一种光合细菌粉剂的制备方法和光合细菌粉剂

技术领域

本申请涉及微生物领域，更具体地说，它涉及一种光合细菌粉剂的制备方法和光合细菌粉剂。

背景技术

光合细菌(Photosynthetic Bacteria，简称PSB)是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处，主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。在自然界碳素、氮素、硫素的转化循环中起重要作用被广泛应用于水产养殖、禽畜饲养、作物施肥、生物防治、环境保护等领域中在我国被大规模地应用于水产养殖业。我国研究光合细菌常聚焦于废水处理、水产养殖效果、光合细菌代谢产物的提取上，然对光合细菌菌种的保存的研究相对较少。

冷冻干燥是利用冰晶升华的原理，在高度真空的环境下，将已冻结了的食品物料的水分不经过冰的融化直接从冰固体升华为蒸汽，一般真空干燥物料中的水分是在液态下转化为汽态而将食品干制，故冷冻干燥又称为冷冻升华干燥。真空冷冻干燥技术在微生物保藏方面得到了广泛的应用，是目前适应性最广的菌剂制备技术，在低温、真空条件下，微生物的生理活动停止，细胞活力不易受损，特别适合热敏性、氧敏性的微生物干燥制备，且菌剂保藏中不易受污染，易于分装运输。

然而，由于各类微生物菌株的生境条件、营养需求、培养方法等存在较大差异，造成了不同微生物菌株的冻干方法和冻干保护剂不尽相同，而不同的冻干方法与保护剂对冻干菌剂的存活率和贮藏稳定性的影响亦不相同。目前已有相关技术公开了光合细菌菌液冻干工艺，例如采用在光合细菌菌泥中加入保护剂，混合后采用冻干机进行急速冷冻，冷冻温度在-80℃左右；或者将光合细菌菌泥先于-30℃左右下冷藏8-12h，再送入冷冻干燥机中冻干约25-30h。上述工艺均为较为常规的冻干工艺，它们对冻干保护剂的种类以及浓度比例的依赖较大，需配合较优的保护剂种类以及较高的保护剂浓度才能实现存活率在75％以上。例如，以蔗糖作为保护剂，将光合细菌菌泥先于-30℃左右下冷冻8-12h，再送入冷冻干燥机中冻干约25-30h。经测试，蔗糖添加的重量浓度需要10％及以上，才能保证冻干处理后的光合细菌存活率为75％，蔗糖浓度降为5％时，其存活率为62.5％；相同工艺下采用价格较高的海藻糖作为保护剂，则海藻糖添加的重量浓度为5％时，其冻干处理后的光合细菌存活率即可达到75％，海藻糖浓度升至10％时，其存活率为87.5％；相同工艺下若采用麦芽糊精其添加量为10％时，存活率为62.5％，若采用甘油，添加量为10％时，存活率仅为50％；而采用维生素C与脱脂乳的效果更差，10％添加量下，存活率依次为27.5％与5％。

发明内容

为了解决上述问题，本申请提供一种光合细菌粉剂的制备方法和光合细菌粉剂。

第一方面，本申请提供一种光合细菌粉剂的制备方法，采用如下的技术方案：

一种光合细菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：提供菌泥；

S2：于菌泥中加入保护剂，获得菌悬液；

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-50℃至-55℃，时间为2-5h；所述第二冻干处理的温度为-60℃至-65℃，时间为10-15h；所述第二冻干处理的温度为-70℃至-90℃，时间为20-50h；获得光合细菌粉剂。

通过采用上述技术方案，采用连续的三次冻干处理工艺，三次冻干处理工艺中，设计冻干温度逐步提升，经试验发现，采用上述三个温度梯度逐步提升的冻干处理后，可较好地避免由于冻干脱水过程中造成水和蛋白质中的极性基团形成的部分氢键被破坏而引起的部分蛋白失去应有空间构像失去活力的问题的发生，经试验发现，基于该冻干工艺条件，在添加相同保护剂时，保护剂的用量可以明显较之前降低并能保证获得于之前相同的光合细菌存活率。

优选的，步骤S1中，将待冻干的光合细菌培养液进行离心处理，获得所述菌泥；步骤S2中，配置使得获得的菌悬液的浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同。

通过采用上述技术方案，待冻干的光合细菌培养液可以是现有光合细菌培养工艺获得的培养液，可采用离心处理方式获得菌泥，再将菌泥与保护剂混合，制成菌悬液。

优选的，步骤S1中，所述离心处理的转速为4500-5000rpm，时间为15-20min。

通过采用上述技术方案，为进一步避免离心过程中离心力机械作用的影响而导致的部分菌体死亡以及减少上清液残留菌体而导致菌体流失，可优化设计适宜的离心处理条件，保证活菌得率。

优选的，所述保护剂为蔗糖，所述保护剂的添加量为占菌悬液质量百分数的4-10％。

通过采用上述技术方案，配合上述三次梯度冻干工艺，在采用现有的蔗糖作为保护剂时，其有效添加量为5-10％，例如可以是5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％中的任一值。经试验，蔗糖添加量为5％时，菌体存活率即可达到75％，随蔗糖添加量的上升，菌体存活率亦可提高。结合成本考虑，蔗糖添加量推荐为5-6％。

优选的，所述保护剂为海藻糖，所述保护剂的添加量为占菌悬液质量百分数的3-10％。

通过采用上述技术方案，配合上述三次梯度冻干工艺，在采用现有的海藻糖作为保护剂时，其有效添加量为3-10％，例如可以是3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％中的任一值。经试验，海藻糖添加量为3％时，菌体存活率即可达到75％，随海藻糖添加量的上升，菌体存活率亦可提高。结合成本考虑，海藻糖添加量优选为3-5％。

优选的，所述光合细菌为沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌或球形红假单胞菌。

优选的，所述第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理的真空度分别为0.01-0.05mba。

通过采用上述技术方案，第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理的真空度均可根据实际情况进行调整，例如可根据需求在0.01-0.05mba进行选择。

第二方面，本申请提供一种光合细菌粉剂，采用如下的技术方案：

一种光合细菌粉剂，采用上所述的光合细菌粉剂的制备方法制备获得。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请采用上述连续三次的梯度冻干工艺，由于可较好地避免由于冻干脱水过程中造成水和蛋白质中的极性基团形成的部分氢键被破坏而引起的部分蛋白失去应有空间构像失去活力的问题的发生，经试验发现，基于该冻干工艺条件，在添加相同保护剂时，保护剂的用量可以明显较之前降低并能保证获得于之前相同的光合细菌存活率。

2、本申请中采用蔗糖作为保护剂时，蔗糖添加量为5％时，菌体存活率即可达到75％；采用海藻糖作为保护剂时，海藻糖添加量为3％时，菌体存活率即可达到75％。可一定程度降低冻干活菌存活率对保护剂的较优种类的要求以及减少保护剂用量，进而节省成本。

具体实施方式

以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。

应用说明

本申请的光合细菌粉剂的制备方法可应用于对一般工艺获得的光合细菌的培养液或菌泥的冻干处理。

制备例

制备例1

本制备例的光合细菌培养液通过以下工艺获得：

在固体培养基(磷酸氢二钾0.8g/L、乙酸钠1g/L、硫酸镁0.2g/L、酵母浸膏8g/L、琼脂20g/L)上分离得到纯种的沼泽红假单胞菌，固体平板培养在有40W白炽灯光照的厌氧培养箱中进行，3℃恒温培养3-5天。将纯种的沼泽红假单胞菌菌体刮下来，分别接种在6瓶2.5L的已经灭菌的液体培养基(氯化铵2g/L、磷酸二氢钾0.9g/L、乙酸钠4.5g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、酵母膏0.8g/L、氯化镁0.3g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸锰0.002g/L、硫酸亚铁0.002g/L、碳酸氢钠1g/L、氯化钠0.5g/L、蛋白胨0.5g/L、Na

实施例

实施例1

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于4500rpm转速下进行离心处理20min，获得菌泥；

S2：于菌泥中加入保护剂，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液；所述保护剂为蔗糖，所述保护剂的添加量为占菌悬液质量百分数的5％。

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-53℃，时间为4h；所述第二冻干处理的温度为-63℃，时间为12h；所述第二冻干处理的温度为-80℃，时间为30h；获得光合细菌粉剂。

S4：将获得的光合细菌粉剂于4℃条件下进行冷藏。

实施例2

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于5000rpm转速下进行离心处理15min，获得菌泥；

S2：于菌泥中加入保护剂，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液；所述保护剂为蔗糖，所述保护剂的添加量为占菌悬液质量百分数的10％。

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-50℃，时间为5h；所述第二冻干处理的温度为-60℃，时间为10h；所述第二冻干处理的温度为-70℃，时间为20h；获得光合细菌粉剂。

S4：将获得的光合细菌粉剂于4℃条件下进行冷藏。

实施例3

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于4800rpm转速下进行离心处理18min，获得菌泥；

S2：于菌泥中加入保护剂，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液；所述保护剂为蔗糖，所述保护剂的添加量为占菌悬液质量百分数的6％。

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-55℃，时间为5h；所述第二冻干处理的温度为-65℃，时间为15h；所述第二冻干处理的温度为-90℃，时间为50h；获得光合细菌粉剂。

S4：将获得的光合细菌粉剂于4℃条件下进行冷藏。

实施例4

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于4500rpm转速下进行离心处理20min，获得菌泥；

S2：于菌泥中加入保护剂，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液；所述保护剂为海藻糖，所述保护剂的添加量为占菌悬液质量百分数的3％。

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-53℃，时间为4h；所述第二冻干处理的温度为-63℃，时间为12h；所述第二冻干处理的温度为-80℃，时间为30h；获得光合细菌粉剂。

S4：将获得的光合细菌粉剂于4℃条件下进行冷藏。

实施例5

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于5000rpm转速下进行离心处理15min，获得菌泥；

S2：于菌泥中加入保护剂，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液；所述保护剂为海藻糖，所述保护剂的添加量为占菌悬液质量百分数的10％。

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-50℃，时间为2-5h；所述第二冻干处理的温度为-60℃，时间为10h；所述第二冻干处理的温度为-70℃，时间为20h；获得光合细菌粉剂。

S4：将获得的光合细菌粉剂于4℃条件下进行冷藏。

实施例6

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于4800rpm转速下进行离心处理18min，获得菌泥；

S2：于菌泥中加入保护剂，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液；所述保护剂为海藻糖，所述保护剂的添加量为占菌悬液质量百分数的5％。

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-55℃，时间为5h；所述第二冻干处理的温度为-65℃，时间为15h；所述第二冻干处理的温度为-90℃，时间为50h；获得光合细菌粉剂。

S4：将获得的光合细菌粉剂于4℃条件下进行冷藏。

实施例7

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，基本与实施例1相同，区别仅在于：

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-51℃，时间为2.5h；所述第二冻干处理的温度为-64℃，时间为14h；所述第二冻干处理的温度为-76℃，时间为24h；获得光合细菌粉剂。

实施例8

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，基本与实施例1相同，区别仅在于：

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-52℃，时间为4.5h；所述第二冻干处理的温度为-64℃，时间为14h；所述第二冻干处理的温度为-85℃，时间为25h；获得光合细菌粉剂。

实施例9

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，基本与实施例1相同，区别仅在于：

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-55℃，时间为3h；所述第二冻干处理的温度为-64℃，时间为13h；所述第二冻干处理的温度为-78℃，时间为32h；获得光合细菌粉剂。

实施例10

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，基本与实施例1相同，区别仅在于：

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-55℃，时间为5h；所述第二冻干处理的温度为-65℃，时间为10h；所述第二冻干处理的温度为-82℃，时间为31h；获得光合细菌粉剂。

实施例11

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，基本与实施例4相同，区别仅在于：

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-52℃，时间为3.5h；所述第二冻干处理的温度为-65℃，时间为11.5h；所述第二冻干处理的温度为-78℃，时间为26h；获得光合细菌粉剂。

实施例12

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，基本与实施例4相同，区别仅在于：

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-51℃，时间为4.5h；所述第二冻干处理的温度为-62℃，时间为12.5h；所述第二冻干处理的温度为-85℃，时间为27h；获得光合细菌粉剂。

实施例13

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，基本与实施例4相同，区别仅在于：

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-55℃，时间为3.8h；所述第二冻干处理的温度为-61℃，时间为14.5h；所述第二冻干处理的温度为-76℃，时间为30h；获得光合细菌粉剂。

实施例14

本实施例的光合细菌粉剂的制备方法，基本与实施例4相同，区别仅在于：

S3：将菌悬液依次进行第一冻干处理、第二冻干处理和第三冻干处理，所述第一冻干处理的温度为-52℃，时间为5h；所述第二冻干处理的温度为-64℃，时间为14.5h；所述第二冻干处理的温度为-80℃，时间为31h；获得光合细菌粉剂。

对比例

对比例1

将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于4000rpm转速下进行离心处理15min，获得菌泥；菌泥加入冻干瓶中并加入蔗糖，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液，蔗糖的添加量为占菌悬液质量百分数的5％；置于-30℃冰箱冷冻过夜后冷冻干燥机冷冻干燥30h，制得冻干粉剂，然后放入冰箱4℃保存。

对比例2

将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于4000rpm转速下进行离心处理15min，获得菌泥；菌泥加入冻干瓶中并加入蔗糖，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液，蔗糖的添加量为占菌悬液质量百分数的10％；置于-30℃冰箱冷冻过夜后冷冻干燥机冷冻干燥30h，制得冻干粉剂，然后放入冰箱4℃保存。

对比例3

将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于4000rpm转速下进行离心处理15min，获得菌泥；菌泥加入冻干瓶中并加入海藻糖，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液，海藻糖的添加量为占菌悬液质量百分数的5％；置于-30℃冰箱冷冻过夜后冷冻干燥机冷冻干燥30h，制得冻干粉剂，然后放入冰箱4℃保存。

对比例4

将制备例1获得的待冻干的沼泽红假单胞菌培养液，于4000rpm转速下进行离心处理15min，获得菌泥；菌泥加入冻干瓶中并加入海藻糖，制得浓度与离心处理前光合细菌培养液的浓度相同的菌悬液，海藻糖的添加量为占菌悬液质量百分数的10％；置于-30℃冰箱冷冻过夜后冷冻干燥机冷冻干燥30h，制得冻干粉剂，然后放入冰箱4℃保存。

检测方法/试验方法

采用MPN五管法测定实施例1-6和对比例1-4的生物量。测试结果如下表1

表1

结合实施例1-6和对比例1-4并结合表1可以看出，实施例1-3中选择成本较高的海藻糖作为保护剂时，其添加量为3％时，菌体存活率可达到76.2％，当其添加量为5％时，存活率为88.1％，较之对比例3提高了11.9％，且较之对比例4略有提升。

若采用成本较低的蔗糖作为保护剂，其添加量为5％时，菌体存活率即可到达76.2％，其存活率较之对比例1提高了14.3％，且与添加3％的高价的海藻糖的存活率相当；当蔗糖添加量为10％时，存活率为83.3％，较之对比例1提高了9.5％，且与添加5％的高价的海藻糖的存活率略低。

据此，采用本申请的冻干工艺，基于满足获得所需菌体存活率的基本需求的情况下，对于保护剂的用量以及种类的选择上，均可以助益于降低成本。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。