一种检测盐酸艾司洛尔注射液杂质的方法

技术领域

本发明涉及艾司洛尔注射液杂质的检测方法，特别是一种检测盐酸艾司洛尔注射液杂质的方法。

背景技术

近年来，随着分析技术的飞速发展，以及国内相关部门对仿制药一致性评价的高度重视，杂质的研究已从之前“单纯地限度控制”过渡到“全面杂质谱”的策略升级，但杂质研究的“瓶颈”问题任然不容忽视。1.杂质对照品问题：大部分杂质对照品无法获得或是购买价格极高,国内药品标准中已知杂质收载数量远少于国外药品标准,其中一个重要原因就是相应的杂质对照品无法提供。2.采用相对保留时间定位特殊杂质时，方法的耐用性差：为解决杂质对照品无法获得的难题，现行标准中部分采用相对保留时间定位特殊杂质，但研究表明流动相所用试剂品牌的多样性，同类型色谱柱填料的差异性和所用仪器的变化性均可导致相对保留时间的无法重现，更严重的是因色谱峰定位错误导致目标杂质未有效控制从而影响药物的安全性。3.没有紫外吸收的杂质和微量杂质：现行“杂质谱”的研究仍多采用紫外检测器，没有紫外吸收的杂质在这种“杂质谱”中成为“隐身”成分，另很多微量的杂质也因检测器的灵敏度问题，得不到有效的评价和控制。4.杂质信息的共享与应用：已有文献报道的杂质结构或根据警示结构推测的可能存在的基因毒性杂质结构，在不同实验室之间因无法有效定位并定性，严重影响资源的共享和利用。5.仿制药一致性评价中“假阳性”和“假阴性”问题：通过“杂质谱”的对比来评价仿制药与原研药的有关物质的一致性，“杂质谱”图中色谱峰的重叠、包裹，特别是目标杂质与干扰物质光谱行为一致的情况下，容易因误判导致“假阳性”和“假阴性”结论。因此，针对上述问题，寻找一种合适的方法，快速便捷地解决相应问题，完善和推进药物有关物质一致性评价研究迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种检测盐酸艾司洛尔注射液杂质的方法，实现快速、准确寻找盐酸艾司洛尔注射液中目标杂质的方法，可应用于仿制药一致性评价研究。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种检测盐酸艾司洛尔注射液杂质的方法，包括以下步骤：

S1、分别将不同批次的盐酸艾司洛尔注射液用水稀释，制得供试品溶液；

S2、对S1中的供试品溶液进行液相-质谱检测分析，获取所有杂质的相对峰面积与保留时间；

S3、S2中得到的数据通过质量亏损技术筛选出供试品溶液中可能存在的杂质；

S4、多元分析法分析S2中的结果，区分不同批次的盐酸艾司洛尔注射液与原研药杂质谱的区别，筛选杂质特异性标志物；

S5、将S4中多元分析法的结果结合S3中质量亏损结果得到不同批次的盐酸艾司洛尔注射液与原研药有关物质一致性评价的特异性标志物杂质。

在本发明的一个优选的实施例中，S3中质量亏损技术包括正离子模式下以艾司洛尔、艾司洛尔酸和艾司洛尔二聚体为模板，筛选单体类型杂质和二聚体类型杂质。

在本发明的一个优选的实施例中，S3中质量亏损技术的模板的质量范围为模板分子量±100Da，质量亏损范围为模板分子量质量亏损值±100mDa。

在本发明的一个优选的实施例中，S3中质量亏损技术的模板的质量范围为±100Da，质量亏损范围为模板分子量质量亏损值±100mDa。质量范围和质量亏损范围设定为±50Da和±50mDa时导致筛选化合物较少容易漏掉同系物，150Da导致筛选化合物较多但容易出现假阳性混淆结果。

在本发明的一个优选的实施例中，S2中液相-质谱检测分析包括通过超高效液相色谱串联高分辨率质谱对不同批次盐酸艾司洛尔注射液的供试品溶液进行数据的采集，获得全杂质谱的检测多峰图，对色谱峰进行峰提取与校正，获取所有杂质的相对峰面积与保留时间。

在本发明的一个优选的实施例中，S2中，所述液相-质谱检测分析采用超高效液相色谱串联高分辨率质谱，为超高效液相色谱四级杆静电场轨道阱高分辨质谱，色谱柱为C18，1.8μm，2.1mm×100mm；

色谱条件为：流动相为5mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1％甲酸)-乙腈，梯度洗脱的程序为0～20min，10～50％乙腈；20～25min，50％～80％乙腈；25～28min，80％～10％乙腈；28～35min，10％～10％乙腈；流速0.26～0.34mL/min；柱温27～32℃；进样体积为1.8～2.2μL；质谱主要包括：正离子模式检测，裂解电压4.50kV，辅助气流量10mL/min，离子传输管温度320℃，辅助气温度350℃；扫描模式：Full MS/dd-MS

在本发明的一个优选的实施例中，S4中多元分析法包括采用多元统计法对S2中结果进行分析，依次进行主成分分析、层次聚类分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析，最后根据变量权重值和t检验中P值分析筛选差异标志物，得到区分鉴别模型评价不同生产企业与原研药杂质谱。

在本发明的一个优选的实施例中，S4中，以变量重要性>1，显著性水平<0.05作为门槛值获取杂质差异标志物。

在本发明的一个优选的实施例中，S5中，测定的主要杂质差异标志物为杂质Ⅰ与杂质Ⅱ。

质量亏损技术筛选中质量范围为模板分子量±100Da，质量亏损值范围为模板分子量质量亏损值±100mDa，选择以上参数范围实现可较好筛选艾司洛尔相关同系物。如果窗口范围过窄容易漏掉部分同系物，如果窗口范围过大容易出现假阳性同系物，。

在本发明的一个优选的实施例中，S1中供试品溶液中的浓度为供试品溶液0.1mg/mL。

在本发明的一个优选的实施例中，S1中不同批次的盐酸艾司洛尔注射液为不同企业生产的盐酸艾司洛尔注射液。

近年来提出的质谱联用技术结合多元分析法是一种科学严谨的分析方法，主要包括科学的数据采集与处理、专业的多变量分析和高效的识别分析等。尤其适用于以复杂的混合物为研究对象，能够同时确定和量化潜在的目标物质并研究其相互关系，目前为各研究者所广泛使用的研究方法主要为非靶向及靶向研究。非靶向研究是从整体出发探索所能检测所有物质的变化规律并进一步找出样本之间的差异性物质。靶向研究，则主要是对特定的目标物质进行定量或者定性分析的一种方法。该分析方法首先是数据的预处理，先把质谱中监测得到的波谱信号转化格式变为数据信息，其中处理过程包括归一化、匹配峰、去噪音、去除异常点、对齐峰、识别峰等，然后再进行多元统计分析判断不同样本量间的相似性和差异性。处理分析方式多为聚类分析、主成分分析、判别式功能分析和非线性回归。质谱联用技术结合多元分析法的技术在多方面的研究中均取得了可靠成果：1.应用于体内代谢组学，包括脂质代谢物、药物代谢物、食物代谢物的研究，该技术通过对比分析各种不同因素导致的体内代谢产物的差异，从而找到目标差异性标志物，再通过标志物代谢通路的分析诠释疾病产生的途径或影响因素；2.应用于植物或农产品的对生长环境的适应性研究，包括各种胁迫性试验下，目标样本所含差异性成分分析，不同生产地样本的聚类分析，同一样本不同部位差异性成分分析等。3.应用于中药及制剂的质量评价，包括不同规格，不同批次样品相似度评价，非法添加物的筛选等。

质量亏损过滤技术(mass defect filter,MDF)——基于高分辨质谱数据的过滤技术，根据化合物与类似物具有相近质量亏损规律对采集的高分辨质谱数据进行处理和识别，通过一次或有限次进样从复杂背景中发现和鉴定成分的方法。根据质量亏损值接近的规律，可集群式高效鉴定成分。目前质量亏损过滤常用于质谱筛选中药中同类型化合物或单体化合物的体内代谢物的鉴定，但是在药物杂质筛查分析应用较少。在制剂中应用筛选质量亏损过滤筛选杂质也要克服辅料成分的干扰影响。

本次研究通过采用UPLC-QE-MS全面采集盐酸艾司洛尔注射液中化合物高精度分子量，以结构确证的3个化合物为母体结构，以±100Da为质量窗口，±100mDa为质量亏损值窗口，筛选母体化合物可能通过氧化、还原、水解、酯化等，在药物分子结构中引入或脱去相应基团而产生杂质的可能，特别有利于定位寻找化学结构与活性成分类似或具有渊源关系的有机杂质，即通常所说的“有关物质”。

与质量亏损规律一致的有：1.氧化反应2.还原反应3.水解反应4.酯化反应等在药品制剂制备和贮藏过程中，可能发生的影响稳定性的化学反应；如果不是与母体化合物结构相似的化合物即可排除，例如辅料中引入。

难点：1.正确和全面地选择母体化合物；2.确定合适的质量范围和质量亏损范围。实现的效果是快速准确地寻找“有关物质”。

本次研究的对象为盐酸艾司洛尔注射液(Esmolol Hydrochloride Injection)，1986年在美国问世，原研药由美国百特医疗用品公司生产。1996年在我国以新药开发上市。为超短效的选择性β1受体阻滞剂。该药在临床上使用面广，且量大，广泛用于预防器官插管的心血管反应，预防和治疗室上性心率失常以及协同硝酸甘油控制血压等。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：本发明创新性采用液相色谱-高分辨质谱采集不同生产企业的盐酸艾司洛尔注射液的杂质谱，采用多元分析法非靶向评价不同生产企业盐酸艾司洛尔注射液的杂质差异，再结合质量亏损过滤技术，以艾司洛尔、艾司洛尔酸和艾司洛尔二聚体为母体化合物，靶向分析筛选母体化合物可能通过氧化、还原、水解、酯化等，在药物分子结构中引入或脱去相应基团而产生的相关杂质。从而实现快速、准确寻找制剂中目标杂质的方法，可应用于仿制药一致性评价研究。

附图说明

图1为本发明实施例1中正离子模式的盐酸艾司洛尔注射液样品UPLC-Q-Exacitive/MS总离子流色谱图；

图2为本发明实施例1中负离子模式的盐酸艾司洛尔注射液样品UPLC-Q-Exacitive/MS总离子流色谱图；

图3为本发明实施例2中质量亏损技术中质量范围、质量亏损范围；

图4为本发明实施例2中筛选出的单体杂质EP1-EP3和EP14-18的谱图；

图5为本发明实施例2中筛选出的单体杂质EP4-5、EP7-8、EP11-13的谱图；

图6为本发明实施例3中多元分析法的结果图一；

图7为本发明实施例3中多元分析法的结果图二；

其中A：生产企业1；B：生产企业2；C：生产企业3；D：生产企业4；E：原研药；F：原料药1；G：原料药2；

图8为本发明方法的示意图；

图9为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP1结构的示意图；

图10为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP2结构的示意图；

图11为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP3结构的示意图；

图12为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP18结构的示意图；

图13为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP10结构的示意图；

图14为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP4结构的示意图；

图15为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP7结构的示意图；

图16为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP5结构的示意图；

图17为本发明实施例3中采用二级质谱裂解途径，推导验证EP12结构的示意图；

图18为系统适用性、空白辅料溶液和供试品溶液的色谱图；

其中1.艾司洛尔；2.杂质I；3.杂质Ⅱ；A.空白溶剂；B.空白辅料溶液；C.系统适用性溶液；D.对照品溶液；E～H.不同生产企业有关物质供试品溶液。

具体实施方式

实施例1

液质联用技术方法：超高效液相色谱串联高分辨率质谱为超高效液相色谱四级杆静电场轨道阱高分辨质谱，色谱柱为C18，1.8μm，2.1mm×100mm；

色谱条件为：正离子模式流动相为5mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1％甲酸)-乙腈，负离子模式流动相为5mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈，梯度洗脱的程序为0～20min，10～50％乙腈；20～25min，50％～80％乙腈；25～28min，80％～10％乙腈；28～35min，10％～10％乙腈；流速0.26～0.34mL/min；柱温27～32℃；进样体积为1.8～2.2μL；质谱主要包括：HESI离子源，正、负离子监测模式，裂解电压4.50kV(正离子)、3.00kV(负离子)，辅助气流量10mL/min，离子传输管温度320℃，辅助气温度350℃；扫描模式：Full MS/dd-MS

实施例2

质量亏损技术：本研究首次将质量亏损过滤技术应用于筛选盐酸艾司洛尔注射液杂质。S1、将盐酸艾司洛尔注射液用水稀释至含盐酸艾司洛尔浓度为0.1mg/mL，制得供试品溶液；S2、盐酸艾司洛尔注射液的检测分析：通过超高效液相色谱串联高分辨率质谱对供试品溶液进行数据的采集，获得全杂质谱的检测多峰图，对色谱峰进行峰提取与校正，获取所有杂质的相对峰面积与保留时间；S3、正离子模式下以艾司洛尔、艾司洛尔酸和艾司洛尔二聚体为模板，筛选单体类型杂质和二聚体类型杂质。每个MDF模板的质量范围为100Da，质量亏损范围为100mDa，误差为5ppm(图3)。艾司洛尔的分子量为295.1778097Da，质量亏损值为177.8097mDa，其分子量筛选窗口范围195.1778097-395.1778097Da，质量亏损值筛选为77.8097-277.8097mDa。艾司洛尔酸的分子量为281.1626998Da，质量亏损值为162.6998mDa，其分子量筛选窗口范围181.1626998-381.1626998Da，质量亏损值筛选为62.6998-262.6998mDa。以艾司洛尔和艾司洛尔酸为模板，筛选出单体杂质EP1-EP3和EP14-18(图4)。艾司洛尔二聚体的分子量为558.330504Da，质量亏损值为330.504mDa，其分子量筛选窗口范围458.330504-658.330504Da，质量亏损值筛选为230.504-430.504mDa筛选出二聚体杂质EP4-5、EP7-8、EP11-13(图5)。

本次MDF的筛选模板主要分为3类：(1)筛选质量、结构由模板化合物发生氧化、还原、脱烷基等反应，使模板化合物加上或减去一个或几个C/H/O/N等；(2)筛选质量、结构由模板化合物裂分产生的小分子化合物，如水解反应；(3)筛选质量、结构由模板化合物加合可能的辅料产生的化合物。并将筛选结果通过元素分析和质谱裂解规律剔除假阳性化合物。药品杂质通常分为：有机杂质、无机杂质、残留溶剂。其中化学结构与活性成分类似或具渊源关系的有机杂质，通常称为有关物质。因此采用质量亏损技术研究有关物质是一种快速有效的方法。此技术的关键参数是(1)母体结构的选择要有代表性，本发明选择经结构确证的艾司洛尔、艾司洛尔酸和艾司洛尔二聚体为模板，筛选单体类型杂质和二聚体类型杂质；(2)质量范围和质量亏损范围的选择，本发明依次将质量范围设定为50Da，100Da，150Da，质量亏损范围分别设定为50mDa，100mDa，150mDa考察筛选结果，综合考虑化合物数量与通过元素分析和质谱裂解规律剔除假阳化合物，发现将质量亏损范围设定100Da，质量亏损范围为100mDa时最佳。

实施例3

化学计量分析法：如图8所示，本研究首次将化学计量法应用于筛选盐酸艾司洛尔注射液杂质。S1、分别将不同生产企业的盐酸艾司洛尔注射液用水稀释至含盐酸艾司洛尔浓度为0.1mg/mL，制得供试品溶液；

S2、不同生产企业盐酸艾司洛尔注射液的检测分析：通过超高效液相色谱串联高分辨率质谱对不同生产企业盐酸艾司洛尔注射液的供试品溶液进行数据的采集，获得全杂质谱的检测多峰图，对色谱峰进行峰提取与校正，获取所有杂质的相对峰面积与保留时间；

S2中，所述超高效液相色谱串联高分辨率质谱为超高效液相色谱四级杆静电场轨道阱高分辨质谱，色谱柱为C18，1.8μm，2.1mm×100mm；

色谱条件为：流动相为5mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1％甲酸)-乙腈，梯度洗脱的程序为0～20min，10～50％乙腈；20～25min，50％～80％乙腈；25～28min，80％～10％乙腈；28～35min，10％～10％乙腈；流速0.26～0.34mL/min；柱温27～32℃；进样体积为1.8～2.2μL；质谱主要包括：正离子模式检测，裂解电压4.50kV，辅助气流量10mL/min，离子传输管温度320℃，辅助气温度350℃；扫描模式：Full MS/dd-MS

S3、正离子模式下以艾司洛尔、艾司洛尔酸和艾司洛尔二聚体为模板，筛选单体类型杂质和二聚体类型杂质。每个MDF模板的质量范围为100Da，质量亏损范围为100mDa，误差为5ppm(图3)。艾司洛尔的分子量为295.1778097Da，质量亏损值为177.8097mDa，艾司洛尔酸的分子量为281.1626998Da，质量亏损值为162.6998mDa，筛选出单体杂质EP1-EP3和EP14-18(图4)。艾司洛尔二聚体的分子量为558.330504Da，质量缺陷值为330.504mDa筛选出二聚体杂质EP4-5、EP7-8、EP11-13(图5)。

S4、多元分析法区分不同生产企业与原研药杂质谱的区别，筛选杂质特异性标志物：采用多元统计法进行分析，依次进行主成分分析、层次聚类分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析，最后根据变量权重值和t检验中P值分析筛选差异标志物，得到区分鉴别模型评价不同生产企业与原研药杂质谱；

如图6-7所示，S4中，以变量重要性>1，显著性水平<0.05作为门槛值获取杂质差异标志物。

S5、将多元分析法的结果结合质量亏损结果得到不同生产企业与原研药有关物质一致性评价的特异性标志物，以生产企业1为例，见表1.

表1

结合质量亏损和多元分析法得到不同生产企业与原研药潜在差异杂质如表1

结果的验证：如图9-17所示，杂质特异性标志物结构的初步验证，采用分析对照品的二级质谱裂解途径，推导验证各杂质的结构。

S5中，测定的主要杂质差异标志物为杂质Ⅰ与杂质Ⅱ：

有关物质方法的确定：S4、基于高效液相色谱-紫外仪测定S3中确定的差异标志物的含量，建立盐酸艾司洛尔注射液有关物质的质量标准。

杂质差异标志物杂质Ⅰ和杂质Ⅱ作为盐酸艾司洛尔注射液有关物质控制的特殊杂质的应用，建立高效液相色谱测定法。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(CAPCELL PAKC18 MGⅢ柱，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)。以乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾4.6g，加水1000mL使溶解，用稀磷酸调节pH至4.0)(12:20:68)为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱：0～15min，100％A；15～30min，100％A→65％A；30～50min，65％A；50～51min，65％A→100％A；51～60min，100％A。流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样量20μL。