一种分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌构建方法

技术领域

本发明涉及微生物的领域，特别涉及一种分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌构建方法。

背景技术

Escherichia coli Nissle 1917(EcN)是唯一一种无致病性的大肠杆菌，由Alfred Nissle于1917年分离得到，一直被用于治疗各种胃肠道疾病，包括炎症性肠病和肠易激综合征。作为一种大肠杆菌益生菌，EcN具有优良的安全性能，广泛应用于临床和疫苗、药物研发、生物工程等研究领域。生物工程领域中，EcN已成为生物医学治疗方向应用最广泛的底盘细菌之一，具有成熟的基因操纵工具和丰富的知识储备。

糖尿病是由环境和遗传等多重病因引起的以慢性高血糖为特征的综合性代谢紊乱疾病，患者体内胰岛素分泌相对或绝对不足，或靶组织对胰岛素不敏感。典型临床表现症状为“三多一少”：多饮、多食、多尿，体重降低。糖尿病分为Ⅰ型糖尿病(胰岛素依赖型)和Ⅱ型糖尿病(非胰岛素依赖型)。Ⅰ型糖尿病是有自身免疫缺陷或遗传倾向的人由于病毒感染等环境因素引起胰岛β细胞的异常反应，致使体内胰腺产生胰岛素的β细胞被完全破坏，从而完全丧失产生胰岛素的功能，导致胰岛素的绝对缺乏。Ⅰ型糖尿病常在青少年发病，发病率约占糖尿病患者总数的5％-10％，患者往往要终身注射外源胰岛素来维持生命。II型糖尿病的胰岛素未完全丧失，患者体内胰岛素相对不足，一般先进行饮食和运动疗法及口服降血糖药物治疗，待这些疗法不足以控制血糖水平时才需使用胰岛素。

胰岛素是由胰腺β细胞分泌的蛋白质类激素，由51个氨基酸残基组成。成熟的胰岛素的相对分子量为5784，由A链和B链组成，A链有21个氨基酸残基，B链有30个氨基酸残基。胰岛素原是胰岛素的前体，是一条单链多肽，含有86个氨基酸。胰岛素原的生物学作用同胰岛素基本一样，只是活性较弱，生物合成的胰岛素原在外周利用葡萄糖的能力只有胰岛素的5％-10％，但它的降糖作用较胰岛素持久，抑制肝脏释放葡萄糖的能力为利用外周葡萄糖能力的1.5倍。

免疫耐受是指在抗原刺激下，T细胞与B细胞不产生特异性免疫效应细胞和特异性抗体，不发生正常免疫应答的现象。免疫耐受按形成机制可分为固有性免疫耐受和适应性免疫耐受。固有性免疫耐受也称为天然性免疫耐受，为天然获得。适应性免疫耐受也称为获得性免疫耐受，可通过后天刺激获得。免疫调节细胞，如调节性T细胞(Treg细胞)，分泌抑制性细胞因子可导致免疫耐受。NOD小鼠研究证明，在胰岛素原持续性抗原刺激和白介素10免疫抑制细胞因子诱导下，能促进产生Treg细胞，而Treg细胞能产生CTLA4和TGF-β，从而抑制效应T细胞增殖，同时抑制NK细胞、B细胞等免疫活性细胞增殖，此免疫耐受效应结合抗CD3抗体能够逆转新发I型糖尿病、保留残留的β细胞功能、停止胰岛炎进展。

发明内容

为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌构建方法，该方法以EcN为底盘进行改造，利用大肠杆菌CRISPR/Cas9双质粒系统pEcas/pEcgRNA，将阿拉伯糖启动子、大肠杆菌外膜蛋白ompF信号肽、人胰岛素原基因整合到EcN染色体，同时敲除EcN的胞壁脂蛋白lpp基因，促进周质蛋白的向外渗漏，构建能分泌表达人胰岛素原、无抗性标记的遗传工程菌株EcN-Δlpp-INS菌株，该菌株为可服用的益生菌，诱导剂L-阿拉伯糖亦为可食用成分，构建该菌株的目的是递送人胰岛素原至肠粘膜，激发免疫耐受。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌构建方法，该方法包括如下步骤：

S1、pEcgRNA-N20载体构建；

具体包括：S11、合成靶点N20，

合成靶点N20序列：N20-F(TAGTGTTACTAAATGTAACTAAAA)、N20-R(AAACTTTTAGTTACATTTAGTAAC)。退火制备N20靶点接头：10μL N20-F与10μL N20-R混合，退火条件为95℃，5min；25℃，∞。

S12、对pEcgRNA载体进行酶切；

使用Bsa I-HF限制性内切酶对pEcgRNA载体进行酶切，体系如下：pEcgRNA 2-3μg，Bsa I-HF限制性内切酶4-5μL，10x Cutsmart buffer 10μL，ddH

S13、连接pEcgRNA Bsa I酶切载体和N20靶点接头；

使用T4 DNA连接酶连接pEcgRNA Bsa I酶切载体和N20靶点接头，体系如下：pEcgRNA Bsa I酶切载体回收片段50-100ng，10x T4 DNA ligase buffer 1μL，N20靶点接头1μL，T4 DNA ligase 1μL，ddH

S14、转化DH5α感受态：

取100μL冰上融化DH5α感受态细胞，加入T4连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激50sec，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置复苏30min后，涂布于无菌LB+Spec培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养。

S2、重叠PCR获得INS表达框；

具体包括：

S21、设计INS表达框的基因序列，INS表达框各片段基因序列为：

up：AAAGGAGTAGGGAACACGCAATAATGCGCCAGAAACGGAGGGTAATGCGGTTAATAAAAAGAGTTGATCGGTAGTGAAATTAAAACCGATTTTATTGAGATTAACAGTAACTGCGCTAAATAGCATCCAGACACAGAAGGCAAAAAGTAGGCAACTGACTGATATCCAGAGGTTTCTTCGTGCAATATGCTTTCCTTTATTTTCCCAGAAGGCCGGATTTTCTGGTTTCCAGTCGCGTAAAAGATAACGACTATTTTTCTCATTTTGCAGTGCCATATTGTTCCTCACATGCACACATTGGTAATGAAAAAAAGACAAAACAGGAGGTAAGGCGCAATAGCCAGTTATTAGAATTAAGGATGAATCAGGTGAAGTGCT；

P

ompF：ATGATGAAGCGCAATATTCTGGCAGTGATCGTCCCTGCTCTGTTAGTAGCAGGTACTGCAAACGCT；

INS：TTTGTTAACCAGCATCTGTGCGGGTCGCACTTAGTAGAAGCCCTGTATCTGGTCTGTGGTGAACGCGGTTTTTTCTATACCCCGAAAACTCGTCGCGAAGCGGAAGATCTGCAGGTGGGCCAAGTTGAACTGGGTGGCGGTCCAGGCGCTGGTAGCTTGCAGCCGTTAGCACTGGAAGGGAGTTTGCAAAAACGTGGCATCGTGGAACAGTGCTGTACGTCTATTTGTTCCCTGTACCAGCTGGAAAATTACTGCAACCACCATCATCATCATCATTAA；

T1：CAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAAT；

down：TTAACTGCCGGGCCGTAGACCCGACAATTATTTTAGCCACGACGTGTCGCCAGCCAGCAGAGCAGGGAACCGCCGCAGACCATTAGCGCGCCTTGCCAGAACGAGAACGACAGCGGGGCGCTGAGTAACACGGCTGCAAGTGCTGAGGAAAGGACGGGCGTAAAATACGAACCTACCGCCATTATGGTGACGTTGCCATGTAATATACCGACATTCCATGCAGCATAAGCAAATCCTAAGGTAAATGCCGCAGAGATGAGTTTAATCATGACGGGCGTGCTAAATACCATTTCTGGTTGTGGCGTAAGAAAATAGTAAACCCACAGACTTGCTCCCGTTAGCAGGACAAAAACGGTAATTCCGTTAAATCCACGTGCG。

S22、设计扩增引物，扩增引物的基因序列如下：

up-F：AGAGTCGACCTGCAGAAGCTTAAAGGAGTAGGGAACACGCA；

up-R：CAAATATGTATCCGCTCATGTCTCAGCACTTCACCTGATTCATCC；

BAD-F：GGATGAATCAGGTGAAGTGCTGAGACATGAGCGGATACATATTTG；

BAD-R：AGAATATTGCGCTTCATCATTTTTTATAACCTCCTTAGAG；

ompF-F：CTCTAAGGAGGTTATAAAAA ATGATGAAGCGCAATATTCT；

ompF-R：GCACAGATGCTGGTTAACAAAAGCGTTTGCAGTACCTGCTAC；

INS-F：GTAGCAGGTACTGCAAACGCTTTTGTTAACCAGCATCTGTGC；

INS-R：ACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAATGATGATGATGATGGTG；

T1-F：CACCATCATCATCATCATTAACAAATAAAACGAAAGGCTCAGT；

T1-R：GTCTACGGCCCGGCAGTTAAATTTGTCCTACTCAGGAGAGC；

down-F：GCTCTCCTGAGTAGGACAAATTTAACTGCCGGGCCGTAGAC；

down-R：GGAGCTGCACATGAACTCGAGCGCACGTGGATTTAACGGAAT。

S23、进行扩增。

首先PCR扩增获得up同源片段、阿拉伯糖启动子P

扩增体系为：KOD FX neo mix buffer 18.5μL，F引物0.5μL(10μM)，R引物0.5μL(10μM)，模板0.5μL。

扩增条件为：

up：引物为up-F,up-R，模版为EcN基因组，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，30s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

P

ompF：引物为ompF-F,ompF-R，模版为合成基因序列ompF，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，20s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

INS：引物为INS-F,INS-R，模版为合成基因序列INS，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，30s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

T1：引物为T1-F,T1-R，模版为合成基因序列T1，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，20s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

down：引物为down-F,down-R，模版为EcN基因组，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，30s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

up-P

ompF-INS-T1：引物为ompF-F,T1-R，模版为ompF,INS,T1，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，30s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

up-P

S3、pEcgRNA-N20-INS载体构建；

具体包括：S31、对pEcgRNA-N20载体进行酶切；

使用HindIII-HF、XhoI限制性内切酶对pEcgRNA-N20载体进行酶切，体系如下：pEcgRNA-N20 2-3μg，HindIII-HF限制性内切酶4μL，XhoI限制性内切酶4μL，10x Cutsmartbuffer 10μL，ddH

S32、连接pEcgRNA-N20酶切载体和up-P

使用天根EasyGeno Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒连接pEcgRNA-N20酶切载体和up-P

S33、转化DH5α感受态：

取100μL冰上融化DH5α感受态细胞，加入同源重组连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激50sec，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置复苏30min后，涂布于无菌LB+Spec培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养。

S4、lpp靶点设计及合成；

根据EcN基因组的lpp基因序列设计靶点lpp-N20并进行合成；

其中：lpp-N20-F的基因序列为TAGTAATCCTGGGTTCTACTCTGC，lpp-N20-R的基因序列为AAACGCAGAGTAGAACCCAGGATT。

S5、pEcgRNA-lpp载体构建；

取lpp-N20-F 10μL、lpp-N20-R 10μL放入PCR仪进行退火以形成双链，退火条件为95℃，5min；25℃，∞。

使用T4 DNA连接酶连接pEcgRNA Bsa I酶切载体和lpp-N20靶点，体系如下：pEcgRNA Bsa I酶切载体回收片段50-100ng，10x T4 DNA ligase buffer 1μL，lpp-N20靶点1μL，T4 DNA ligase 1μL，ddH

转化DH5α感受态：取100μL冰上融化DH5α感受态细胞，加入T4连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激50sec，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置复苏30min后，涂布于无菌LB+Spec培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养。

S6、lpp上下游同源序列引物设计及扩增；

根据EcN基因组的lpp基因序列设计上下游同源序列引物并进行合成，上游同源片段引物为lpp-up-F、lpp-up-R，下游同源片段引物为lpp-down-F、lpp-down-R。

进一步，lpp-up-F的基因序列为TTGTGCCGCAGCTGGTTAAA，lpp-up-R的基因序列为GTTGTCCAGACGCTGGTTAGAAGAAGCATCGAACGCTGGG，lpp-down-F的基因序列为CCCAGCGTTCGATGCTTCTTCTAACCAGCGTCTGGACAAC，lpp-down-R的基因序列为CAGCAGGCTTTACGCAATTT。

以EcN基因组为模板进行上游同源片段lpp-up PCR扩增，体系如下：PhantaSuper-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，EcN基因组模板1μL，lpp-up-F 0.5μL，lpp-up-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞；以EcN基因组为模板进行下游同源片段lpp-down PCR扩增，体系如下：Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，EcN基因组模板1μL，lpp-down-F 0.5μL，lpp-down-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞。

以上游同源片段和下游同源片段为模板进行重叠PCR扩增，得到上下游同源片段lpp-up-down，体系如下：Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，lpp-up 0.5μL，lpp-down 0.5μL，lpp-up-F 0.5μL，lpp-down-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，45sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞。

S7、基因敲除及效果检测

使用氯化钙和甘油，通过化学法将EcN菌株制备成感受态，pEcas质粒转化EcN感受态，涂布于无菌LB+Kana培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养，得到含pEcas质粒的EcN菌株；同样地，再通过化学法将含pEcas质粒的EcN菌株制备成感受态，将pEcgRNA-lpp载体和lpp上下游同源片段一起转化含pEcas质粒的EcN感受态。

pEcgRNA-lpp载体和lpp上下游同源片段一起转化含pEcas质粒的EcN感受态，体系如下：感受态200μL，pEcgRNA-lpp 25μL(1.5μg)，上下游同源片段lpp-up-down 20μL(5μg)；取200μL冰上融化含pEcas质粒的EcN感受态细胞，按以上体系加入pEcgRNA-lpp载体及上下游片段，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置30min复苏，全部涂布于LB+Kana+Spec培养基上，37℃静置过夜培养，进行CRISPR基因敲除。

通过菌落PCR对基因敲除效果进行检测，挑取LB+Kana+Spec培养基平板上的单克隆菌落进行菌落PCR，以EcN基因组为模板设为对照，体系如下：1x Taq PCR Master Mix6.5μL，lpp-up-F 0.25μL，lpp-down-R 0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL。PCR条件：95℃，7min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，1min20sec，35cycles；72℃，7min；10℃，∞。

S8、质粒消除；

按以下步骤进行质粒消除：取10μL菌液加入1.5mL的LB+kana+鼠李糖(10mM)液体培养基中，用于消除pEcgRNA-lpp质粒，摇床培养箱37℃200rpm培养6.5h，吸取菌液20uL，将枪头打入1.5mL单纯的LB培养液37℃摇床培养～1.5h，涂在LB+蔗糖(10g/L)的平板培养基上，用于消除pEcas质粒，37℃过夜。

S9、两个质粒均消除的EcN-Δlpp单克隆菌进行摇菌培养，提取其基因组，使用lpp-up-F和lpp-down-R引物对lpp基因进行扩增，得到EcN-Δlpp菌株；

进一步，取两种质粒均消除的单克隆菌，进行菌株基因组提取和PCR扩增，步骤如下：取过夜培养菌液100μL，4000rpm离心5min，弃去上清，加入Buffer A 50μL，混匀，95℃反应15min，加入Buffer B 50μL，混匀，4000rpm离心5min，上清即为基因组；使用配套T5酶进行PCR扩增，体系如下：T5酶mix buffer 15μL，基因组上清2μL，lpp-up-F 1.2μL，lpp-down-R 1.2μL，ddH

S10、EcN-Δlpp-INS菌株构建；

通过化学法将含pEcas质粒的EcN-Δlpp菌株制备成感受态，使用含人胰岛素原表达框的质粒pEcgRNA-N20-INS转化含pEcas质粒的EcN-Δlpp感受态：取EcN-Δlpp(含pEcas质粒)感受态200μL，加入pEcgRNA-N20-INS～2μg，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300uL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置30min复苏，全部涂布于LB+Kana+Spec培养基上，37℃静置过夜培养，进行CRISPR基因敲除及人胰岛素原表达框插入。

S11、INS表达框插入效果检测；

具体地说，通过菌落PCR对人胰岛素原表达框插入情况进行检测，挑取LB+Kana+Spec培养基平板上的单克隆菌落进行菌落PCR，以EcN-Δlpp基因组为模板设为对照，F引物为INS表达框中的引物，R引物为插入位置下游EcN基因组上的引物，体系如下：1x Taq PCRMaster Mix 6.5μL，T1-F 0.25μL，INS-EcN-down-R(GACGGTTTTCGCTGTTGACG)0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL。PCR条件：95℃，7min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，2min，35cycles；72℃，7min；10℃，∞。

S12、质粒消除；

按以下步骤进行质粒消除：取10μL菌液加入1.5mL的LB+kana+鼠李糖(10mM)液体培养基中，用于消除pEcgRNA-N20-INS质粒，摇床培养箱37℃200rpm培养6.5h，吸取菌液20uL，将枪头打入1.5mL单纯的LB培养液37℃摇床培养～1.5h，涂在LB+蔗糖(10g/L)的平板培养基上，用于消除pEcas质粒，37℃过夜；质粒消除后即制得EcN-Δlpp-INS菌株。

每块培养基挑取16-24个(2-3排)单克隆菌落，置于20uL水中，取3uL分别点在LB、LB+Kana、LB+Spec三种平板培养基上，恒温培养箱37℃过夜，通过统计三种培养基上的生长情况，判断两种质粒是否消除。

进一步，取两种质粒均消除的单克隆菌(EcN-Δlpp-INS菌株)，进行菌株基因组提取和PCR扩增，步骤如下：取过夜培养菌液100μL，4000rpm离心5min，弃去上清，加入BufferA 50μL，混匀，95℃反应15min，加入Buffer B 50μL，混匀，4000rpm离心5min，上清即为基因组。使用配套T5酶进行PCR扩增，体系如下：T5酶mix buffer 15μL，基因组上清2μL，BAD-F1.2μL，T1-R 1.2μL，ddH

进一步，EcN-Δlpp-INS菌株还可以进行诱导表达：取EcN-Δlpp-INS菌株于LB平板培养基上划线培养，第二天从其上挑取单克隆菌落于10mL LB液体培养基中37℃、200rpm过夜摇菌，第三天1：100接种到1000mL LB培养基中，37℃培养至OD

进一步，EcN-Δlpp-INS菌株还可以进行蛋白提取：离心下来的菌按1g菌，10mL0.5mg/mL溶菌酶的量重悬，4℃消化1小时，10000rpm/min离心，离心上清即为周质蛋白，倒出0.22μm滤膜过滤备用。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明选取了可食用的益生菌EcN作为底盘细菌，利用大肠杆菌CRISPR/Cas9双质粒系统pEcas/pEcgRNA，首先构建了pEcgRNA-lpp载体，敲除了EcN的胞壁脂蛋白lpp基因，将其改造为周质蛋白向外渗漏的EcN-Δlpp菌株。随后，通过生物合成和重叠PCR扩增，得到插入片段即人胰岛素原表达框，其包含阿拉伯糖启动子、大肠杆菌外膜蛋白ompF信号肽、人胰岛素原基因。通过T4连接和同源重组构建了包含靶点N20和人胰岛素原表达框的pEcgRNA-N20-INS载体，结合pEcas质粒将人胰岛素原表达框插入至EcN-Δlpp菌株，构建了无抗性标记、能分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌——EcN-Δlpp-INS菌株，EcN-Δlpp-INS菌株诱导表达的培养基上清中含有人胰岛素原，同时，诱导剂L-阿拉伯糖为可食用成分，对维持血糖稳定有积极作用。

该分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌EcN-Δlpp-INS菌株，为I型糖尿病活菌药物开发奠定了基础，后续研究会着眼于I型糖尿病活菌药物的进一步完善，构建分泌表达人白介素10的菌株，该细胞因子具有促进形成免疫耐受的作用，其与人胰岛素原抗原刺激协同作用，诱导免疫耐受形成。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为pEcgRNA载体Bsa I酶切产物凝胶电泳示意图。

图3为pEcgRNA-N20菌落PCR示意图。

图4为pEcgRNA-N20酶切验证示意图。

图5为重叠PCR扩增片段示意图。

图6为pEcgRNA-N20-INS菌落PCR示意图。

图7为pEcgRNA-N20-INS酶切验证示意图。

图8为lpp上游同源序列和下游同源序列示意图。

图9为lpp上下游同源序列up-down示意图。

图10为pEcgRNA-lpp菌落PCR示意图。

图11为pEcgRNA-lpp酶切验证示意图。

图12菌落PCR验证lpp基因的敲除情况示意图。

图13为EcN-Δlpp质粒消除示意图。

图14为质粒消除的EcN-Δlpp基因组扩增示意图。

图15为菌落PCR验证INS表达框的插入情况示意图。

图16为EcN-Δlpp-INS质粒消除示意图。

图17为质粒消除的EcN-Δlpp-INS基因组扩增示意图。

图18为EcN-Δlpp-INS上清和周质蛋白Western Blot检测示意图。

图19为鉴定肽段氨基酸序列匹配情况示意图。

图20为鉴定肽段序列质谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1所示，为本发明所实现的技术路线，图中所示，本发明所实现的分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌构建方法，包括如下步骤：

S1、pEcgRNA-N20载体构建；

具体包括：S11、合成靶点N20，合成靶点N20序列：N20-F(TAGTGTTACTAAATGTAACTAAAA)、N20-R(AAACTTTTAGTTACATTTAGTAAC)。退火制备N20靶点接头：10μL N20-F与10μL N20-R混合，退火条件为95℃，5min；25℃，∞。

S12、对pEcgRNA载体进行酶切；使用Bsa I-HF限制性内切酶对pEcgRNA载体进行酶切，体系如下：pEcgRNA 2-3μg，Bsa I-HF限制性内切酶4-5μL，10x Cutsmart buffer 10μL，ddH

S13、连接pEcgRNA Bsa I酶切载体和N20靶点接头；使用T4 DNA连接酶连接pEcgRNA Bsa I酶切载体和N20靶点接头，体系如下：pEcgRNA Bsa I酶切载体回收片段50-100ng，10x T4 DNA ligase buffer1μL，N20靶点接头1μL，T4 DNA ligase 1μL，ddH

S14、转化DH5α感受态：取100μL冰上融化DH5α感受态细胞，加入T4连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激50sec，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置复苏30min后，涂布于无菌LB+Spec培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养。

S2、重叠PCR获得INS表达框；

包括：S21、设计INS表达框的基因序列，INS表达框各片段基因序列如表1所示。

S22、设计扩增引物，扩增引物的基因序列如表2所示。

S23、进行扩增。

PCR扩增获得up同源片段、阿拉伯糖启动子P

扩增体系为：KOD FX neo mix buffer 18.5μL，F引物0.5μL(10μM)，R引物0.5μL(10μM)，模板0.5μL。

扩增条件为：

up：引物为up-F,up-R，模版为EcN基因组，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，30s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

P

ompF：引物为ompF-F,ompF-R，模版为合成基因序列ompF，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，20s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

INS：引物为INS-F,INS-R，模版为合成基因序列INS，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，30s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

T1：引物为T1-F,T1-R，模版为合成基因序列T1，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，20s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

down：引物为down-F,down-R，模版为EcN基因组，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，30s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

up-P

ompF-INS-T1：引物为ompF-F,T1-R，模版为ompF,INS,T1，PCR条件：94℃，2min；98℃，20s；68℃，30s，35cycles；68℃，10min；10℃，∞；

up-P

S3、pEcgRNA-N20-INS载体构建；

包括：S31、对pEcgRNA-N20载体进行酶切；

S32、连接pEcgRNA-N20酶切载体和up-P

S33、转化DH5α感受态：

S4、lpp靶点设计及合成；根据EcN基因组的lpp基因序列设计靶点lpp-N20并进行合成；

S5、pEcgRNA-lpp载体构建；

S6、lpp上下游同源序列引物设计及扩增；

根据EcN基因组的lpp基因序列设计上下游同源序列引物并进行合成，上游同源片段引物为lpp-up-F、lpp-up-R，下游同源片段引物为lpp-down-F、lpp-down-R。

以EcN基因组为模板进行上游同源片段lpp-up PCR扩增，体系如下：PhantaSuper-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，EcN基因组模板1μL，lpp-up-F 0.5μL，lpp-up-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞；以EcN基因组为模板进行下游同源片段lpp-down PCR扩增，体系如下：Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，EcN基因组模板1μL，lpp-down-F 0.5μL，lpp-down-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞。

以上游同源片段和下游同源片段为模板进行重叠PCR扩增，得到上下游同源片段lpp-up-down，体系如下：Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，lpp-up 0.5μL，lpp-down 0.5μL，lpp-up-F 0.5μL，lpp-down-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，45sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞。

S7、基因敲除及效果检测；

使用氯化钙和甘油，通过化学法将EcN菌株制备成感受态，pEcas质粒转化EcN感受态，涂布于无菌LB+Kana培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养，得到含pEcas质粒的EcN菌株；同样地，再通过化学法将含pEcas质粒的EcN菌株制备成感受态，将pEcgRNA-lpp载体和lpp上下游同源片段一起转化含pEcas质粒的EcN感受态。

取200μL冰上融化含pEcas质粒的EcN感受态细胞，加入pEcgRNA-lpp载体及上下游片段，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置30min复苏，全部涂布于LB+Kana+Spec培养基上，37℃静置过夜培养，进行CRISPR基因敲除。

通过菌落PCR对基因敲除效果进行检测。

S8、质粒消除；

消除pEcgRNA-lpp质粒和消除pEcas质粒。

S9、两个质粒均消除的EcN-Δlpp单克隆菌进行摇菌培养，提取其基因组，使用lpp-up-F和lpp-down-R引物对lpp基因进行扩增，得到EcN-Δlpp菌株；

S10、EcN-Δlpp-INS菌株构建；

通过化学法将含pEcas质粒的EcN-Δlpp菌株制备成感受态，使用含人胰岛素原表达框的质粒pEcgRNA-N20-INS转化含pEcas质粒的EcN-Δlpp感受态：取EcN-Δlpp(含pEcas质粒)感受态200μL，加入pEcgRNA-N20-INS～2μg，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300uL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置30min复苏，全部涂布于LB+Kana+Spec培养基上，37℃静置过夜培养，进行CRISPR基因敲除及人胰岛素原表达框插入。

S11、INS表达框插入效果检测；

具体地说，通过菌落PCR对人胰岛素原表达框插入情况进行检测，挑取LB+Kana+Spec培养基平板上的单克隆菌落进行菌落PCR，以EcN-Δlpp基因组为模板设为对照，F引物为INS表达框中的引物，R引物为插入位置下游EcN基因组上的引物，体系如下：1x Taq PCRMaster Mix 6.5μL，T1-F 0.25μL，INS-EcN-down-R(GACGGTTTTCGCTGTTGACG)0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL。PCR条件：95℃，7min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，2min，35cycles；72℃，7min；10℃，∞。

S12、质粒消除；

消除pEcgRNA-N20-INS质粒，消除pEcas质粒。

S13、质粒消除后即制得EcN-Δlpp-INS菌株。

S14、EcN-Δlpp-INS菌株还可以进行诱导表达：取EcN-Δlpp-INS菌株于LB平板培养基上划线培养，第二天从其上挑取单克隆菌落于10mL LB液体培养基中37℃、200rpm过夜摇菌，第三天1：100接种到1000mL LB培养基中，37℃培养至OD

S15、EcN-Δlpp-INS菌株还可以进行蛋白提取：离心下来的菌按1g菌，10mL0.5mg/mL溶菌酶的量重悬，4℃消化1小时，10000rpm/min离心，离心上清即为周质蛋白，倒出0.22μm滤膜过滤备用。

S16、Western-blot检测和质谱检测。

SDS-PAGE电泳后进行转膜，转膜后PVDF膜置于TBST中清洗，进行TBST洗膜，洗膜后进行显影，成像仪拍照，就是Western-blot检测。

SDS-PAGE电泳后取出SDS-PAGE胶，进行染色，染色后切取诱导上清和诱导周质蛋白泳道在5-15kD区域的蓝色条带1cm*2cm，进行串联质谱分析。

下面结合实验对本发明的实施进行说明。

实验一：pEcgRNA-N20-INS载体构建

1实验材料

1.1实验仪器：Wix电泳仪、PCR仪、水浴锅、离心机、Azure300成像仪、摇床培养箱、恒温培养箱。

1.2实验试剂：BsaⅠ-HF限制性内切酶、T4 DNA连接酶、BamHI-HF限制性内切酶、HindIII-HF限制性内切酶、XhoI限制性内切酶、DL2000 DNA Ladder、琼脂糖、全式金DH5α感受态、LB肉汤、盐酸大观霉素五水合物、2x Taq PCR Master Mix(Blue)、TOYOBO KOD FXNeo高保真性DNA聚合酶、天根EasyGeno Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒。

1.3实验材料：全式金凝胶快速纯化试剂盒、擎科生物质粒小提试剂盒、全式金5分钟DNA快速纯化试剂盒、无菌培养皿。

2实验方法

2.1pEcgRNA-N20载体构建

使用BsaⅠ-HF限制性内切酶对pEcgRNA载体进行酶切，体系如下：pEcgRNA 2-3μg，Bsa I-HF限制性内切酶4-5μL，10x Cutsmart buffer 10μL，ddH

合成靶点N20序列：N20-F(TAGTGTTACTAAATGTAACTAAAA)、N20-R(AAACTTTTAGTTACATTTAGTAAC)。退火制备N20靶点接头：10μL N20-F与10μL N20-R混合，退火条件为95℃，5min；25℃，∞。

使用T4 DNA连接酶连接pEcgRNA BsaⅠ酶切载体和N20靶点接头，体系如下：pEcgRNA BsaⅠ酶切载体回收片段50-100ng，10x T4 DNA ligase buffer 1μL，N20靶点接头1μL，T4 DNA ligase 1μL，ddH

转化DH5α感受态：取100μL冰上融化DH5α感受态细胞，加入T4连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激50sec，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置复苏30min后，涂布于无菌LB+Spec培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养。

挑取单克隆菌落进行菌落PCR验证，菌落PCR引物为N20-F(TAGTGTTACTAAATGTAACTAAAA)、pEcgRNA-con-R(GACGCTCAGTGGAACGAAAA)，反应体系如下：1x Taq PCR Master Mix 6.5μL，N20-F 0.25μL，pEcgRNA-con-R 0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL。PCR条件：95℃，7min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，1min，35cycles；72℃，7min；10℃，∞。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：150V，15min。

挑取菌落PCR验证的阳性克隆于4.3mL LB+Spec液体培养基中，37℃200rpm过夜摇菌，第二天按擎科生物质粒小提试剂盒说明书抽提质粒，使用BamHI-HF和HindIII-HF限制性内切酶进行酶切验证。酶切体系如下：质粒～400ng，BamHI-HF限制性内切酶0.5μL，HindIII-HF限制性内切酶0.5μL，10x Cutsmart buffer 2μL，ddH

2.2重叠PCR获得INS表达框

对人胰岛素原基因进行了密码子优化，经擎科生物合成作为PCR扩增的模板，信号肽ompF基因序列、T1基因序列进行合成作为PCR扩增的模板。INS表达框各片段基因序列如表1所示。

设计扩增引物，如表2所示。首先PCR扩增获得up同源片段、阿拉伯糖启动子P

表1 INS表达框各片段基因序列

表2扩增引物

表3扩增条件

2.3 pEcgRNA-N20-INS载体构建

使用HindIII-HF、XhoI限制性内切酶对pEcgRNA-N20载体进行酶切，体系如下：pEcgRNA-N20 2-3μg，HindIII-HF限制性内切酶4μL，XhoI限制性内切酶4μL，10x Cutsmartbuffer 10μL，ddH

up-P

使用天根EasyGeno Assembly Cloning Kit同源重组试剂盒连接pEcgRNA-N20酶切载体和up-P

转化DH5α感受态：取100μL冰上融化DH5α感受态细胞，加入同源重组连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激50sec，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置复苏30min后，涂布于无菌LB+Spec培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养。

挑取单克隆菌落进行菌落PCR验证，菌落PCR引物为BAD-F、BAD-R，反应体系如下：1x Taq PCR Master Mix 6.5μL，BAD-F 0.25μL，BAD-R 0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL。PCR条件：95℃，7min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，1min30sec，35cycles；72℃，7min；10℃，∞。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：150V，15min。

挑取菌落PCR验证的阳性克隆于4.3mL LB+Spec液体培养基中，37℃200rpm过夜摇菌，第二天按擎科生物质粒小提试剂盒说明书抽提质粒，使用HindIII-HF和XhoI限制性内切酶进行酶切验证。酶切体系如下：质粒～400ng，XhoI限制性内切酶0.5μL，HindIII-HF限制性内切酶0.5μL，10x Cutsmart buffer 2μL，ddH

3、结果分析

3.1 pEcgRNA-N20载体构建

pEcgRNA载体BsaⅠ酶切产物凝胶电泳结果如图2所示，有2093bp、571bp、441bp三个条带，对2093bp大小的片段进行切胶回收，用于后续靶点N20的连入。

pEcgRNA-N20 T4连接后菌落PCR凝胶电泳结果如图3所示，空载pEcgRNA作为对照，连接上靶点N20的阳性克隆可以扩增出约1000bp的片段。阳性克隆摇菌、抽提质粒后使用BamHI和HindIII限制性内切酶进行酶切验证，酶切产物凝胶电泳结果如图4所示，连接上靶点N20的阳性克隆只能酶切出约2000bp和约150bp的片段，而空载pEcgRNA可以酶切出约2000bp、1000bp和约120bp三种大小的片段。酶切正确的阳性克隆经测序验证后得到序列正确的pEcgRNA-N20载体。

3.2重叠PCR获得INS表达框

扩增片段的凝胶电泳结果如图5所示，up同源片段378bp，阿拉伯糖启动子P

3.3 pEcgRNA-N20-INS载体构建

pEcgRNA-N20-INS同源重组后菌落PCR凝胶电泳结果如图6所示，连接上INS表达框up-P

实验二：EcN-Δlpp菌株构建

1实验材料

1.1实验仪器：Wix电泳仪、PCR仪、水浴锅、离心机、Azure300成像仪、摇床培养箱、恒温培养箱。

1.2实验试剂：T4 DNA连接酶、BamHI-HF限制性内切酶、HindIII-HF限制性内切酶、DL2000 DNA Ladder、琼脂糖、全式金DH5α感受态、LB肉汤、盐酸大观霉素五水合物、硫酸卡那霉素、2x Taq PCR Master Mix(Blue)、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase高保真性DNA聚合酶、氯化钙、甘油、鼠李糖一水、蔗糖、擎科菌类直扩试剂盒。

1.3实验材料：擎科生物质粒小提试剂盒、全式金5分钟DNA快速纯化试剂盒、无菌培养皿。

2实验方法

2.1 lpp靶点设计及合成

根据EcN基因组的lpp基因序列设计靶点lpp-N20并进行合成：lpp-N20-F(TAGTAATCCTGGGTTCTACTCTGC)、lpp-N20-R(AAACGCAGAGTAGAACCCAGGATT)。

2.2 lpp上下游同源序列引物设计及扩增

根据EcN基因组的lpp基因序列设计上下游同源序列引物并进行合成，上游同源片段引物为lpp-up-F、lpp-up-R，下游同源片段引物为lpp-down-F、lpp-down-R，如表4所示。

以EcN基因组为模板进行上游同源片段lpp-up PCR扩增，体系如下：PhantaSuper-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，EcN基因组模板1μL，lpp-up-F 0.5μL，lpp-up-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞。以EcN基因组为模板进行下游同源片段lpp-down PCR扩增，体系如下：Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，EcN基因组模板1μL，lpp-down-F 0.5μL，lpp-down-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞。

以上游同源片段和下游同源片段为模板进行重叠PCR扩增，得到上下游同源片段lpp-up-down，体系如下：Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase mix buffer 18μL，lpp-up 0.5μL，lpp-down 0.5μL，lpp-up-F 0.5μL，lpp-down-R 0.5μL，PCR扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，45sec，35cycles；72℃，10min；10℃，∞。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为150V，15min。扩增产物按全式金5分钟DNA快速纯化试剂盒进行回收。

表4 lpp上下游同源片段扩增引物

2.3、pEcgRNA-lpp载体构建

取lpp-N20-F 10μL、lpp-N20-R 10μL放入PCR仪进行退火以形成双链，退火条件为95℃，5min；25℃，∞。

使用T4 DNA连接酶连接pEcgRNA BsaⅠ酶切载体和lpp-N20靶点，体系如下：pEcgRNA BsaⅠ酶切载体回收片段50-100ng，10x T4 DNA ligase buffer 1μL，lpp-N20靶点1μL，T4 DNA ligase 1μL，ddH

转化DH5α感受态：取100μL冰上融化DH5α感受态细胞，加入T4连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激50sec，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置复苏30min后，涂布于无菌LB+Spec培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养。

挑取单克隆菌落进行菌落PCR验证，菌落PCR引物为lpp-N20-F、pEcgRNA-con-R，反应体系如下：1x Taq PCR Master Mix 6.5μL，lpp-N20-F 0.25μL，pEcgRNA-con-R 0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL。PCR条件：95℃，7min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，1min，35cycles；72℃，7min；10℃，∞。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：150V，15min。

挑取菌落PCR验证的阳性克隆于4.3mL LB+Spec液体培养基中，37℃200rpm过夜摇菌，第二天按擎科生物质粒小提试剂盒说明书抽提质粒，使用BamHI-HF和HindIII-HF限制性内切酶进行酶切验证。酶切体系如下：质粒～400ng，BamHI-HF限制性内切酶0.5μL，HindIII-HF限制性内切酶0.5μL，10x Cutsmart buffer 2μL，ddH

2.4、基因敲除及效果检测

使用氯化钙和甘油，通过化学法将EcN菌株制备成感受态，pEcas质粒转化EcN感受态，涂布于无菌LB+Kana培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养，得到含pEcas质粒的EcN菌株。同样地，再通过化学法将含pEcas质粒的EcN菌株制备成感受态。pEcgRNA-lpp载体和lpp上下游同源片段一起转化含pEcas质粒的EcN感受态，体系如下：感受态200μL，pEcgRNA-lpp 25μL(1.5μg)，上下游同源片段lpp-up-down 20μL(5μg)。取200μL冰上融化含pEcas质粒的EcN感受态细胞，按以上体系加入pEcgRNA-lpp载体及上下游片段，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置30min复苏，全部涂布于LB+Kana+Spec培养基上，37℃静置过夜培养，进行CRISPR基因敲除。

通过菌落PCR对基因敲除效果进行检测，挑取LB+Kana+Spec培养基平板上的单克隆菌落进行菌落PCR，以EcN基因组为模板设为对照，体系如下：1x Taq PCR Master Mix6.5μL，lpp-up-F 0.25μL，lpp-down-R0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL。PCR条件：95℃，7min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，1min20sec，35cycles；72℃，7min；10℃，∞。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：150V，15min。挑取菌落PCR验证的阳性克隆于4.3mL LB+Kana+Spec液体培养基中，37℃200rpm过夜摇菌。

按以下步骤进行质粒消除：取10μL菌液加入1.5mL的LB+kana+鼠李糖(10mM)液体培养基中，用于消除pEcgRNA-lpp质粒，摇床培养箱37℃200rpm培养6.5h，吸取菌液20uL，将枪头打入1.5mL单纯的LB培养液37℃摇床培养～1.5h，涂在LB+蔗糖(10g/L)的平板培养基上，用于消除pEcas质粒，37℃过夜。每块培养基挑取16-24个(2-3排)单克隆菌落，置于20μL水中，取3μL分别点在LB、LB+Kana、LB+Spec三种平板培养基上，恒温培养箱37℃过夜，通过统计三种培养基上的生长情况，判断两种质粒是否消除。

取两种质粒均消除的单克隆菌，使用擎科菌类直扩试剂盒进行菌株基因组提取和PCR扩增，步骤如下：取过夜培养菌液100μL，4000rpm离心5min，弃去上清，加入Buffer A 50μL，混匀，95℃反应15min，加入Buffer B 50μL，混匀，4000rpm离心5min，上清即为基因组。使用配套T5酶进行PCR扩增，体系如下：T5酶mix buffer 15μL，基因组上清2μL，lpp-up-F1.2μL，lpp-down-R 1.2μL，ddH

3、结果分析

3.1、lpp上下游同源序列扩增

lpp上游同源序列、下游同源序列、上下游同源序列PCR扩增结果如图8、图9所示，上游同源序列lpp-up片段大小为343bp，lpp下游同源序列lpp-down片段大小为280bp，上下游同源序列lpp-up-down片段大小为623bp。

3.2、pEcgRNA-lpp载体构建

pEcgRNA-lpp T4连接后菌落PCR凝胶电泳结果如图10所示，空载pEcgRNA作为对照，连接上靶点lpp的阳性克隆可以扩增出约1000bp的片段。阳性克隆摇菌、抽提质粒后使用BamHI和HindIII限制性内切酶进行酶切验证，酶切产物凝胶电泳结果如图11所示，连接上靶点N20的阳性克隆只能酶切出约2000bp和约150bp的片段，而空载pEcgRNA可以酶切出约2000bp、1000bp和约120bp三种大小的片段。酶切正确的阳性克隆经测序验证后得到序列正确的pEcgRNA-lpp载体。

3.3、基因敲除及效果检测

pEcgRNA-lpp载体和上下游同源片段lpp-up-down一起转化含pEcas质粒的EcN感受态，进行CRISPR基因敲除，从LB+Kana+Spec平板培养基上挑取单克隆菌落进行菌落PCR，验证lpp基因的敲除情况，菌落PCR产物凝胶电泳结果如图12所示，lpp基因成功敲除的阳性克隆EcN-Δlpp能扩增出大小约600bp的片段，EcN基因组空白对照则扩增出大小约950bp的片段。

选取lpp基因成功敲除的阳性克隆进行质粒消除，pEcas和pEcgRNA-lpp两个质粒均消除的克隆只能在LB平板培养基上生长，而无法在LB+Kana、LB+Spec平板培养基上生长，质粒消除情况如图13所示(仅展示一组平板)。

对两个质粒均消除的EcN-Δlpp单克隆菌进行摇菌培养，提取其基因组，使用lpp-up-F和lpp-down-R引物对lpp基因进行扩增，扩增产物的凝胶电泳结果如图14所示，能扩增出大小约600bp的片段。扩增产物的测序结果显示EcN-Δlpp在lpp基因处缺失311bp片段，敲除胞壁脂蛋白lpp基因的EcN-Δlpp菌株构建成功。

实验三：EcN-Δlpp-INS菌株构建，诱导表达，蛋白提取

1、实验材料

1.1、实验仪器：Wix电泳仪、PCR仪、水浴锅、离心机、Azure300成像仪、摇床培养箱、恒温培养箱、英赛斯AutoPure蛋白纯化层析系统、超声仪。

1.2、实验试剂：DL2000 DNA Ladder、琼脂糖、全式金DH5α感受态、LB肉汤、盐酸大观霉素五水合物、硫酸卡那霉素、2x Taq PCR Master Mix(Blue)、氯化钙、甘油、鼠李糖一水、蔗糖、擎科菌类直扩试剂盒、阿拉伯糖、溶菌酶、乙醇、磷酸钠、氯化钠、咪唑、三氯乙酸、loading buffer。

1.3、实验材料：擎科生物质粒小提试剂盒、全式金5分钟DNA快速纯化试剂盒、无菌培养皿、GE17524801HisTrapHigh Performance 5mL层析柱、砂芯过滤装置1000mL、0.22μm滤膜有机系、0.22μm滤膜水系、0.45μm滤膜水系。

2、实验方法

2.1、EcN-Δlpp-INS菌株构建

使用氯化钙和甘油，通过化学法将EcN-Δlpp菌株制备成感受态，pEcas质粒转化EcN-Δlpp感受态，涂布于无菌LB+Kana培养基平板上，37℃恒温培养箱静置过夜培养，得到含pEcas质粒的EcN-Δlpp菌株。同样地，再通过化学法将含pEcas质粒的EcN-Δlpp菌株制备成感受态。使用含人胰岛素原表达框的质粒pEcgRNA-N20-INS转化含pEcas质粒的EcN-Δlpp感受态：取EcN-Δlpp(含pEcas质粒)感受态200μL，加入pEcgRNA-N20-INS～2μg，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入300uL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃静置30min复苏，全部涂布于LB+Kana+Spec培养基上，37℃静置过夜培养，进行CRISPR基因敲除及人胰岛素原表达框插入。

通过菌落PCR对人胰岛素原表达框插入情况进行检测，挑取LB+Kana+Spec培养基平板上的单克隆菌落进行菌落PCR，以EcN-Δlpp基因组为模板设为对照，F引物为INS表达框中的引物，R引物为插入位置下游EcN基因组上的引物，体系如下：1x Taq PCR MasterMix 6.5μL，T1-F 0.25μL，INS-EcN-down-R(GACGGTTTTCGCTGTTGACG)0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL。PCR条件：95℃，7min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，2min，35cycles；72℃，7min；10℃，∞。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：150V，15min。挑取菌落PCR验证的阳性克隆于4.3mL LB+Kana+Spec液体培养基中，37℃200rpm过夜摇菌。

按以下步骤进行质粒消除：取10μL菌液加入1.5mL的LB+kana+鼠李糖(10mM)液体培养基中，用于消除pEcgRNA-N20-INS质粒，摇床培养箱37℃200rpm培养6.5h，吸取菌液20uL，将枪头打入1.5mL单纯的LB培养液37℃摇床培养～1.5h，涂在LB+蔗糖(10g/L)的平板培养基上，用于消除pEcas质粒，37℃过夜。每块培养基挑取16-24个(2-3排)单克隆菌落，置于20uL水中，取3uL分别点在LB、LB+Kana、LB+Spec三种平板培养基上，恒温培养箱37℃过夜，通过统计三种培养基上的生长情况，判断两种质粒是否消除。

取两种质粒均消除的单克隆菌，使用擎科菌类直扩试剂盒进行菌株基因组提取和PCR扩增，步骤如下：取过夜培养菌液100μL，4000rpm离心5min，弃去上清，加入Buffer A 50μL，混匀，95℃反应15min，加入Buffer B 50μL，混匀，4000rpm离心5min，上清即为基因组。使用配套T5酶进行PCR扩增，体系如下：T5酶mix buffer 15μL，基因组上清2μL，up-F 1.2μL，down-R 1.2μL，ddH

2.2、诱导表达

取EcN-Δlpp-INS菌株于LB平板培养基上划线培养，第二天从其上挑取单克隆菌落于10mL LB液体培养基中37℃、200rpm过夜摇菌，第三天1：100接种到1000mL LB培养基中，37℃培养至OD

2.3、蛋白提取

离心下来的菌按1g菌，10mL 0.5mg/mL溶菌酶的量重悬，4℃消化1小时，10000rpm/min离心，离心上清即为周质蛋白，倒出0.22μm滤膜过滤备用。

使用英赛斯AutoPure蛋白纯化层析系统纯化浓缩带His标签的人胰岛素原蛋白(INS-Histag)，使用层析柱为GE17524801 HisTrapHigh Performance 5mL，结合缓冲液：20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4，洗脱缓冲液：20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，500mM咪唑，pH 7.4。一步洗脱法、5个柱体积进行洗脱。按以上方法层析纯化诱导菌液的上清蛋白和周质蛋白，分别得到25mL洗脱液。

25mL洗脱液中加入三氯乙酸(TCA)至终浓度10％w/v沉淀蛋白，4℃过夜，11000rpm/min离心，弃去上清，沉淀蛋白用50μL loading buffer溶解、煮沸，置于冰上冷却，用于SDS-PAGE电泳。

溶菌酶处理后的菌沉淀，吸取1μL于50μL loading buffer中，煮沸，置于冰上冷却，作为诱导菌体的蛋白用于SDS-PAGE电泳。

3、结果分析

3.1 EcN-Δlpp-INS菌株构建

pEcgRNA-N20-INS载体转化含pEcas质粒的EcN-Δlpp感受态，进行CRISPR基因敲除，从LB+Kana+Spec平板培养基上挑取单克隆菌落进行菌落PCR，验证INS表达框的插入情况，菌落PCR产物凝胶电泳结果如图15所示，INS表达框成功插入的阳性克隆EcN-Δlpp-INS能扩增出大小约1500bp的片段，EcN-Δlpp基因组空白对照则无。

选取INS表达框成功插入的阳性克隆进行质粒消除，pEcas和pEcgRNA-N20-INS两个质粒均消除的克隆只能在LB平板培养基上生长，而无法在LB+Kana、LB+Spec平板培养基上生长，质粒消除情况如图16所示(仅展示一组平板)。

对两个质粒均消除的EcN-Δlpp-INS单克隆菌进行摇菌培养，提取其基因组，使用up-F和down-R引物对人胰岛素原表达框进行扩增，扩增产物的凝胶电泳结果如图17所示，能扩增出大小约2500bp的片段,EcN-Δlpp基因组空白对照则只能扩增出大小约900bp的片段。扩增产物的测序结果显示EcN-Δlpp-INS基因组中成功插入人胰岛素原表达框。

实验四：Western-blot检测

1、实验材料

1.1、实验仪器：Wix电泳仪、ThermoScientific Mini Gel Tank小型胶电泳槽、水浴锅、离心机、Azure300成像仪、摇床。

1.2、实验试剂：ThermoScientific Novex

1.3实验材料：0.22μm PVDF膜、ThermoScientific Novex

2、实验方法

2.1、SDS-PAGE电泳

制备好的诱导上清、诱导周质、诱导菌体和非诱导上清、周质、菌体蛋白样品(溶于上样缓冲液)用于SDS-PAGE电泳，上样量20μL，电泳条件：125V，60min。

2.2、转膜

SDS-PAGE胶放入去离子水中清洗10min，转移到预冷的转膜液中静置10min，同时用预冷的转膜液浸润滤纸、海绵，裁剪出相同大小的PVDF膜，放入甲醇中静置10min，再转移到转膜液中静置10min，按黑板-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-白板的顺序放置，黑对黑、白对红放入到电泳槽中，电压100V、时间45min进行转膜。

2.3、Western Blot

转膜后PVDF膜置于TBST中清洗，转入TBST配制的5％脱脂乳粉中，室温慢摇封闭3h。更换新的5％脱脂乳粉，按1:2500比例添加一抗，4℃冰箱过夜(约16h)。

TBST洗膜：每次10mL，每次10min，清洗5次。更换新的5％脱脂乳粉，按1:7500比例添加二抗，室温慢摇2h。再经过5次TBST洗膜，时间和体积与前述相同。

洗膜后按凯基生物ECL检测试剂盒说明书进行显影，Azure300成像仪拍照。

3、结果分析

3.1 Western Blot检测

EcN-Δlpp-INS上清蛋白和周质蛋白Western Blot检测结果如图18所示，泳道1为诱导上清蛋白，泳道2为诱导周质蛋白，泳道3为诱导菌体蛋白，泳道4为非诱导上清蛋白，泳道5为非诱导周质蛋白，泳道6为非诱导菌体蛋白。非诱导的上清、周质、菌体蛋白均无条带，诱导上清蛋白在10kD-15kD区间有两条条带，预期重组人胰岛素原蛋白(带6xHis标签)为10.22kD，若加上信号肽ompF大小则为12.47kD，与该两条条带大小对应，推测有部分重组蛋白的ompF信号肽未被切割或有少部分细胞裂解。诱导周质蛋白在12.47kD处有微弱条带，诱导菌体蛋白在12.47kD处有明亮条带，说明菌体内表达大量带有ompF信号肽的重组人胰岛素原蛋白(即表达ompF-INS基因)，ompF信号肽引导蛋白至周质空间，再分泌到上清培养基中，缺失胞壁脂蛋白lpp能有效促进蛋白分泌。

实验五：质谱检测

1、实验材料

1.2、实验仪器：Wix电泳仪、水浴锅、离心机、Azure300成像仪、摇床。

1.3、实验试剂：Solarbio蛋白上样缓冲液(含DTT)、金斯瑞Tris-MES-SDS RunningBuffer、ThermoScientific Spectra Multicolor Low Range Protein Ladder 26628、Solarbio考马斯亮蓝快速染色液。

1.4、实验材料：金斯瑞SurePAGE 15％Bio-Tris MES预制胶。

2、实验方法

2.1、SDS-PAGE电泳

制备好的蛋白样品(溶于上样缓冲液)用于SDS-PAGE电泳，上样量20μL，电泳条件：90V，10min；130V，30min。

2.2、质谱检测

取出SDS-PAGE胶，按Solarbio考马斯亮蓝快速染色液说明书进行染色，染色后切取诱导上清和诱导周质蛋白泳道在5-15kD区域的蓝色条带1cm*2cm，送至百趣生物进行串联质谱分析。

3、结果分析

3.1、质谱鉴定结果分析

为进一步确定纯化后蛋白性质，5-15kD区域蛋白条带被切下进行质谱分析，质谱结果显示，诱导上清蛋白和周质蛋白中均鉴定出两条与人胰岛素氨基酸序列一致的肽段，分别为REAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQK和EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQK，鉴定肽段序列匹配部分如图19所示，肽段质谱谱图如图20所示。由此证明，EcN-Δlpp-INS菌株诱导表达、分离纯化的蛋白是重组的人胰岛素原蛋白。

预期重组人胰岛素原氨基酸序列：

MFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCNHHHHHH

四、结果与讨论

本发明旨在为I型糖尿病活菌药物开发奠定基础，构建能递送人胰岛素原至肠粘膜的益生菌，给予持续性抗原刺激，从而诱导Ⅰ型糖尿病免疫耐受，保留残留的β细胞功能，改善甚至逆转新发I型糖尿病。为此，选取了可食用的益生菌EcN作为底盘细菌，利用大肠杆菌CRISPR/Cas9双质粒系统pEcas/pEcgRNA，首先构建pEcgRNA-lpp载体，敲除了EcN的胞壁脂蛋白lpp基因，将其改造为周质蛋白向外渗漏的EcN-Δlpp菌株。随后，通过生物合成和重叠PCR扩增，得到插入片段即人胰岛素原表达框，其包含阿拉伯糖启动子、大肠杆菌外膜蛋白ompF信号肽、人胰岛素原基因；通过T4连接和同源重组构建了包含靶点N20和人胰岛素原表达框的pEcgRNA-N20-INS载体，结合pEcas质粒将人胰岛素原表达框插入至EcN-Δlpp菌株，构建了无抗性标记、能分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌——EcN-Δlpp-INS菌株。

经过Western-blot检测和质谱分析，验证了EcN-Δlpp-INS菌株诱导表达的培养基上清中含有人胰岛素原，充分说明该菌株能分泌表达人胰岛素原至胞外。同时，诱导剂L-阿拉伯糖为可食用成分，对维持血糖稳定有积极作用。该分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌EcN-Δlpp-INS菌株，为I型糖尿病活菌药物开发奠定了基础，后续研究会着眼于I型糖尿病活菌药物的进一步完善，构建分泌表达人白介素10的菌株，该细胞因子具有促进形成免疫耐受的作用，其与人胰岛素原抗原刺激协同作用，诱导免疫耐受形成。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。