两步制备3-羟基丙酸的方法

技术领域

本发明涉及一种制备3-羟基丙酸(3-HP)的方法和/或一种改善3-HP的生产率的方法，并且更具体地，涉及一种在高浓度下培养细胞的第一步和使用在高浓度下培养的细胞作为催化剂生产3-HP的第二步的两步制备方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求基于2020年7月31日的韩国专利申请NO.10-2020-0096238的优先权的权益，相应的韩国专利申请中公开的全部内容并入本说明书中作为本说明书的一部分。

背景技术

3-羟基丙酸是一种可以转化为各种化学物质如丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酰胺等的平台化合物。自2004年被美国能源部(DOE)评选为12大高附加值生物化学品以来，它一直受到学术界和工业界的积极研究。

3-HP的生产主要由化学方法和生物方法这两种方法构成，但是在化学方法的情况下，由于初始材料昂贵并且在生产过程中生产有毒物质，被指出不是环境友好的，因此，环境友好的生物工艺成为了关注的焦点。

葡萄糖和甘油主要用作使用微生物进行3-HP生物合成的底物，并且目前，主要进行对3-HP生产和细胞生长同时发生的一步发酵法的研究。

然而，在如上所述的第一步生产的过程中，用于生产3-HP的底物也用于细胞的生长，因此，产生诸如乙酸盐或乳酸盐的副产物，从而存在3-HP的收率和生产率下降的问题。由于这种低收率和生产率，尽管有3-HP的可能性，但是还未实现商业化。

发明内容

技术问题

本申请的一个实例是提供一种制备3-羟基丙酸(3-HP)的方法，包括：(1)高浓度细胞培养3-羟基丙酸(3-HP)生产菌株；和(2)通过分离在高浓度下培养的细胞并将它们接种和/或培养到用于生产3-羟基丙酸的培养基中来生产3-羟基丙酸，和/或一种改善3-HP的生产率的方法。

通过所述两步制备方法，可以改善由于细胞的生长或副产物的产生引起的3-HP生产率的劣化。

另一实例提供一种包含高浓度的3-羟基丙酸的3-羟基丙酸生产菌株的培养液。在一个实例中，所述培养液可以通过上述两步制备方法来制备。所述培养液可以用于生产3-羟基丙酸。

技术方案

一个实例

提供一种制备3-羟基丙酸的方法，和/或一种改善3-HP的生产率的方法，包括：

(1)高浓度细胞培养3-羟基丙酸(3-HP)生产菌株；和

(2)通过分离在高浓度下培养的细胞并将它们接种和/或培养到用于生产3-羟基丙酸的培养基中来生产3-羟基丙酸。

另一实例提供一种包含高浓度的3-羟基丙酸的3-羟基丙酸生产菌株的培养液。该培养液可以用于生产3-羟基丙酸。该培养液可以通过所述制备方法来制备。

下文中，将更详细地描述本发明。

两步3-HP生产

(1)3-HP生产菌株的高浓度培养步骤

本文中提供的制备3-HP的方法和/或改善3-HP的生产率的方法包括：(1)高浓度培养3-羟基丙酸生产菌株。

所述3-羟基丙酸生产菌株可以在能够生产3-羟基丙酸的所有天然或转基因重组微生物中选择。在一个实例中，所述微生物可以选自如下微生物，埃希氏菌属(Escherichiasp.)(例如，大肠杆菌等)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、肠杆菌属(Enterobacteriasp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella sp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)、梭状芽胞杆菌属(Clostridiumsp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、酵母菌属(Saccharomyces sp.)和曲霉菌属(Aspergillus sp.)，但不限于此。在一个具体实例中，所述3-羟基丙酸生产菌株可以是大肠杆菌。

所述3-羟基丙酸生产菌株可以包含编码选自甘油脱水酶和醛脱氢酶中的一种或多种或两种蛋白质的基因。在一个实例中，所述3-HP生产菌株还可以包含编码甘油脱水酶再激活酶(GdrAB)的基因(gdrAB)。在一个实例中，所述3-HP生产菌株可以是能够进一步生物合成维生素B

所述甘油脱水酶可以通过dhaB(基因库保藏号：U30903.1)基因编码，但不限于此。所述dhaB基因可以是来自克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumonia)的酶，但不限于此。编码甘油脱水酶的基因可以包含编码dhaB1、dhaB2和/或dhaB3的基因。所述甘油脱水酶蛋白质和编码它的基因在保持将甘油降解为3-羟基丙醛(3-HPA)和水(H

编码醛脱氢酶(ALDH)的基因(aldH)可以是，例如，来自大肠杆菌(Escherichiacoli)或大肠杆菌K12 MG1655细胞系的aldH(基因库保藏号：U00096.3；EaldH)基因、来自克雷白氏肺炎杆菌(K.pneumonia)的puuC基因和/或来自巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)的KGSADH基因，但不限于此。醛脱氢酶蛋白质和编码它的基因可以在保持由3-HPA生产3-HP的活性的范围内包含基因和/或氨基酸序列的突变体。

编码甘油脱水酶再激活酶(GdrAB)的基因可以是来自克雷白氏肺炎杆菌(K.pneumonia)的gdrAB基因。

所述3-HP生产菌株可以包含重组载体，该重组载体包含：编码选自甘油脱水酶、醛脱氢酶和甘油脱水酶再激活酶中的一种以上、两种以上或全部三种蛋白质的基因。

所述重组载体可以通过本领域已知的方法，在为了在细胞内表达编码选自甘油脱水酶、醛脱氢酶和甘油脱水酶再激活酶中的一种或更多种、两种或更多种或者全部三种蛋白质的基因的目的的范围内，通过替代启动子或调节位点来使用。

所述高浓度培养可以使用本领域已知的方法，在为了确保大量的3-HP生产菌株的范围内进行而没有限制，并且在一个实例中，所述培养可以通过流加培养来进行。

在一个实例中，流加培养可以通过恒定pH(pH-stat)法、连续补料培养法或它们的组合进行。在一个实施方案中，当进行恒定pH法的流加培养时，可以以1g/L至5g/L的浓度加入葡萄糖，但不限于此。在一个实施方案中，当进行连续补料培养的流加培养时，可以以10g/L/h至20g/L/h的浓度注入葡萄糖，但不限于此。

在一个实例中，在高浓度培养的过程中，pH值可以保持在5至7.5、5至7、5.5至7.5、5.5至7、6至7.5或6.5至6，但不限于此。

在一个实例中，在高浓度培养的过程中，作为碳源，在目的范围内可以选择和使用单糖、二糖和/或多糖，而没有限制。例如，碳源可以是选自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和纤维素二糖中的一种以上、两种以上、三种以上、四种以上、五种以上、十种以上、或全部11种的组合。在高浓度培养过程中使用的培养基可以不包含甘油作为碳源。这样，由于高浓度培养过程中使用的培养基不包含甘油，因此在高浓度步骤中不会产生3-HP。

在一个实例中，在高浓度培养之后，基于OD

在一个实例中，在高浓度培养之后，基于每1L培养基的细胞干重(g)，细胞浓度可以为10至100g/L、10至80g/L、10至50g/L、10至40g/L、10至35g/L、15至100g/L、15至80g/L、15至50g/L、15至40g/L、15至35g/L、20至100g/L、20至80g/L、20至50g/L、20至40g/L、20至35g/L、25至100g/L、25至80g/L、25至50g/L、25至40g/L或25至35g/L，但不限于此。

(2)3-HP生产步骤

本文中提供的3-HP的制备方法和/或改善3-HP的生产率的方法包括：(2)通过分离在高浓度下培养的细胞并将它们接种和/或培养在用于生产3-羟基丙酸的培养基中来生产3-羟基丙酸。

分离在高浓度下培养的细胞可以通过包括离心分离细胞、去除上清液和用缓冲液使颗粒重新悬浮中的一种以上、两种以上或全部步骤来进行。在一个实例中，缓冲液可以是PBS(磷酸盐缓冲盐水)，但不限于此。

用于生产3-羟基丙酸的培养基可以在使得菌株能够生产3-HP，而不使3-HP生产菌株进一步生长的范围内不受限制地使用。

在一个实例中，用于生产3-羟基丙酸的培养基的碳源可以是甘油，但不限于此。在一个实例中，用于生产的培养基还可以包含维生素B

在一个实例中，所述培养基可以是合成培养基或半合成培养基，但不限于此。

在高浓度下培养的细胞的接种中，在为了3-HP生产的目的的范围内，本领域技术人员可以适当地改变细胞接种浓度。在一个实例中，接种过程中的细胞浓度(基于每1L培养基的细胞干重(DCW))可以为1g/L至20g/L、1g/L至16g/L、1g/L至12g/L、1g/L至9g/L、2g/L至20g/L、2g/L至16g/L、2g/L至12g/L、2g/L至9g/L、4g/L至20g/L、4g/L至16g/L、4g/L至12g/L或4g/L至9g/L，但不限于此。

生产3-羟基丙酸可以在为了生产3-HP的范围内选择和使用本领域已知的培养方法而没有限制，并且在一个实例中，所述培养可以通过发酵培养来进行。

在生产3-HP时，不会发生接种的细胞的增殖。在一个实例中，在生产的最后，细胞数目可以是生产开始时接种的细胞数目的150％以下、130％以下、100％以下、90％以下、80％以下、50％至150％、50％至130％、50％至100％、50％至90％、50％至80％、70％至150％、70％至130％、70％至100％、70％至90％或70％至80％，但不限于此。

本文中提供的制备3-HP的方法和/或改善3-HP的生产率的方法的3-HP收率可以为，例如，基于培养(3-HP生产)29小时，为80％以上、85％以上、90％以上、93％以上或95％以上，但不限于此。3-HP收率可以计算为与步骤(2)中培养基中的甘油的用量(摩尔数)相比的培养基中的3-HP生产量，并且在一个实例中，可以按照下面等式1计算。

[等式1]

收率(％)＝(最终3-HP(g))/{(发酵之前的甘油(g))-(发酵之后剩余的甘油)(g)}

本文中提供的制备3-HP的方法和/或改善3-HP的生产率的方法的3-HP生产率(每1L培养基1小时的3-HP生产量(g))可以为2.0g/L/h以上、2.5g/L/h以上、2.0g/L/h至30g/L/h、2.0g/L/h至20g/L/h、2.0g/L/h至10g/L/h、2.0g/L/h至5g/L/h、2.5g/L/h至30g/L/h、2.5g/L/h至20g/L/h、2.5g/L/h至10g/L/h或2.5g/L/h至5g/L/h，但不限于此。

在一个实施方案中，作为通过本发明的用于制备3-HP的两步法制备3-HP的结果，生产率测量为2.94g/L/h，并且这是迄今为止文献中报道的最高值。

本文中提供的制备3-HP的方法和/或改善3-HP的生产率的方法的3-HP生产量可以为，例如，基于20小时至30小时(例如，20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时或30小时)的培养(3-HP生产)过程中每1L培养基的3-HP含量(g)，为40g/L以上、41g/L以上、42g/L以上、43g/L以上、44g/L以上、45g/L以上、46g/L以上、47g/L以上、48g/L以上、49g/L以上、50g/L以上、51g/L以上、52g/L以上或53g/L以上(上限可以选自60g/L至1000g/L而没有特别地限制，例如，可以为1000g/L、500g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L或60g/L，但不限于此)。

本文中提供的制备3-HP的方法和/或改善3-HP的生产率的方法不会产生根据3-HP生产的副产物。所述副产物可以是乙酸盐和/或乳酸盐。在一个实例中，副产物可以以在总培养液中的浓度为1％(w/v)以下、0.5％(w/v)以下、0.1％(w/v)以下、0.01％(w/v)以下、0.001％(w/v)以下、0.0001％(w/v)以下或0.00001％(w/v)以下产生(那么，副产物的浓度的下限可以选自0(w/v)至0.000001(w/v)，但不限于此)，或者可以以浓度为0％(w/v)产生(在可检测的浓度下不产生副产物)。

本文中提供的制备3-HP的两步法的3-HP收率(％)可以比其中细胞生长和3-HP生产同时发生的一步发酵法高1.05倍以上或1.1倍以上，例如，高1.05倍至10倍以上、高1.05倍至5倍以上、高1.05倍至2倍以上、高1.05倍至1.7倍以上、高1.05倍至1.5倍以上、高1.05倍至1.2倍以上、高1.1倍至10倍以上、高1.1倍至5倍以上、高1.1倍至2倍以上、高1.1倍至1.7倍以上、高1.1倍至1.5倍以上或高1.1倍至1.2倍以上，例如，高约1.13倍。

本文中提供的制备3-HP的两步法的3-HP生产率(g/L/h)可以比一步发酵法高1.1倍以上、1.3倍以上或1.5倍以上，例如，可以高1.1倍至10倍、高1.1倍至5倍、高1.1倍至3倍、高1.1倍至2.5倍、高1.1倍至2倍、高1.3倍至10倍、高1.3倍至5倍、高1.3倍至3倍、高1.3倍至2.5倍、高1.3倍至2倍、高1.5倍至10倍、高1.5倍至5倍、高1.5倍至3倍、高1.5倍至2.5倍、高1.5倍至2倍、高1.9倍至3倍、高1.9倍至2.5倍或高1.9倍至2倍，例如，可以高约1.96倍。

本文中提供的制备3-HP的两步法还可以包括：在(2)通过分离在高浓度下培养的细胞并将它们接种和/或培养在用于生产3-羟基丙酸的培养基中来生产3-羟基丙酸之后，从培养液中分离、收集和/或纯化3-羟基丙酸。

包含3-HP的培养液

本申请的另一实例提供一种包含高浓度的3-羟基丙酸的3-羟基丙酸生产菌株的培养液。该培养溶液可以不包含或包含细胞(3-羟基丙酸生产菌株)。该培养液可以不包含葡萄糖。

所述3-羟基丙酸生产菌株与上述相同。

所述培养液中的3-羟基丙酸可以为41g/L以上、42g/L以上、43g/L以上、44g/L以上、45g/L以上、46g/L以上、47g/L以上、48g/L以上、49g/L以上、50g/L以上、51g/L以上、52g/L以上或53g/L以上(上限可以选自60g/L至1000g/L而没有特别的限制，例如，可以为1000g/L、500g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L或60g/L，但不限于此)。在培养液中，选自乙酸盐和乳酸盐的副产物的浓度可以为1％(w/v)以下、0.5％(w/v)以下、0.1％(w/v)以下、0.01％(w/v)以下、0.001％(w/v)以下、0.0001％(w/v)或0.00001％(w/v)以下(那么，副产物的浓度的下限可以选自0％(w/v)至0.000001％(w/v)，但不限于此)，或者可以为0％(w/v)。

所述培养液可以通过上述步骤(1)和步骤(2)获得。

所述培养液可以用于生产3-羟基丙酸。

其它实例提供一种用于生产包含所述培养液的3-羟基丙酸的组合物。

其它实例提供一种生产3-羟基丙酸的方法，包括从用于生产3-羟基丙酸的所述组合物中分离、收集和/或纯化3-羟基丙酸。

有益效果

本发明提供的制备3-HP的两步法可以有效地用于3-HP的商业化，因为与一步培养相比，3-HP的生产率和收率显著改善。

附图说明

图1是示出作为根据本发明的一个实例的进行高浓度细胞培养3-HP生产菌株的结果，根据时间变化的OD变化的图。

图2是示出将根据本发明的一个实例在高浓度下培养的3-HP生产菌株接种后在用于生产3-HP培养基(0小时)中之后，测量随时间变化的3-HP(3HP)、甘油、乙酸盐和乳酸盐的浓度的结果的图。

具体实施方式

下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明的内容，但本发明的范围并不受以下实施例的限制。

除非本文中另外提及，否则所有温度均基于摄氏度，并且核酸序列从5′端到3′端进行描述，除非存在特定情况。

实施例1.3-HP生产菌株的高浓度细胞培养

1-1.3-HP生产菌株的制备

制备其中引入有编码甘油脱水酶和醛脱氢酶的基因的重组载体，所述基因已知使用甘油作为底物来生产3-羟基丙酸(3-HP)。通过将制备的重组载体引入到大肠杆菌W3110菌株中来生产3-HP生产菌株。

具体地，通过在质粒pCDF中克隆编码甘油脱水酶的基因(dhaB)、编码醛脱氢酶的基因(aldH)和编码甘油脱水酶再激活酶的基因(gdrAB)，来制备用于生产3-HP的重组载体(pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH)。

用于生产重组载体的pCDFDuetJ23载体是pCDFDuet-1载体的启动子部分被J23101和J23100启动子取代的载体。使用下面表1的引物将插入到载体中的dhaB(U30903.1；约2.7kb；包括dhaB1、dhaB2和dhaB3)和gdrAB基因(约2.2kb；gdrA、gdrB)在克雷白氏肺炎杆菌(ATCC 25955)的染色体中扩增。由于dhaB123和gdrA基因并排位于克雷白氏肺炎杆菌的染色体上，因此，它们被一起扩增，并且由于gdrB位于dhaB123和gdrA的相反方向，因此，仅gdrB被单独扩增。

使用由下面表1的核酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6组成的启动子对，扩增aldH基因并从大肠杆菌K12 MG1655菌株的基因组中分离。在下面表1中，示出了用于扩增各个基因的引物的核酸序列，并且在名称中，“-F”表示正向启动子，“-R-”表示反向启动子。

[表1]

各个基因扩增后，在pCDFDuetaJ23载体的J23101启动子的下游克隆使用限制酶EcoRI和HindIII的dhaB123和gdrA基因，以及使用限制酶HindIII和AflII的gdrB基因。使用限制酶KpnI和NdeI在J23108启动子的底部克隆aldH。各个基因的克隆方法通过本领域已知的方法进行。

通过电穿孔将质粒引入大肠杆菌W3110(KCCM 40219)中来制备3-HP生产菌株。

1-2.细胞的高浓度培养

通过流加培养法，用5L的发酵罐(工作体积为2L)将制备的3-HP生产菌株在高浓度下细胞培养。

具体地，通过加入20g/L的葡萄糖和25mg/L的抗生素(链霉素)来使用MR培养基(6.67g的KH

对于流加培养，使用恒定pH进料方法，并以3g/L加入葡萄糖。

随着培养时间的推移，通过使用紫外光分光仪测量吸光度(光密度，OD)来测量细胞浓度。在图1中，示出了OD

在结束20小时的高浓度细胞培养之后，通过在4摄氏度下以6,000rpm离心分离细胞培养液10分钟来收集细胞。将收集的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)悬浮并用于下面步骤。

实施例2.3-HP生产步骤

通过在不含葡萄糖的M9培养基中加入70g/L的甘油和维生素50uM的B

将3-HP生产的培养条件保持为温度为35℃，搅拌速率为300rpm，曝气为1vvm，并且使用Ca(OH)

在3-HP生产过程中通过高压液相色谱(HPLC)测量3-HP、甘油、乙酸盐和乳酸盐的浓度随时间的变化，结果示于下面表2和图2中。表2是在用于生产3-HP的培养步骤(两步培养)中接种之后，根据发酵时间测量3-HP、甘油、乙酸盐和乳酸盐的浓度(g/L)的结果。

[表2]

如图2中所确认，在将菌株接种到用于生产3-HP的培养基中17小时后，3-HP浓度显示为50.0g/以上，生产率确认为2.94g/L/h，因此，确认了迄今为止文献中报告的数值中最高的3-HP生产率。

当接种经过29小时之后，最终3-HP浓度确认为53.3g/L，收率为约95.7％，表现出非常优异的收率和3-HP生产率，而在经过29小时几乎没有产生作为3-HP生产的副产物的乳酸盐和乙酸盐。

比较例1.与3-HP一步生产法的比较

为了将本申请中提供的使用不含葡萄糖的用于生产3-HP的培养基的两步生产法与常规的一步生产法的3-HP生产率进行比较，通过流加培养法培养在实施例1-1中制备的3-HP生产菌株，并且通过向培养基中添加细胞生长所需要的葡萄糖和作为底物的甘油来同时进行细胞生长和3-HP生产(一步生产法)。

为了比较而进行的一步生产工艺具体描述如下：通过向实施例1-2的MR培养基中加入20g/L的葡萄糖和25mg/L的选择用抗生素(链霉素)来使用培养基，并保持35摄氏度的温度。使用氨水将pH保持在6.95，并且通过逐步提高搅拌速率至900rpm来将溶解氧(DO)的量保持在20％，并将曝气保持为1vvm。

当初始加入在培养基中的葡萄糖被消耗完时，以连续补料法加入3g/L的葡萄糖，并且在培养20小时之后以70g/L加入甘油。后续过程以与实施例2相同的方式进行。

通过高压液相色谱(HPLC)测量由3-HP生产工艺制备的3-HP的收率和生产率。以这种方式得到的3-HP的收率和生产率的结果示于下面表3中，并与在实施例1和实施例2中进行的3-HP两步生产过程得到的3-HP的收率和生产率进行比较。

[表3]

如上面表3中所确认，与常规的一步生产法相比，3-HP两步生产法具有优异的3-HP收率和生产率。此外，由于不同于一步生产法，在3-HP两步生产法中没有产生作为副产物的乙酸盐和乳酸盐，因此，确认3-HP两步生产法的优异性。

<110>株式会社LG化学.

<120>两步制备3-羟基丙酸的方法

<130>OPP20211818KR

<150>10-2020-0096238

<151>2020-07-31

<160>6

<170>koPatentIn 3.0

<210>1

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dhaB-gdrA-F

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gaattcatga aaagatcaaa acgatttgca gtcct35

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dhaB-gdrA-R

<400>2

aagcttgatc tcccactgac caaagctgg 29

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<211>38

<212>DNA

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<223>gdrB-F

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<213>人工序列

<220>

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<400>6

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