快速检测新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种快速检测新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)是21世纪继严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)后引发重大公共卫生事件的第三个β属冠状病毒。作为正链RNA病毒，其基因组可编码16种参与RNA转录和复制的非结构蛋白，以及包括刺突(spike，S)蛋白、包膜(envelope，E)蛋白、膜(membrane，M)蛋白、核衣壳(nucleotide，N)蛋白在内的4种主要结构蛋白。与SARS和MERS冠状病毒有很大不同。

SARS CoV 2感染患者通常表现为肺炎样症状和腹泻等胃肠道症状，其次为严重急性期呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症，甚至导致死亡。传染源是SARS CoV 2感染患者，包括无症状感染者，以呼吸道飞沫和接触传播为主要传播途径。

流感病毒是造成全球急性呼吸道感染的主要病原体之一，每年可导致300～500万流感相关的住院病例及25～30万死亡病例，其中儿童与老人占比较大。流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，有包膜、分节段的单股负链RNA病毒。人类感染的流感病毒主要是甲型(A)和乙型(B)。甲型流感病毒抗原变异活跃，可引起世界范围的大流行，乙型流感病毒常引起小规模的暴发流行。在流感流行季节，因急性呼吸道感染而发热的就诊人数骤增，临床上需要快速、准确、适用于临床应用的流感病毒检测方法，以便早诊断、早治疗。

目前，国内外检测新型冠状病毒以及甲型、乙型流感病毒的方法主要有以下几种：(1)病毒分离培养。该方法可用于识别和扩增具备复制能力的活体病毒，长期以来被视为实验室诊断病毒感染的金标准，结果准确、可区分活病毒，但操作烦琐、耗费时间长，且灵敏度不足，不利于感染的早期诊断。(2)病毒抗原检测。操作简便、易于判定等特点适于在基层医疗单位及现场检测中使用，但灵敏度和特异性也有待提高。(3)病毒核酸检测。包括：①全基因组测序：可对样本来源的所有DNA或RNA核酸分子进行测序，无需靶标富集和扩增，具有“无偏泛病原体检测”的特性，但该技术的整体工作流程尚无统一标准，程序较复杂，周期为24-48h或更长。②基于聚合酶链式反应(PCR)技术的核酸检测：常规PCR检测结果的判断主要依赖于琼脂糖凝胶电泳，耗时较长，且需使用含有一定毒性的核酸染料等试剂，操作安全性有待提高。实时荧光定量PCR可以对靶标进行快速定量检测且无需电泳，但由于仪器和试剂成本较高而未能在基层医疗单位和现场检测中广泛使用。③基于等温扩增的核酸检测：相较于PCR技术，等温扩增核酸检测简化了热循环反应过程，缩短了检测周期，具有高特异度、高敏感度、设备简化的优点，但其多引物、多酶的反应体系需求同时也加大了检测设计和研发的复杂程度。④基于CRISPR的核酸检测：具有高敏感度、高特异度和灵活靶向性的优势，但在临床诊断的普适性有待证实。(4)基于宿主呼吸代谢物的检测。宿主呼出气体代谢物的检测被称为呼吸分析，是一种随代谢组学兴起的无创且实时的POCT方式，通过质谱-色谱技术检测关键挥发性有机化合物实现，具有明确诊断和大规模筛查的潜力。但不能作为患者管理和治疗的唯一决策依据且尚未普及。

现阶段用于检测病毒的主要手段是RT-PCR法。此方法具有较高的特异性和敏感性。但是其变温特点需要相关的昂贵复杂的仪器设备且需要专业人士实现相关操作，因此检测应用受到较大的限制，继而延迟检测。

根据已公开的文献或专利中等温扩增技术包括环介导等温扩增(LAMP)、链置换等温扩增(SDA)、依赖解旋酶等温扩增(HDA)、依赖核酸序列等温扩增(NASBA)、单引物等温扩增(SPIA)、交叉引物等温扩增(CPA)以及重组酶聚合酶扩增(RPA)及其衍生技术。已发表或公开的有关新型冠状病毒、甲型流感、乙型流感的等温扩增方法的文献或专利中应用最广泛的是环介导等温扩增技术(LAMP)，该技术所用时间短，不受温度的限制，操作相对简单。但是，该方法需使用4～6条引物进行扩增，对靶序列及长度有一定的要求，且易产生气溶胶污染和结果假阳性问题。重组酶聚合酶扩增(RPA)同样应用于病毒核酸的检测中，被公认为可以替代PCR的核酸检测技术，原理是通过重组酶、重组酶加载因子和单链结合蛋白与引物和靶序列的相互作用，完成核酸靶序列的体外扩增。其对温度的适应性更强，提高了反应稳定性，降低了试剂成本，能够匹配多种工具酶进行有效扩增，高效的扩增效率，使其可在短时间内实现反应，操作简单，灵敏度高，也尽可能的避免了环介导等温扩增技术的假阳性问题。将重组酶等温扩增技术结合荧光探针法，可以实时显示扩增结果，既提高了检测灵敏度和特异性，又缩短了反应时间，是目前较为常用的方式。

因此，本领域迫切需要开发能够快速、准确、高效的新型冠状病毒和甲乙型流感的核酸检测方法，这对于有效防止新型冠状病毒和流感病毒的扩散具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一次反应即可检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体，检测时间短、检测灵敏度高的快速检测新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。

第一方面，本发明提供一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒。

一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒，所述的试剂盒中包含检测新型冠状病毒N基因的引物；

所述的引物至少包含一下任意一种或多种，

进一步的，所述的试剂盒还包括检测甲型流感M1基因的引物；

所述的引物至少包含一下任意一种或多种，

进一步的，所述的试剂盒还包括检测乙型流感HA基因的引物；

所述的引物至少包含一下任意一种或多种，

进一步的，所述的引物名称中含F的代表上游引物，含R的代表下游引物，含P的代表探针。

进一步的，所述的探针的下游引物在5’端耦连生物素，探针上游耦连FAM/HEX/Cy5等荧光基团，中间位置采用THF替代一个碱基，3’端进行磷酸化处理。

进一步的，所述的引物用PAGE纯化并结合质谱方式对合成物进行检验。

第二方面，本发明提供一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒的应用。

种快速检测新型冠状病毒的试剂盒用于快速检测新型冠状病毒中的应用。

第三方面，本发明提供一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒的另一种应用。

一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒用于快速检测新型冠状病毒、甲型流感及乙型流感中的应用。

第四方面，本发明提供一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒的应用方法。

一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒的应用，所述应用包含以下步骤：

S1样本处理和核酸提取；

S2配制RPA多重扩增试剂，以得到的核酸为模板进行多重扩增；

S3扩增产物检测。

进一步的，所述的步骤S3中，与阴性对照比较，有S形曲线且Ct值≤38，判定为阳性，表明样本中含有对应的病原体；未见S形曲线判定为阴性或Ct值>38，表明样本中不含有对应的病原体或者样本中病原体浓度过低，不能检测到。

本发明通过文献查询得到3种病原体的保守基因，在NCBI查询新型冠状病毒N基因，甲型流感病毒M1基因，乙型流感病毒HA基因并下载对应序列。在特异性基因上通过软件辅助，结合过往经验设计几对引物探针序列。

使用假病毒进行测试，通过改变引物探针浓度，检测条件以及反应体系的优化，开发出RPA等温多重扩增试剂盒。通过几种技术的优势结合，以及独特设计的引物探针，一次反应可检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体，30分钟完成核酸提取和PCR扩增，信号读取，结果报告，检测灵敏度为75copies/反应。

表1 3种病毒基因序列及引物

引物探针名称中含F的代表上游引物，含R的代表下游引物，含P的代表探针。探针的下游引物在5’端耦连上生物素，探针上游耦连FAM/HEX/Cy5等荧光基团，中间位置采用THF(四氢呋喃)替代一个碱基，3’端进行磷酸化处理。引物组及探针均采用PAGE纯化并结合质谱方式对合成物进行检验。

采用本发明的试剂盒的检测流程包含以下步骤：

一、样本处理和核酸提取。收到样本后在涡旋震荡仪上涡旋，充分混匀样本，提取使用廊坊诺道中科病毒提取试剂，利用磁珠吸附原理，通过特制的磁棒吸附、转移和释放磁珠，实现磁珠/核酸的转移，自动完成核酸的提取和纯化。

具体步骤如下：

从试剂盒内取出真空包装的预封装试剂，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉真空包装，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，使用前小心撕去铝箔封口膜，避免振动，防止液体溅出。在预封装试剂的第1或者第7列(注意有效工作孔位)中分别加入20ul 20mg/ml的蛋白酶k溶液、200ul样本。将孔板放到提取板全自动核酸提取仪中，提取程序如下表2所示，提取时间为9分钟50秒，提取后的核酸可以直接用于扩增反应。

表2提取程序

二、配制RPA多重扩增试剂，以得到的核酸为模板进行多重扩增；具体为：在装有RPA核酸扩增基础性试剂检测干粉的反应单元管中加入缓冲液ABuffer12.5μL，B Buffer2.5μL，10μM的RPA多重引物探针混合物5μL，无菌双蒸水25μL，模板5μL。盖上八连排盖子，将RPA扩增体系充分混匀，3000×g离心10s，置于QPCR仪设置为42℃、1min,1cycle，42℃30Sec/Cycles，40Cycles，检测FAM、HEX、Cy5通道荧光。

RPA多重引物中的上游或下游RPA多重引物的摩尔比例为1:1。检测时，浓度为10uM的上述各RPA多重引物混合物用量为5ul，其中浓度为10uM的RPA的上下游混合引物用量各为2ul。浓度为10uM的RPA混合探针用量为1ul。

三、应用荧光探针进行扩增产物检测，与阴性对照比较，检测孔在QPCR仪设备上有S形曲线且Ct值≤38，判定为阳性，表明样本中含有对应的病原体；未见S形曲线判定为阴性或Ct值>38，表明样本中不含有对应的病原体或者样本中病原体浓度过低，不能检测到。

样本检出限确定，新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒使用合成的假病毒(通用生物(安徽)股份有限公司)，其中新型冠状病毒核酸长度为4000bp，甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸长度为500bp。使用TE溶液，按照梯度稀释，最终确认其检出限为75copies/反应。

本发明先后对每种病原体的4对引物探针、反应体系(核酸加入量)，反应温度(40℃、41℃、42℃、43℃)进行测试，最终确定了反应条件和最低检出限。

采用本发明提供的试剂盒，核酸提取时间为10分钟，检测时间短，仅为20分钟，整体时间仅为30分钟。相较于普通荧光定量PCR的单纯检测时间1.5小时而言，大幅度缩减检测时间，节约时间成本。相比于传统的PCR及荧光定量PCR，本发明操作更为简单，所需时间更短，对仪器要求不高。

本发明提供的试剂盒可以通过一次反应检测3种症状相似的呼吸道病原体，能够简化临床工作，为大夫提供诊断参考。

本发明中使用的提取试剂和检测试剂对于市面上的仪器可通用，有利于推广使用。且本发明的检出限可达75copies/反应，即75copies/反应，优于市面上大多数产品，在快速的基础上报证了灵敏性和准确性。

与现有技术相比，本发明提供的快速检测新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒的试剂盒及其应用的优点：

(1)操作简单、检测时间短。

(2)简化临床工作、检测效率高。

(3)灵敏性和准确性高。

附图说明

图1是本发明提供的新型冠状病毒4种引物探针组合筛选结果。

图2是本发明提供的甲型流感病毒4种引物探针组合筛选结果。

图3是本发明提供的乙型流感病毒4种引物探针组合筛选结果。

图4是本发明提供的新型冠状病毒体系筛选结果。

图5是本发明提供的甲型流感病毒体系筛选结果。

图6是本发明提供的乙型流感病毒体系筛选结果。

图7是本发明提供的新型冠状病毒反应温度筛选结果。

图8是本发明提供的甲型流感病毒反应温度筛选结果。

图9是本发明提供的乙型流感病毒反应温度筛选结果。

图10是本发明提供的新型冠状病毒假病毒梯度稀释，检出限确认结果。

图11是本发明提供的甲型流感病毒假病毒梯度稀释，检出限确认结果。

图12是本发明提供的乙型流感病毒假病毒梯度稀释，检出限确认结果。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。

第一方面，本发明提供一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒。

一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒，所述的试剂盒中包含检测新型冠状病毒N基因的引物；

所述的引物至少包含一下任意一种或多种，

进一步的，所述的试剂盒还包括检测甲型流感M1基因的引物；

所述的引物至少包含一下任意一种或多种，

进一步的，所述的试剂盒还包括检测乙型流感HA基因的引物；

所述的引物至少包含一下任意一种或多种，

进一步的，所述的引物名称中含F的代表上游引物，含R的代表下游引物，含P的代表探针。

进一步的，所述的探针的下游引物在5’端耦连生物素，探针上游耦连FAM/HEX/Cy5等荧光基团，中间位置采用THF替代一个碱基，3’端进行磷酸化处理。

进一步的，所述的引物用PAGE纯化并结合质谱方式对合成物进行检验。

第二方面，本发明提供一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒的应用。

第三方面，本发明提供一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒的另一种应用。

一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒用于快速检测新型冠状病毒、甲型流感及乙型流感中的应用。

第四方面，本发明提供一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒的应用方法。

一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒的应用，所述应用包含以下步骤：

S1样本处理和核酸提取；

S2配制RPA多重扩增试剂，以得到的核酸为模板进行多重扩增；

S3扩增产物检测。

进一步的，所述的步骤S3中，与阴性对照比较，有S形曲线且Ct值≤38，判定为阳性，表明样本中含有对应的病原体；未见S形曲线判定为阴性或Ct值>38，表明样本中不含有对应的病原体或者样本中病原体浓度过低，不能检测到。

实施例1

一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒，所述的试剂盒中包含检测新型冠状病毒N基因的引物；

所述的引物包含，

实施例2

一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒，所述的试剂盒还包括检测甲型流感M1基因的引物；

所述的引物包含以下引物，

引物1

引物2

实施例3

一种快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒3种病原体的试剂盒，所述的试剂盒还包括检测乙型流感HA基因的引物；

所述的引物包含以下引物，

引物1

/>

引物2

引物3

该试剂盒可快速检测新型冠状病毒、甲型流感和乙型流感。

所述的引物名称中含F的代表上游引物，含R的代表下游引物，含P的代表探针。所述的探针的下游引物在5’端耦连生物素，探针上游耦连FAM/HEX/Cy5等荧光基团，中间位置采用THF替代一个碱基，3’端进行磷酸化处理。所述的引物用PAGE纯化并结合质谱方式对合成物进行检验。

实施例4

采用本发明的试剂盒的检测流程包含以下步骤：

一、样本处理和核酸提取。收到样本后在涡旋震荡仪上涡旋，充分混匀样本，提取使用廊坊诺道中科病毒提取试剂，利用磁珠吸附原理，通过特制的磁棒吸附、转移和释放磁珠，实现磁珠/核酸的转移，自动完成核酸的提取和纯化。

具体步骤如下：

从试剂盒内取出真空包装的预封装试剂，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉真空包装，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，使用前小心撕去铝箔封口膜，避免振动，防止液体溅出。在预封装试剂的第1或者第7列(注意有效工作孔位)中分别加入20ul 20mg/ml的蛋白酶k溶液、200ul样本。将孔板放到提取板全自动核酸提取仪中，提取程序如下表2所示，提取时间为9分钟50秒，提取后的核酸可以直接用于扩增反应。

表2提取程序

/>

二、配制RPA多重扩增试剂，以得到的核酸为模板进行多重扩增；具体为：在装有RPA核酸扩增基础性试剂检测干粉的反应单元管中加入缓冲液A Buffer12.5μL，B Buffer2.5μL，10μM的RPA多重引物探针混合物5μL，无菌双蒸水25μL，模板5μL。盖上八连排盖子，将RPA扩增体系充分混匀，3000×g离心10s，置于QPCR仪设置为42℃、1min,1cycle，42℃30Sec/Cycles，40Cycles，检测FAM、HEX、Cy5通道荧光。

RPA多重引物中的上游或下游RPA多重引物的摩尔比例为1:1。检测时，浓度为10uM的上述各RPA多重引物混合物用量为5ul，其中浓度为10uM的RPA的上下游混合引物用量各为2ul。浓度为10uM的RPA混合探针用量为1ul。

三、应用荧光探针进行扩增产物检测，与阴性对照比较，检测孔在QPCR仪设备上有S形曲线且Ct值≤38，判定为阳性，表明样本中含有对应的病原体；未见S形曲线判定为阴性或Ct值>38，表明样本中不含有对应的病原体或者样本中病原体浓度过低，不能检测到。

样本检出限确定，新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒使用合成的假病毒(通用生物(安徽)股份有限公司)，其中新型冠状病毒核酸长度为4000bp，甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸长度为500bp。使用TE溶液，按照梯度稀释，最终确认其检出限为75copies/反应。

本发明先后对每种病原体的4对引物探针、反应体系(核酸加入量)，反应温度(40℃、41℃、42℃、43℃)进行测试，最终确定了反应条件和最低检出限。结果如图1～12所示。

引物探针挑选如图1～3所示，图1为新型冠状病毒4种引物探针组合筛选，结果表明第一组效果最好，Ct值最小。图2为甲型流感病毒4种引物探针组合筛选，结果表明第四组效果最好，Ct值最小且荧光值较高。图3为乙型流感病毒4种引物探针组合筛选，结果表明第三组效果最好，Ct值最小且荧光值最高。

反应体系筛选如图4～6所示，图4为新型冠状病毒体系筛选，图4中，1：模板加入5ul，总体积为50ul；2：模板加入3ul，总体积为50ul；3：模板加入2ul，总体积为50ul。

图5为甲型流感病毒体系筛选，图5中，1：模板加入5ul，总体积为50ul；2：模板加入3ul，总体积为50ul；3：模板加入2ul，总体积为50ul。

图6为乙型流感病毒体系筛选，图6中，1：模板加入5ul，总体积为50ul；2：模板加入3ul，总体积为50ul；3：模板加入2ul，总体积为50ul。

反应温度测试如图7～9所示，图7为新型冠状病毒反应温度筛选；图8为甲型流感病毒反应温度筛选；图9为乙型流感病毒反应温度筛选。

检出限图和数据如图10～12所示，图10为新型冠状病毒假病毒梯度稀释，检出限确认；图11为甲型流感病毒假病毒梯度稀释，检出限确认；图12为乙型流感病毒假病毒梯度稀释，检出限确认。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。