一种基于白蛋白的光热转换纳米材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及药物递送系统技术领域，具体涉及一种基于白蛋白的光热转换纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术

基于白蛋白的药物递送材料具有理想的生物相容性和药物代谢动力学特点，因此被广泛应用于肿瘤治疗中。例如，在2005年被美国批准使用的Abraxane，是一种人血清白蛋白结合型紫杉醇制剂，具有改善胰腺癌患者的治疗效果。同时，将白蛋白药物递送材料设计成具有纳米尺度的结构后，材料的纳米剂型可以通过肿瘤的高渗透高滞留效应提高药物在肿瘤组织内的蓄积水平。此外，基于白蛋白的药物递送材料还可以通过肿瘤细胞表面过表达的SPARC蛋白受体促进负载的药物通过主动转运方式进入肿瘤细胞。

目前，白蛋白载药的方式主要有两种，一种是白蛋白分子可以通过非共价连接的方式负载疏水药物分子，因为其内部含有疏水域因而对疏水药物有较高的结合能力；另一种是白蛋白分子表面具有多种官能团(例如氨基、巯基等)，也可以通过共价连接的方式连接药物。尽管白蛋白对药物负载的方式丰富多样，但将其向临床转化并实现实际应用仍存在以下两点问题：(1)基于白蛋白的纳米药物其药物负载效率低，例如有研究报道的基于白蛋白的奥沙利铂纳米药物，奥沙利铂的负载含量仅为1.82％；(2)目前多数基于白蛋白的纳米药物的制备步骤较为繁琐，工艺流程涉及多个环节，仅能满足实验室小规模制备的需要，难以实现大规模量化生产。

近年来，肿瘤光热治疗被认为是一种新兴的、具有高度远程可控性和时空可控性的先进肿瘤治疗方法，其原理为通过光热转换材料，将外部入射光源转换为热能，从而消融肿瘤。目前，小分子染料类光热转换试剂(如花菁类、卟啉类及氮杂氟硼烷类小分子光热试剂)因为结构高度可调控而被广泛用于制备具有不同性能特点的光热肿瘤治疗试剂。然而，此类光热试剂往往水溶性较差，而考虑到实际给药过程的需要，通常需要先将此类小分子染料类光热试剂制备成纳米药物材料分散液，这样一来其水溶性差的问题必然会影响到其实际的应用效果。

综上所述，在肿瘤治疗的药物递送系统领域开发一种制备方法简便、药物负载量高、水溶性好，且基于白蛋白的光热转换纳米材料具有重要的应用前景。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于白蛋白的光热转换纳米材料，该纳米材料同时具有光热转换性能和光声成像作用，有望在肿瘤治疗过程中实现诊疗一体化效果。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明第一方面提供了一种基于白蛋白的光热转换纳米材料，所述光热转换纳米材料包括白蛋白和光热试剂分子，所述白蛋白与光热试剂分子之间通过交联相结合，所述光热试剂分子具有式(I)所示的结构：

式(I)中，n为2到10的整数。

优选地，所述光热试剂分子具有如下所示的结构：

优选地，所述白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白及小鼠血清白蛋白中的任意一种或多种。

本发明第二方面提供了第一方面所述的基于白蛋白的光热转换纳米材料的制备方法，具体为：将白蛋白分子内的二硫键还原为巯基后，与光热试剂分子在反应溶剂介质中经交联反应后制得。

优选地，所述光热试剂分子的制备包括以下步骤：

S1、根据下列反应式，将9-醛基久洛尼定与式(II)所示化合物在碱催化剂及有机溶剂存在下通过羟醛缩合反应得到式(III)所示化合物；

S2、根据下列反应式，将式(III)所示化合物与硝基甲烷在碱催化剂和有机溶剂存在下经加热回流反应后得到式(IV)所示化合物；

S3、根据下列反应式，将式(IV)所示化合物与醋酸铵在有机溶剂存在下经加热回流反应后得到式(V)所示化合物；

S4、根据下列反应式，将式(V)所示化合物与三氟化硼乙醚在碱催化剂和有机溶剂存在下于惰性气体范围中经搅拌反应后得到式(VI)所示化合物；

S5、根据下列反应式，将式(VI)所示化合物与DBCO-马来酰亚胺在有机溶剂存在下通过点击化学反应后得到式(I)所示化合物；

式(I)、(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)所示化合物中，n为2到10的整数。

本发明以白蛋白分子作为主要的构建原料之一，具有生物安全性好，符合药物递送材料必须安全的先决性要求。本发明以具有双马来酰亚胺官能团结构的小分子光热试剂作为另外一个主要的构建原料，其具有优异的光热转换性能，一方面可以提供光热治疗效果，另一方面双马来酰亚胺官能团结构可以交联白蛋白分子中的巯基单元，使材料具备纳米尺度的结构，有利于药物递送。使得药物负载和材料交联可以在同一步骤中实现，简化了制备流程。本发明通过将白蛋白分子与还原剂反应，将内部无法参与药物偶联的二硫键单元转换为巯基，增加了白蛋白材料中的巯基含量，因此增加了药物共价连接的反应位点，有利于增加药物的负载量并提高白蛋白载药体系对药物的负载效率。通过外部近红外光照射，本发明设计的基于白蛋白的光热转换纳米材料可迅速将光能转换为热能，同时提供光声成像效果，有望在肿瘤治疗过程中实现诊疗一体化效果。

更优选地，步骤S1中，所述碱催化剂为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中的一种或多种；所述有机溶剂包括但不限于乙醇；所述9-醛基久洛尼定与式(II)所示化合物的摩尔比为1:0.8～1:2；羟醛缩合反应的时长为12～48小时。

更优选地，步骤S2中，所述碱催化剂为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中的一种或多种；所述有机溶剂包括但不限于乙醇；式(III)所示化合物与硝基甲烷的摩尔比为1:15～1:40；加热回流反应的时长为12～24小时。

更优选地，步骤S3中，式(IV)所示化合物与醋酸铵的摩尔比为1:30～1:60；所述有机溶剂包括但不限于正丁醇；加热回流反应的时长为12～48小时。

更优选地，步骤S4中，所述碱催化剂为三乙胺、甲醇钠、吡啶、二异丙基乙胺中的一种或多种；所述有机溶剂包括但不限于二氯甲烷；式(V)所示化合物与三氟化硼乙醚的摩尔比为1:50～1:100；搅拌反应的时长为12～48小时，温度为室温。

更优选地，步骤S5中，式(VI)所示化合物与DBCO-马来酰亚胺的摩尔比为1:2～1:10；所述有机溶剂包括但不限于二氯甲烷；反应的时间为6～15小时，温度为室温。

优选地，将白蛋白分子内的二硫键还原为巯基所选用的还原剂为还原性谷胱甘肽、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐中的至少一种。

更优选地，所述白蛋白与还原剂的摩尔比为1:50～1:100，还原反应的时长为0.5～6小时。

优选地，所述白蛋白与光热试剂分子的摩尔比为25:1～50:1，交联反应的时长为0.5～6小时。

优选地，交联反应所采用的反应溶剂介质为磷酸缓冲溶液、Tris缓冲溶液、MOPS缓冲溶液、HEPES缓冲溶液中的任意一种或多种。

本发明第三方面提供了第一方面所述的基于白蛋白的光热转换纳米材料在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明第四方面提供了第一方面所述的基于白蛋白的光热转换纳米材料在制备光声成像造影剂中的应用。

本发明提供的基于白蛋白的光热转换纳米材料同时具有光热转换性能和光声成像作用，在肿瘤治疗过程中可以实现诊疗一体化效果。

优选地，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、黑色素瘤。

优选地，所述抗肿瘤包括抑制4T1、MCF-7、B16等肿瘤细胞的增值。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种基于白蛋白的光热转换纳米材料，该纳米材料是以生物相容性良好的白蛋白作为材料骨架，同时设计合成具有双马来酰亚胺官能团的氮杂氟硼烷类小分子染料(即光热试剂分子)，并以合成的光热试剂分子作为交联剂将还原处理后的白蛋白材料交联起来后制备得到。该纳米材料能在近红外光外部刺激的条件下实现光热转换效果，进而杀灭肿瘤细胞，同时具备光声成像功能，也可作为造影剂使用。此外，该白蛋白光热纳米材料的制备步骤简便，对光热试剂的负载率高，兼具诊疗一体化功能，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为光热试剂分子的核磁共振氢谱测试结果；

图2为基于白蛋白的光热转换纳米材料的透射电子显微镜测试图；

图3为基于白蛋白的光热转换纳米材料在808nm近红外光照射后的光热升温曲线图；

图4为基于白蛋白的光热转换纳米材料在808nm近红外光照射后的光声信号测试结果图；

图5为基于白蛋白的光热转换纳米材料在黑暗条件下对4T1、MCF-7及B16细胞的细胞毒性实验结果图(并列三个柱子从左到右分别为MCF-7、4T1、B16)；

图6为基于白蛋白的光热转换纳米材料在808nm近红外光照射下对4T1、MCF-7及B16细胞的细胞毒性实验结果图(并列三个柱子从左到右分别为MCF-7、4T1、B16)；

图7为不同治疗组的荷瘤小鼠肿瘤体积随治疗时间的变化曲线。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1基于白蛋白的光热转换纳米材料的制备

1、光热试剂分子的制备：

(1)如下列的反应式所示，将9-醛基久洛尼定(1.3g；CAS号为33985-71-6)与化合物1(1.42g)及氢氧化钠(0.76g)溶解在10mL无水乙醇中，室温搅拌反应24小时，反应结束时产物以沉淀形式析出，将反应混合物倒入10mL盐酸溶液(浓度为1mol/L)中搅拌，随后过滤得到固体沉淀，最后经水洗、干燥得到白色固体产物，即化合物2。

9-醛基久洛尼定、化合物1、化合物2的结构式分别如下所示(从左到右)：

(2)将化合物2(2.2g)与硝基甲烷(5.87mL)、氢氧化钾(0.37g)溶解在10mL无水乙醇中，并加热至80℃回流反应12小时，冷至室温后，减压旋蒸除去溶剂，并用200mL盐酸溶液(浓度为4mol/L)和200mL乙酸乙酯萃取，分液得到乙酸乙酯有机相后再用200mL去离子水洗涤，将有机相用无水硫酸钠干燥除水后，减压旋蒸除去溶剂，并以乙酸乙酯/正己烷(v:v＝1:1)为流动相进行柱层析纯化处理，得到产物化合物3，化合物3的结构如下所示：

(3)将化合物3(2.4g)与醋酸铵(13.97g)溶于50mL正丁醇中，并加热至120℃，搅拌反应24小时后，冷至室温，产物以沉淀形式析出，加入乙酸乙酯稀释至反应体系体积增加两倍后进行过滤，所得固体依次经乙酸乙酯、去离子水、无水乙醇洗涤后，经干燥得到产物化合物4，化合物4的结构如下所示：

(4)将化合物4(0.32g)与三乙胺(4mL)、三氟化硼乙醚(4mL；CAS号为109-63-7)共同溶解于50mL二氯甲烷中，在氮气保护下，室温搅拌反应48小时，随后用去离子水洗涤有机相，有机相经无水硫酸钠干燥除水后，减压旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷/正己烷(v:v＝1:1)为流动相进行柱层析处理提纯，得到产物化合物5，化合物5的结构如下所示：

(5)将化合物5(0.1g)与DBCO-马来酰亚胺(0.115g；CAS号为1395786-30-7)溶于30mL二氯甲烷中，室温搅拌反应12小时，反应结束后，减压旋蒸除去溶剂，以甲醇：丙酮：二氯甲烷(v:v:v＝1:6.5:50)为流动相进行柱层析法提纯，得到最终产物，即光热试剂分子。产物的核磁共振氢谱如图1所示，核磁氢谱数据如下：

1

结构式为：

2、还原剂处理白蛋白分子，增加分子内巯基数量

将人血清白蛋白(10mg)与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(3.75mg)共同溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲盐溶液中，磷酸盐缓冲溶液体积为20mL，室温搅拌反应30分钟。

3、将光热试剂分子与还原剂处理后的白蛋白反应，得到最终的基于白蛋白的光热转换纳米材料：

将光热试剂分子(5.1mg)溶于2mL二甲基亚砜中，随后将此溶液(体积为2mL)全部滴入经还原剂处理后的白蛋白缓冲溶液中，室温搅拌反应0.5小时后，采用分子截留量为10000Da的超滤离心管通过3000rpm的转速超滤纯化得到最终的材料，即基于白蛋白的光热转换纳米材料。其透射电子显微镜测试结果如图2所示，由图2可见所制备的材料粒径均一，平均直径为20nm，说明所制得的材料为纳米颗粒。

经测定，该基于白蛋白的光热转换纳米材料中光热试剂分子的负载量为26.1％。

实验例1基于白蛋白的光热转换纳米材料的光热转换性能测试

对实施例1制备得到的基于白蛋白的光热转换纳米材料进行光热转换性能测试，具体如下：

将基于白蛋白的光热转换纳米材料分别配成浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的水溶液，并通过波长为808nm的近红外光(光照功率为1W/cm

实验例2基于白蛋白的光热转换纳米材料的光声成像性能测试

对实施例1制备得到的基于白蛋白的光热转换纳米材料进行光声成像性能测试，具体如下：

将基于白蛋白的光热转换纳米材料分别配成浓度为31.2μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的水溶液，并通过波长为808nm的近红外光(光照功率为1W/cm

实验例3基于白蛋白的光热转换纳米材料的细胞毒性实验

(1)测试实施例1制备得到的基于白蛋白的光热转换纳米材料在黑暗条件下对4T1、MCF-7乳腺癌细胞及B16黑色素瘤细胞的细胞毒性，具体如下：

将4T1细胞以5×10

同时，采用类似的方法测试MCF-7及B16细胞的细胞毒性。

测试结果如图5所示，基于白蛋白的光热转换纳米材料在黑暗条件下对细胞活性影响极小，表现出安全的暗毒性效果。

(2)测试实施例1制备得到的基于白蛋白的光热转换纳米材料在光照条件下对4T1、MCF-7乳腺癌细胞及B16黑色素瘤细胞的细胞毒性，具体如下：

将4T1细胞以5×10

同时，采用类似的方法测试MCF-7及B16细胞的细胞毒性。

测试结果如图6所示，与上述的细胞暗毒性效果不同，基于白蛋白的光热转换纳米材料在近红外光照的条件下表现出与浓度显著相关的细胞增殖抑制效果，该现象说明，只有在特定的近红外光辐照的情况下，本发明的基于白蛋白的光热转换纳米材料才能发挥毒性作用。

实验例4基于白蛋白的光热转换纳米材料的肿瘤生长抑制效果实验

测试实施例1制备得到的基于白蛋白的光热转换纳米材料对4T1荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制效果，具体如下：

取对数生长期4T1肿瘤细胞消化，离心弃去原有培养基，PBS洗2-3次除去残留血清，细胞计数后加入PBS重悬，得到浓度为1×10

各组小鼠的肿瘤体积变化如图7所示，其中只有基于白蛋白的光热转换纳米材料注射加光照组表现出了明显的肿瘤抑制效果。

综上可见，本发明提供的基于白蛋白的光热转换纳米材料同时具有光热转换性能和光声成像作用，在肿瘤治疗过程中可以实现诊疗一体化效果。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。