L-天冬氨酸氧化酶SaAO及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-天冬氨酸氧化酶SaAO及其编码基因和应用。

背景技术

L-天冬氨酸氧化酶(L-aspartate oxidase，EC1.4.3.16)属于L-氨基酸氧化酶的一种，是以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子的黄素氧化酶，从序列同源性上归属于琥珀酸脱氢酶/延胡索酸还原酶家族。L-天冬氨酸氧化酶能够以L-天冬氨酸为底物，生成草酰乙酸、氨气以及过氧化氢。许多L-氨基酸氧化酶底物谱较宽，能识别并催化多种氨基酸，但是L-氨基酸氧化酶却具备严格的立体选择性和底物特异性，催化底物仅限于L-天冬氨酸或者L-天冬酰胺，对结构类似的氨基酸如谷氨酸基本无活性，表现出极佳的专一性，具备良好的工业应用价值。

D-天冬氨酸作为一种手性药物合成的前体和中间体，可用于合成阿普西林、β-内酰胺抗生素、各种酶抑制剂，还被用来合成D-天冬氨酸-β-羟胺、抗肉毒杆菌毒素等抗病毒药物的前体，用于治疗病毒感染、AIDS、肿瘤等疑难病症，还可抑制精氨酸基琥珀酸合成酶的活性，用于预防或治疗脓毒症或细胞因子诱导的系统性低血压。在食品方面，D-天冬氨酸可以改善食物中蛋白质的质地、提高人们的味觉。化学不对称合成或是化学拆分法都存在收率低、光学纯度不高、生产成本高、环境污染大等缺点。L-天冬氨酸氧化酶由于其高效催化效率和选择性，可用于D,L-天冬氨酸外消旋混合物的手性拆分，生产D-天冬氨酸，具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等特点

L-天冬氨酸氧化酶还可用于喹啉酸的生物制造。L-天冬氨酸酶是原核生物中喹啉酸和烟酸从头合成第一步的关键酶。喹啉酸经过一系列生物酶的作用，可进一步合成烟酸。烟酸是人和动物体必需的营养素，是饲料、食品工业的常用添加剂，是重要的医药原料和化工中间体。烟酸在动物体内的主要存在形式为NAD

除此之外，L-天冬氨酸氧化酶还可用于发酵工业、医疗检测、生物样品、食品工业中L-天冬氨酸含量的检测和生物传感器的应用。

具备严格底物选择性的L-天冬氨酸氧化酶多是微生物源的，迄今为止，已报道的产L-天冬氨酸氧化酶的微生物有大肠杆菌Escherichia coli，Pseudomonas putida，Bacillus subtilis，Sulfolobus tokodaii，Pyrococcus horikoshii，Thermococcuskodakarensis，Thermococcus litoralis。但是，嗜盐嗜碱菌株中尚未有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供L-天冬氨酸氧化酶SaAO及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来源于盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)，是一种L-天冬氨酸氧化酶，命名为SaAO蛋白，氨基酸序列由序列表中序列1所示。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有序列表中序列1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其突变体，只要其与前述氨基酸序列具有99％以上同源性，且具有L-天冬氨酸氧化酶功能，均属于本发明保护范围。具体的，所述改变包括氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加和/或替换。

SaAO蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

优选的，所述基因的碱基序列如序列表中序列2所示，该基因序列来源于盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)，由1604个碱基组成。由于核苷酸序列的特殊性，任何序列表中序列2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本发明的保护范围。

本发明还保护SaAO蛋白作为L-天冬氨酸氧化酶的应用。应用SaAO蛋白作为L-天冬氨酸氧化酶时，采用的温度为25-70℃，采用的pH为3-11。应用SaAO蛋白作为L-天冬氨酸氧化酶时，采用的温度为45℃，采用的pH为8。

本发明还保护L-天冬氨酸氧化酶SaAO蛋白在外消旋天冬氨酸手性拆分制备D-天冬氨酸方面的应用。

本发明提供的L-天冬氨酸氧化酶SaAO具有较高的酶活力，并且反应温度宽泛，反应pH宽泛。

盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)已于2020年7月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020375。

附图说明

图1为菌株JH的照片。

图2为菌株JH的系统发生树。

图3为SaAO蛋白溶液的电泳图。

图4为检测最适pH时的相对酶活结果。

图5为检测最适反应温度时的相对酶活结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、盐螺旋菌JH的分离、鉴定和保藏

一、分离

取碱湖样品50μL，加入碱湖滤液450μL，吹打混匀得到10

二、鉴定

将纯化后的菌株于LBH固体培养基中进行三区划线，35℃培养2d，使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小、有无鞭毛等特征(见图1)。挑取LBH固体平板上的单菌落按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。采用穿刺法将菌株置入半固体培养基中进行接种，然后放入37℃的培养箱中培养2d，观察菌株的运动性和好氧情况。

配制不同浓度NaCl(0％、1.0％、3.0％、5.0％和10.0％(w/v))的LBH液体培养基，接种后置于35℃的摇床中振荡培养7d，每隔24h取一次样，使用UV-2450分光光度计在OD600处检测细菌的其生长情况，以确定菌株的最适盐度以及盐度生长范围；对于菌株pH值的测定，需配制不同pH值(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、11.5、12.0)的液体LBH培养基。接种后，置于37℃摇床中培振荡培养7d，每隔24h取一次样，以培养条件相同的不接菌培养基作为空白对照，以确定最佳生长pH范围；分别设置温度梯度为4℃、10℃、25℃、28℃、30℃、37℃、40℃、45℃和50℃，以确定菌株的最佳生长温度范围。

利用Biolog GEN III鉴定板检测菌株对不同碳源的利用情况。

使用API 20NE和API 32GN试剂盒对菌株进行鉴定，如硝酸盐还原试验、亚硝酸盐还原试验、酶活特性及碳源利用试验等。菌株Salinispirillum sp.JH和参考菌株Salinispirillum marinum GCWy1

表1

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利用基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，并利用PCR技术扩增菌株的16SrDNA序列。本实验采用的PCR体系为：4μL模板DNA、1μL引物27F、1μL引物1492R、5μL 10×TaqBuffer、4μL dNTP、0.8μL Taq DNA聚合酶、34.2μL灭菌超纯水。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行验证，若条带大小符合预期实验结果，则将PCR扩增产物送至青岛擎科生物有限公司进行测序。如果测序结果正确，则对PCR扩增产物进行切胶回收，并利用pClone007Simple Vector Kit克隆试剂盒克隆目的条带，再将克隆后的目的基因与质粒pMD18-T连接，最后将重组质粒转入大肠杆菌E.coli DH5α中，转化过程严格按照感受态细胞E.coli DH5α的使用操作说明进行。将测得的16S rDNA序列结果上传至https://www.ezbiocloud.net/网站进行序列对比分析，确定分离细菌的种属，并下载与菌株亲缘性较高的细菌的16S rDNA序列。通过选择合适的外群，并基于分离菌株及其相关菌株的16SrDNA基因序列，使用MEGA 7.0软件构建菌株的系统发育树。使用近邻连接法(NJ)进行细菌的系统发育分析。基于1000次重复，使用Bootstrap分析确定系统发生树的拓扑结构，见图2。

以上鉴定结果表明，菌株JH属于糖螺旋菌科(Saccharospirillaceae)，盐螺旋菌属(Salinispirillum)。

三、保藏

盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)已于2020年7月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020375。

实施例2、L-天冬氨酸氧化酶(SaAO蛋白)的制备

经过大量序列分析、比对和功能验证，从盐螺旋菌JH中发现一个新蛋白，将其命名为SaAO蛋白，如序列表的序列1所示。将盐螺旋菌JH中编码SaAO蛋白的基因命名为SaAO基因，其编码框如序列表的序列2所示。

一、构建重组质粒

1、以盐螺旋菌JH的基因组DNA为模板，采用AO-F和AO-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

AO-F：5’-CGCGGATCCATGGCAGCT-3’；

AO-R：5’-GCCAAGCTTTTACTGGTGCA-3’。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，与pET-28a载体连接，得到重组质粒pET-28a-SaAO。

pET-28a载体(pET-28a Vector)：Novagen，产品目录号69864-3。

经测序，重组质粒pET-28a-SaAO中具有序列表的序列2所示的DNA分子。

二、制备重组菌

将重组质粒pET-28a-SaAO导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌甲。

将pET-28a载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙。

三、表达蛋白

1、将重组菌接种至含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、150rpm振荡培养12h，得到种子液。

2、将1体积份种子液接种至99体积份含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD

3、取步骤2得到的沉淀，用Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 7.5)洗涤，然后悬浮于Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 7.5)并进行超声破碎(超声破碎参数：功率200W，每超声3s停3s，总时间为30min)，然后4℃、10000×g离心20min，收集上清液。

重组菌甲进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液甲。

重组菌乙进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液乙。

四、纯化蛋白

取步骤三得到的粗酶液甲，用孔径为0.22μm的微滤滤膜过滤，收集滤液。取滤液，采用连接有HisTrap

实施例3、L-天冬氨酸氧化酶(SaAO蛋白)的酶学性质

PBS缓冲液(20mM，pH 8.0)：配制方法见表3。

底物溶液(10mM L-天冬氨酸)：称取1.331g L-天冬氨酸，采用Tris-HCl缓冲液溶解，并定容至1L。

一、pH对L-天冬氨酸氧化酶活性的影响

1、最适pH

取实施例2制备的SaAO蛋白溶液，PBS缓冲液(20mM，pH 8.0)稀释至两倍体积，将稀释液作为供试液。

检测方法：1mL 50mM PBS缓冲液(pH 8.0)的反应体系中包括10mM L-天冬氨酸，1.5mM 4-氨基安替比林，10mM苯酚，20uM FAD(黄素腺嘌呤二核甘酸)，2.5U辣根过氧化物酶，加入SaAO酶后，在37℃反应5min后，在505nm处测定吸光值。

分别采用如下缓冲液：pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 4.0的柠檬酸盐缓冲液、pH5.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 6.0的磷酸盐缓冲液、pH 7.0的磷酸盐缓冲液、pH 8.0的磷酸盐缓冲液、pH 8.0的碳酸盐缓冲液、pH 9.0的碳酸盐缓冲液、pH10.0的碳酸盐缓冲液、pH 11.0的碳酸盐缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的配方见表2。磷酸盐缓冲液的配方见表3。碳酸盐缓冲液的配方见表4。

表2柠檬酸缓冲液的配制方法

表3磷酸盐缓冲液的配制方法

表4碳酸盐缓冲液的配制方法

SaAO蛋白的最适pH为8。将采用最适pH对应的缓冲液时的OD

二、温度对L-天冬氨酸氧化酶活性的影响

1、最适反应温度

取实施例2制备的SaAO蛋白溶液，用PBS缓冲液(20mM，pH 8.0)稀释至两倍体积，将稀释液作为供试液。

检测方法：1mL 50mM PBS缓冲液(pH 8.0)的反应体系中包括10mM L-天冬氨酸，1.5mM 4-氨基安替比林，10mM苯酚，20uM FAD(黄素腺嘌呤二核甘酸)，2.5U辣根过氧化物酶，加入SaAO酶后，在37℃反应5min后，在505nm处测定吸光值。

最适反应温度为45℃。将采用最适反应温度时的OD

三、L-天冬氨酸氧化酶的底物特异性

取实施例2制备的SaAO蛋白溶液，用PBS缓冲液(20mM，pH 8.0)稀释至2倍体积，然后作为供试液。

检测方法：1mL 50mM PBS缓冲液(pH 8.0)的反应体系中包括10mM各种待测L-氨基酸和D-天冬氨酸，1.5mM 4-氨基安替比林，10mM苯酚，20uM FAD(黄素腺嘌呤二核甘酸)，2.5U辣根过氧化物酶，加入SaAO酶后，在37℃反应5min后，在505nm处测定吸光值。OD

以L-天冬氨酸作为底物时相应的OD

表5 L-天冬氨酸氧化酶在不同底物下的酶活

五、酶活力的测定

酶活(1U)定义为：每分钟催化1μmol L-天冬氨酸所消耗的酶量。

检测方法：1mL 50mM PBS缓冲液(pH 8.0)的反应体系中包括10mM L-天冬氨酸，1.5mM 4-氨基安替比林，10mM苯酚，20uM FAD(黄素腺嘌呤二核甘酸)，2.5U辣根过氧化物酶，加入SaAO酶后，在37℃反应5min后，在505nm处测定吸光值。

采用实施例2制备的粗酶液甲作为供试液，酶活为0.7U/mL。

采用实施例2制备的粗酶液乙作为供试液，酶活为0U/mL。

采用实施例2制备的SaAO蛋白溶液作为供试液，检测单位体积供试液的酶活。检测实施例2制备的SaAO蛋白溶液中的蛋白浓度。将单位体积供试液的酶活除以单位体积供试液的蛋白含量，得到蛋白比活力，数值为0.8U/mg。

实施例4、L-天冬氨酸氧化酶SaAO蛋白用于制备D-天冬氨酸。

1、实验过程

(1)取实施例2制备的SaAO蛋白溶液，用PBS缓冲液(20mM，pH 8.0)稀释至两倍体积，将稀释液作为供试液。

(2)实验使用配备聚醚砜材质、截留分子量5kDa的膜反应器(内容积25mL)进行，反应器通过恒温槽保持在37℃。将上述SaAO液1.5mL、5μL的过氧化氢酶溶液(20mg/mL)和5mL水混合，泵入反应器。配制30mL浓度为50mM的外消旋D,L-天冬氨酸溶液，调整pH为8，作为底物溶液。泵入口和反应器出口浸在底物溶液中，使用2.0mL/min的流速将底物溶液泵入微滤膜反应器中，底物溶液可循环使用。

(3)从反应液中取50μL样品，用OPA-NAC(邻苯二甲醛/N-乙酰基-L-半胱氨酸)进行衍生化，通过配备有Phenomenex Luna C18(2)手性柱的高效液相色谱(HPLC)进行产物检测。洗脱液使用含有10％甲醇的50mM醋酸缓冲液(pH 5.2)，流速0.8mL/min，340nm波长处检测。

2、L-天冬氨酸氧化酶(SaAO蛋白)用于D-天冬氨酸制备

反应结束后，经分析得知，L-天冬氨酸转化为D-天冬氨酸的转化率为99.4％，这说明该酶在D-天冬氨酸的制备方面具有较大的应用潜力。

序列表

<110> 中国石油大学（华东）

<120> L-天冬氨酸氧化酶SaAO及其编码基因和应用

<130> 20210329

<140> GNCYX123456

<141> 2022-05-27

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 534

<212> PRT

<213> 盐螺旋菌(Salinispirillum sp. )

<400> 1

Met Ala Ala Pro Leu Asp Phe Asp Val Leu Ile Ile Gly Thr Gly Ala

1 5 1015

Ala Gly Leu Thr Leu Ala Leu Ser Leu Pro Glu His Leu Lys Ile Gly

202530

Leu Val Ser Lys Gly Glu Leu Gly Gly Gly Ser Thr Ala Trp Ala Gln

354045

Gly Gly Val Ala Ala Val Leu Glu Thr Gly Asp Ser Ile Glu Glu His

505560

Ile Gln Asp Thr Glu Val Ala Gly Ala Gly Leu Cys Asp Ala Glu Ala

65707580

Val Arg Phe Thr Val Glu His Ser Ala Glu Ala Ile Arg Trp Leu Val

859095

Asp Met Gly Val Pro Phe Thr Pro Asp Ala Ala Thr Glu Leu Gly Leu

100 105 110

His Leu Thr Lys Glu Gly Gly His Ser Arg Arg Arg Ile Val His Ala

115 120 125

Ala Asp Ala Thr Gly Tyr Ala Ile Thr Ala Thr Leu Thr Glu Gln Ile

130 135 140

Ala Asn Ala Lys Asn Val Val Phe Leu Pro Gln His Thr Ala Val Asp

145 150 155 160

Leu Ile Thr Thr Glu Lys Leu Gly Leu Ser Gly Pro Asn Arg Cys Val

165 170 175

Gly Ala Tyr Leu Tyr Ser Gln Leu Glu Asp Cys Val Ile Thr Cys Arg

180 185 190

Val Gly His Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Lys Ala Tyr Leu

195 200 205

Tyr Thr Ser Asn Pro Asp Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ile Ala Met Ala

210 215 220

Trp Arg Ala Gly Cys Arg Leu Ala Asn Met Glu Phe Asn Gln Phe His

225 230 235 240

Pro Thr Cys Leu Tyr His Pro His Ala Lys Ser Phe Leu Leu Ser Glu

245 250 255

Ala Ile Arg Gly Glu Gly Gly Arg Leu Leu Leu Pro Asp Gly Gln Arg

260 265 270

Phe Met His Arg Phe Asp Glu Arg Leu Glu Leu Ala Pro Arg Asp Ile

275 280 285

Val Ala Arg Ala Ile Asp His Glu Met Lys Arg Leu Gly Ala Asp Ser

290 295 300

Leu Phe Leu Asp Ile Ser His Gln Ser Ala Glu Phe Ile Ala Glu His

305 310 315 320

Phe Pro Thr Ile Gln Arg Arg Cys Leu Glu Tyr Gly Ile Asp Ile Thr

325 330 335

Arg Glu Pro Ile Pro Val Val Pro Ala Ala His Tyr Thr Cys Gly Gly

340 345 350

Ile Lys Thr Asp Leu His Gly Gln Thr Asp Leu Pro Gly Leu Phe Ala

355 360 365

Ile Gly Glu Cys Ala His Thr Gly Leu His Gly Ala Asn Arg Leu Ala

370 375 380

Ser Asn Ser Leu Leu Glu Cys Leu Val Phe Gly Arg Ala Ala Ala Gln

385 390 395 400

Cys Ile Ala Ala Leu Pro Thr Gln Pro Leu Pro Gln Glu Ile Pro Pro

405 410 415

Trp Asp Glu Ser Arg Val Thr Asp Ser Asp Glu Asp Val Val Ile Ala

420 425 430

His Asn Trp Asp Glu Leu Arg Arg Phe Met Trp Asp Tyr Val Gly Ile

435 440 445

Val Arg Thr Ser Lys Arg Leu Leu Arg Ala Arg His Arg Val Gln Leu

450 455 460

Leu Lys Asp Glu Ile His Glu Phe Tyr Ser Asn Tyr Arg Ile Ser Asn

465 470 475 480

Asp Leu Leu Glu Leu Arg Asn Leu Val Ala Ile Ala Glu Ala Ile Ile

485 490 495

Glu Ser Ala Ile Arg Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu His Tyr Thr Leu

500 505 510

Asp Tyr Pro Glu Ala Asp Gly Lys Ala Gln Asp Thr Val Leu Glu Pro

515 520 525

Met Asp Gln Leu His Gln

530

<210> 2

<211> 1605

<212> DNA

<213> 盐螺旋菌(Salinispirillum sp. )

<400> 2

atggcagctc ctttagattt tgatgtactg atcatcggca ccggtgcggc cggcctgacg 60

ctggcgctga gcctgcctga acacctgaaa attggcttgg tcagcaaagg tgaactcggc 120

gggggcagta cggcgtgggc gcaaggcggc gtggctgcgg ttctggaaac gggcgattca 180

atagaagagc acatccaaga tacagaggtt gccggtgctg gattatgcga cgcggaagcc 240

gtgcgcttta ccgttgaaca cagtgccgag gccattcgct ggctggtcga catgggggtg 300

ccatttactc cggatgccgc caccgagcta ggtctgcatc tgaccaaaga aggcggacac 360

agccgccgac gaattgtgca tgccgccgac gcgaccggtt atgccattac cgccacactg 420

acggagcaaa ttgccaacgc caagaacgtg gtctttttgc cacagcatac cgccgttgac 480

ttgatcacca cggagaaact agggttgtct gggcctaacc gttgtgttgg cgcttatttg 540

tacagccagc ttgaagactg tgtcattacc tgtcgcgtcg gacacaccgc gctggcaacg 600

ggcggcgcca gcaaagccta tttgtatacc agcaaccccg acggctctac cggtgacggc 660

attgccatgg catggcgtgc cggttgccgc cttgccaaca tggagttcaa ccaatttcat 720

ccgacttgcc tttatcaccc gcacgccaag tccttcttgc tgtcagaagc cattcgcggc 780

gagggcgggc ggctattgct gcccgacggg caacgcttta tgcatcgctt tgatgagcgc 840

ctagaactgg ctccccgcga tatcgtagcg cgtgccatag accatgaaat gaagcgccta 900

ggggccgaca gtctattctt agacatcagc caccagagcg ccgagttcat agccgagcac 960

tttccaacga tacagcgccg ctgcttggaa tacggcatcg acattacccg cgaacctatc 1020

ccggtggttc ccgccgcaca ctacacctgc ggtggcatca agaccgacct gcacggtcag 1080

actgacctac ccggcttgtt tgccattggc gaatgcgctc atacgggact gcacggcgcc 1140

aatcgcctag ccagcaactc attgctggag tgtttggtct tcgggcgcgc cgcggcgcaa 1200

tgcattgctg cattgccgac acaaccccta ccgcaggaga tcccaccttg ggatgaaagt 1260

cgagtcacgg actctgacga agacgttgtg attgcacaca actgggacga gttgcgacgt 1320

tttatgtggg actatgtggg catcgtacgc accagcaagc gcttgttgcg cgcgcggcac 1380

cgagtccaat tgctaaaaga cgagattcac gaattttaca gcaactaccg catcagcaat 1440

gatttactgg agctgcgtaa tctggtggcg atcgccgaag ccatcattga aagtgccatt 1500

cgccgcaaag aaagccgtgg gttgcactac acgctggact acccggaagc agatggcaaa 1560

gcacaggata ccgtactaga acctatggat cagctgcacc agtaa 1605

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 盐螺旋菌(Salinispirillum sp. )

<400> 3

cgcggatcca tggcagct 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 盐螺旋菌(Salinispirillum sp. )

<400> 4

gccaagcttt tactggtgca 20