一种重复性好、抗干扰能力强的血清尿酸检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，尤其涉及一种重复性好、抗干扰能力强的血清尿酸检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

嘌呤是人体内一种重要的代谢中间体，它是DNA、RNA等核苷酸代谢的主要产物，在肝脏进行二次代谢后就生成了尿酸。正常人体内尿酸的生成和排泄处于一种平衡状态，一个健康成年人每天体内会产生大约600mg尿酸，排泄600mg尿酸，人体中尿酸的浓度＞7mg/dL，血液酸性就会增大，长期以往会造成痛风。同时，体内的尿酸水平往往也代表了机体的代谢水平和免疫机能等状况，也与高尿酸血症和心脑血管等疾病密切相关，所以尿酸数值的准确测定对于这些疾病的诊断具有重要的意义。

目前对血清中的尿酸进行测值的方法主要有：磷钨酸还原法、反相高效液相色谱法、尿酸酶法等。

在磷钨酸还原法中，尿酸和蛋白质会产生共沉淀，需提前制备无蛋白滤液，操作繁琐，而且无蛋白滤液中的尿酸稳定性和特异性都比较差，测试结果容易受还原性的物质干扰，导致测试结果不准确。反相高效液相色谱法需要进行样品的前处理，反应条件比较苛刻，而且结果需要进行处理，步骤繁琐。尿酸酶法简单高效，操作简单，但易受到胆红素等还原性物质的干扰，而且测试过程中仪器匹配度不高，重复性较差，经常会有跳值的情况发生，给测试结果带来极大的不信任度。

发明内容

本发明目的在于解决现有尿酸酶法检测尿酸存在的易受胆红素干扰、重复性差经常会有跳值情况发生的问题，本发明提供一种重复性好、抗干扰能力强的血清尿酸检测试剂盒及其制备方法，通过调整色原改变检测波长来避免胆红素的干扰，通过联合应用丙三醇、BSA和吐温20来增大液体的均匀度和表面张力，使试剂能够更加均匀稳定以及减少液体在加样针里滞留，以此来提高重复性。

一种重复性好、抗干扰能力强的血清尿酸检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，

所述R1试剂主要由色原、金属离子螯合剂、缓冲液和防腐剂组成；

所述R2试剂主要由催化反应的酶、表面活性剂、稳定剂、4-氨基安替比林、丙三醇、缓冲液和防腐剂组成。

在上述方案基础上，所述R1试剂和R2试剂在使用时的体积比为R1:R2＝4:1。

在上述方案基础上，可选的，所述R1试剂的色原为MAOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐-水合物)、TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)、TBHBA(2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸)、HOAOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐)、DHBS(3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠)中的一种或几种，浓度为0.1g/L-10g/L。

在上述方案基础上，可选的，所述R1试剂的金属离子螯合剂为EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)、柠檬酸钠、海藻酸钠中的一种或几种，浓度为0.1g/L-1g/L。

在上述方案基础上，优选的，所述R2试剂的催化反应的酶包括尿酸酶和过氧化物酶，浓度为1KU/L-10KU/L。

在上述方案基础上，可选的，所述R2试剂的表面活性剂为吐温80、吐温20、曲拉通X-100、苯磺酸钠中的一种或几种，浓度为0.5％-5％(w/v)。

在上述方案基础上，可选的，所述R2试剂的稳定剂为BSA(牛血清白蛋白)、海藻糖、蔗糖中的一种或几种，浓度为0.1g/L-10.0g/L。

在上述方案基础上，可选的，所述R1试剂和R2试剂的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、Good’s缓冲液中的一种或几种，浓度为1g/L-10g/L，pH值范围6.0-8.0。

在上述方案基础上，优选的，所述R1试剂和R2试剂的防腐剂均为叠氮化钠，浓度为1g/L-5g/L；

一种重复性好、抗干扰能力强的尿酸检测试剂盒，最佳组合如下，它包含试剂R1和试剂R2，所述R1试剂和R2试剂在使用时的比例为R1:R2＝4:1，其中：

R1试剂组成为：

R2试剂组成为：

基于同一个发明构思，本发明还提供了一种重复性好、抗干扰能力强的血清尿酸检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：

R1试剂配制：称取磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.0，加入色原，加入防腐剂，搅拌溶解，加入金属离子螯合剂，搅拌溶解，2-8℃静置4h，分装；

R2试剂配制：称取磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.0，加入4-氨基安替比林，加入防腐剂，搅拌溶解，加入过氧化物酶和尿酸酶，搅拌溶解，加入丙三醇、稳定剂和表面活性剂，混合均匀，2-8℃静置4h，分装。

本发明具有如下优点：

本发明提供的一种重复性好、抗干扰能力强的血清尿酸检测试剂盒，通过调整色原的方式，将色原DHBS在505nm波长下检测容易受到胆红素的干扰调整为使用色原MAOS在波长600nm下检测，屏蔽掉胆红素的光吸收来实现抗胆红素干扰的问题；本发明通过联合应用丙三醇、BSA和吐温20来增大液体的均匀度和表面张力，使试剂能够更加均匀稳定以及减少液体在加样针里滞留，以提高重复性；本发明提高开封稳定性；本发明制备简单，反应条件简单。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步说明：

本发明的原理：血清中的尿酸首先与尿酸酶反应生成尿囊素和过氧化氢，过氧化氢在后续Trinder反应中扮演重要的角色：色原底物(酚类物质)与4-氨基安替比林在过氧化物酶的催化作用下生成苯胺类衍生物，过氧化氢会主动接受该步反应生成的质子使反应顺利进行，整个过程会产生吸光度的变化。尿酸的浓度与吸光度的变化是成正比的，因此可以通过读取吸光度的变化来得到尿酸的浓度。整个过程是一个氧化反应，血清中的还原性物质或者能接受Trinder反应生成的质子的物质都会对反应产生影响。为排除金属离子的干扰，需在体系中加入一定量的金属离子螯合物，禁锢金属离子，避免其对反应产生影响。联合应用丙三醇、BSA和吐温20来提高试剂的重复性，其原理是利用丙三醇、BSA和吐温20以一定的比例混合后的增稠作用来增加试剂的黏度，增大其表面张力，减少试剂在加样针上的滞留，从而使加样更准确，试剂重复性更好。另外，加入的表面活性剂吐温20，能使溶液更加均匀、稳定，提高试剂的测值重复性，叠氮化钠的加入可以起到一定的防腐作用，延长试剂的使用期限。

实施例一

R1试剂组成：

R2试剂组成：

配制均匀的R1试剂和R2试剂，配制步骤如下：R1试剂配制(以配制1L为计)：

①量取100mmol磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解；②用氢氧化钠或盐酸调pH至7.0；

③加入0.8g MAOS；

④加入3g叠氮化钠，搅拌溶解；

⑤加入1g EDTA-2Na，搅拌溶解；

⑥4℃静置4h；

⑦分装。

R2试剂配制(以配制1L为计)：

①量取100mmol磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解；

②用氢氧化钠或盐酸调pH至7.0；

③加入0.1g 4-氨基安替比林；

④加入3g叠氮化钠，搅拌溶解；

⑤加入6KU过氧化物酶和10KU尿酸酶，搅拌溶解；

⑥加入0.3mL丙三醇、5g/L BSA和40ml吐温20，混合均匀；

⑦4℃静置4h；

⑧分装。

置于日立7600全自动生化分析仪波长600nm下进行已知测值的正常人体血清样本和含有不同浓度的胆红素、血红蛋白、甘油三酯等各种干扰因素的非正常人体血清的测值，记录结果后与其他实施例进行比对，之后再对其进行重复性和开封试验，收集开封测值结果进行比对。

实施例二：

R1试剂组成：

R2试剂组成：

配制均匀的R1试剂和R2试剂，配制步骤如下：

R1试剂配制(以配制1L为计)：

①量取100mmol磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解；

②用氢氧化钠或盐酸调pH至7.0；

③加入0.65g DHBS；

④加入3g叠氮化钠，搅拌溶解；

⑤加入1g EDTA-2Na，搅拌溶解；

⑥4℃静置4h；

⑦分装。

R2试剂配制(以配制1L为计)：

①量取100mmol磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解；

②用氢氧化钠或盐酸调pH至7.0；

③加入0.1g 4-氨基安替比林；

④加入3g叠氮化钠，搅拌溶解；

⑤加入6KU过氧化物酶和10KU尿酸酶，搅拌溶解；

⑥加入0.3mL丙三醇、5g/L BSA和40ml吐温20，混合均匀；⑦4℃静置4h；

⑧分装。

置于日立7600全自动生化分析仪波长505nm下进行已知测值的正常人体血清样本和含有不同浓度的胆红素、血红蛋白、甘油三酯等各种干扰因素的非正常人体血清的测值，记录结果后与其他实施例进行比对，之后再对其进行重复性和开封试验，收集开封测值结果进行比对。

实施例三：

R1试剂组成：

R2试剂组成：

配制均匀的R1试剂和R2试剂，配制步骤如下：

R1试剂配制(以配制1L为计)：

①量取100mmol磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解；

②用氢氧化钠或盐酸调pH至7.0；

③加入0.8g MAOS；

④加入3g叠氮化钠，搅拌溶解；

⑤加入1g EDTA-2Na，搅拌溶解；

⑥4℃静置4h；

⑦分装。

R2试剂配制(以配制1L为计)：

①量取100mmol磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解；

②用氢氧化钠或盐酸调pH至7.0；

③加入0.1g 4-氨基安替比林；

④加入3g叠氮化钠，搅拌溶解；

⑤加入6KU过氧化物酶和10KU尿酸酶，搅拌溶解；

⑥4℃静置4h；

⑦分装。

置于日立7600全自动生化分析仪波长600nm下在对已知浓度的正常人体血清样本和含有不同浓度的胆红素、血红蛋白、甘油三酯等各种干扰因素的非正常人体血清进行测试，记录结果后与其他实施例进行比对，之后再对其进行重复性和开封试验，收集开封测值结果进行比对。

本发明所测试验数据仪器以日立7600全自动生化分析仪为主，以汉唐800为辅进行验证。本发明尿酸检测试剂盒已验证适用于以下型号：日立7080、日立7180、日立7600、AU2700、迪瑞CS-1200、汉唐800，本发明尿酸检测试剂盒不局限于以上仪器型号可以使用，其他型号均通用。

试验例1、抗干扰试验：

将胆红素、血红蛋白和甘油三酯分别配成5个不同浓度的溶液，将同一新鲜样本血清分为同体积的若干小份，在每份中各加入相同体积(不同浓度)的水、胆红素、血红蛋白和甘油三酯，以得到含有不同浓度干扰物质的标本。同时测定新鲜血清和加入不同浓度干扰因素的血清各3次，计算测试均值，与新鲜血清样本结果做比对。

1.1抗胆红素干扰试验：

表1抗胆红素干扰试验数据

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表1的为抗胆红素干扰试验的试验结果，其中样本中TB浓度0mg/dL是已知浓度的正常人体血清样本作为对照，设置5mg/dL、10mg/dL、15mg/dL、20mg/dL、25mg/dL这5个浓度胆红素干扰试验，样本1、样本2和样本3是在3个已知浓度的正常人体血清样本的基础上做的3组平行验证试验。

如表1试验数据所得，实施例2在TB浓度为20mg/dL和25mg/dL时，测值偏差很大，不符合正常浮动范围，因此实施例2组合的抗胆红素干扰能力弱。实施例1和实施例3的添加不同浓度胆红素的测试值与已知浓度的正常人体血清样本测值相差不大，均在正常浮动范围。对比TB浓度为20mg/dL和25mg/dL时实施例1和实施例3的测值发现，实施例1的数值浮动范围更小，因此实施例1组合的抗胆红素干扰能力最佳。

实施例2色原为DHBS适用波长为505nm，容易受到胆红素的干扰，表2数据中也证实这个问题，实施例2中稍高浓度的胆红素即会对测试值造成干扰，数据不准确；而实施例1和3使用色原MAOS适用波长为600nm，屏蔽掉胆红素的光吸收来解决胆红素干扰的问题。

1.2抗血红蛋白干扰试验：

表2抗血红蛋白干扰试验数据

表2的为抗血红蛋白干扰试验的试验结果，其中样本中HGB浓度0mg/dL是已知浓度的正常人体血清样本作为对照，设置50mg/dL、100mg/dL、200mg/dL、400mg/dL这4个浓度血红蛋白干扰试验，样本1、样本2和样本3是在3个已知浓度的正常人体血清样本的基础上做的3组平行验证试验。

如表2试验数据所得，在HGB≤200mg/dL时，实施例1/2/3的测值均在正常浮动范围内，数值稳定；在HGB为400mg/dL时，实施例2/3的测值的浮动值略大，抗血红蛋白的能力不如实施例1。实施例1的测值在HGB50-400mg/dL时测值稳定，测值均在正常浮动范围内，因此实施例1组合的抗血红蛋白干扰能力最佳。

1.3抗甘油三酯干扰试验：

表3抗甘油三酯干扰试验数据

表3的为抗甘油三酯干扰试验的试验结果，其中样本中TG浓度0mg/dL是已知浓度的正常人体血清样本作为对照，设置500mg/dL、1000mg/dL、2000mg/dL、4000mg/dL这4个浓度血红蛋白干扰试验，样本1、样本2和样本3是在3个已知浓度的正常人体血清样本的基础上做的3组平行验证试验。

如表3试验数据所得，在TG≤2000mg/dL时，实施例1/2/3的测值均在正常浮动范围内，数值稳定，其中实施例1的浮动范围最小。

综上所述，通过抗胆红素试验、抗血红蛋白试验和抗甘油三酯试验三个试验数据表1、表2和表3的分析对比可得：实施例1组合的综合抗干扰能力最佳，其次为实施例3。

试验例2、重复性试验：

每个实施例测试不同浓度的三份新鲜样本血清各10次，计算测试的均值、SD、CV后，三个实施例的结果做比对，数据如下：

表4重复性试验数据

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重复性的评价指标为CV值,根据相关的技术要求，尿酸的CV值应≤4％。

通过表4重复性试验数据可得，实施例1组合的重复性最佳，其CV数值最小且三次重复试验的稳定性均最佳；其次为实施例2，实施例2的重复性虽不如实施例1稳定，但也均在样本重复性允许的误差范围内；实施例3中，在对同一样本进行测值时，存在值差较大的情况，并且偶尔出现跳值，不符合对尿酸检测对重复性的要求，该实施例测值不符合要求。

因此实施例1中添加的丙三醇、BSA、吐温20联合应用对该尿酸试剂盒提高重复性有显著性效果。

试验例3、30天内的开封稳定性试验：

取三份不同浓度的血清，每份血清按照100μL的规格进行分装后，放至-20℃的冰箱中进行冷冻保存。在试验时，每个实施例重复测试同份血清三次后，取平均值与第一天的测值进行对比，并计算与第一天测值的相对偏差，相对偏差计算公式为：

相对偏差＝(第N天测值-第1天测值)÷第一天测值×100％

表5实施例1在30天内开封稳定性试验数据

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表6实施例2在30天内开封稳定性试验数据

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表7实施例3在30天内开封稳定性试验数据

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开封稳定性评价标准为样本测值变化相对偏差不超过10％。

如表5和表6所示，实施例1和实施例2试剂稳定性在30天内的变化都在允许的范围内，其中实施例1的样本测值变化幅度最小，稳定性最好。如表7所示，实施例3的试剂稳定性在30天内的变化也在允许的范围内，但会出现明显的变动现在，稳定性明显不如实施例1和实施例2。

综上所述，本发明最佳尿酸检测试剂盒组成为实施例1，其次效果为实施例2组合和实施例3组合。

上面以举例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例，凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。