则为效果较差的序列组合，检测浓度为1×10

HPV 58对照组1-R：5'-ATACTCACTTATTTTAGATAGCAATCGT-3'(SEQ ID NO:22)

HPV 58对照组2-R：5'-CAATCGTAAACACACTTTACATACTG-3'(SEQ ID NO:23)

从图21及其中的数据可以看出，HPV58型三种组合中实验组熔解峰高度要明显高于对照组，确定HPV58型的引物探针为实验组。

2、52型引物组合

HPV52型实验组为最终选用的序列组合，另两组对照组则为效果较差的序列组合，检测浓度为1×10

HPV 52对照组1-F：5'-AGAATTAAATTGCCGGACCCTAAT-3'(SEQ ID NO:24)

HPV 52对照组1-R：5'-CCAAATTTATTAGGGTCCGGCAA-3'(SEQ ID NO:25)

HPV 52对照组2-F：5'-TTGCCGGACCCTAATAAATTTGGTT-3'(SEQ ID NO:26)

HPV 52对照组2-R：5'-TTATCTATACCAGGTTTACCAGCA-3'(SEQ ID NO:27)

从图22及其中的数据可以看出，HPV52型三种组合中实验组熔解峰高度要明显高于对

照组，确定HPV52型的引物探针为实验组。

3、59型引物组合

HPV59型实验组为最终选用的序列组合，另两组对照组则为效果较差的序列组合，检测浓度为1×10

HPV 59对照组1-F：5'-ACCTCTTGTTTCTTCCCAGGC-3'(SEQ ID NO:28)

HPV 59对照组1-R：5'-AGGAATTGTAAATGCAGTGTTGG-3'(SEQ ID NO:29)

HPV 59对照组2-F：5'-ATTGCAACCTCTTGTTTCTTCCCAG-3'(SEQ ID NO:30)

HPV 59对照组2-R：5'-TGTAAATGCAGTGTTGGCAGTACTA-3'(SEQ ID NO:31)。

从图23及其中的数据可以看出，HPV59型三种组合中实验组熔解峰高度要明显高于对照组，确定HPV59型的引物探针为实验组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。