COL4A1和NOTCH2基因甲基化在检测乳腺癌中的应用和引物探针组合物及试剂盒

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，具体涉及COL4A1和NOTCH2基因甲基化在检测乳腺癌中的应用和引物探针组合物及试剂盒。

背景技术

乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下，发生增殖失控的现象。疾病早期常表现为乳房肿块、乳头溢液、腋窝淋巴结肿大等症状，晚期可因癌细胞发生远处转移，出现多器官病变，直接威胁患者的生命。随着医疗水平的提高，乳腺癌具有较高的疗效，且越早发现早治疗，其治愈率越高。但是早期乳腺癌的症状多不明显，常以乳房肿块、乳房皮肤异常、乳头溢液、乳头或乳晕异常等局部症状为主，由于表现不明显，非常容易被忽视。

近年来，随着分子生物学的飞速发展及高通量测序技术的出现，对于表观遗传学的认知和研究也越来越多。研究结果表明，DNA甲基化与癌症的发生有着密切的关系，在许多癌症中都发现存在DNA甲基化异常的现象。DNA甲基化是一种常见的表观遗传(epigenetic)修饰，在DNA甲基转移酶催化下，利用S－腺苷甲硫氨酸提供的甲基，将胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，从而使胞嘧啶转化为5－甲基胞嘧啶，其对基因的表达调控有着至关重要的作用。DNA甲基化具有一定的稳定性，它是癌症发生中的早期事件，因此DNA的甲基化异常可以作为一种癌症诊断的生物标记物。人类的血清、血浆、脑脊液、尿液或唾液当中存在大量的游离DNA(cfDNA)，cfDNA中通常包含肿瘤细胞坏死或者凋亡后释放的DNA，通过对cfDNA中特定基因甲基化进行检测可以实现便捷、无创的进行乳腺癌的早期筛查和诊断。目前已有基于DNA甲基化检测的结直肠癌、胃癌等肿瘤筛查诊断产品获得FDA或CFDA的认证，但是乳腺癌的DNA甲基化位点的相关研究较少，且其用于乳腺癌早期诊断的精确度也未满足人们的要求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一提供一种COL4A1和NOTCH2基因甲基化在制备检测乳腺癌产品中的应用，COL4A1和NOTCH2基因甲基化对乳腺癌具有较高的敏感性和特异性。

本发明的目的之二提供一种用于检测乳腺癌的引物探针组合物，灵敏度高，特异性强，可实现多个目的基因甲基化特异性扩增检测，适用于乳腺癌的筛查和诊断。

本发明的目的之三在于提供一种用于检测乳腺癌的试剂盒，其准确度高、便捷性好，适用于乳腺癌的早期筛查、辅助诊断和预后评估。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

COL4A1和NOTCH2基因甲基化在制备检测乳腺癌产品中的应用。

进一步地，所述COL4A1和NOTCH2基因甲基化作为生物标记物。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种用于检测乳腺癌的引物探针组合物，包括用于检测COL4A1基因和NOTCH2基因甲基化的引物对和对应的探针；

用于检测COL4A1基因甲基化的引物对包括碱基序列如SEQ ID NO:1所示的第一正向引物和碱基序列如SEQ ID NO:2所示的第一反向引物，检测COL4A1基因甲基化的探针为碱基序列如SEQ ID NO:3所示的第一探针；

用于检测NOTCH2基因甲基化的引物对包括碱基序列如SEQ ID NO:4所示的第二正向引物和碱基序列如SEQ ID NO:5所示的第二反向引物，检测NOTCH2基因甲基化的探针为碱基序列如SEQ ID NO:6所示的第二探针。

进一步地，还包括用于检测内参基因的第三正向引物、第三反向引物和对应的第三探针；

所述第一探针、第二探针和第三探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，且所述第三探针的荧光基团与分别用于检测COL4A1和NOTCH2基因甲基化的探针的荧光基团均不相同。

进一步地，所述荧光基团为FAM、ROX、VIC和CY5荧光基团中的任一种；所述淬灭基团为MGB、BHQ和TAMRA淬灭基团的任一种。

进一步地，所述内参基因为GAPDH、ACTB和RPⅡ中的任一种。

进一步地，所述内参基因为GAPDH基因，用于检测GAPDH基因的第三正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:7所示，第三反向引物的碱基序列如SEQ IDNO:8所示，第三探针的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

一种用于检测乳腺癌的试剂盒，包括所述的用于检测乳腺癌的引物探针组合物。

进一步地，其检测方法包括以下步骤：

1)提取游离DNA，并将所述游离DNA进行甲基化转化，得到转化样本；

2)以所述转化样本为模板，利用所述的检测乳腺癌的引物探针组合物进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结果。

进一步地，步骤2)中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：

第一步：温度94-96℃下反应4-6min，循环1-2次；

第二步：温度94-96℃下反应14-16s，然后温度65-67℃下反应28-32s，循环18-22次；

第三步：温度94-96℃下反应9-11s，然后温度61-63℃下反应30-32s，采集荧光，循环38-42次。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明的一种COL4A1和NOTCH2基因甲基化在制备检测乳腺癌产品中的应用，COL4A1基因和NOTCH2基因甲基化在乳腺癌患者血浆中具有较高的检出率，并与其他疾病的表达水平相比具有显著的差异性，通过COL4A1基因和NOTCH2基因甲基化联合检测，将大幅提高对乳腺癌早期筛查和诊断的敏感性和特异性。

本发明的一种用于检测乳腺癌的引物探针组合物，可对COL4A1基因和NOTCH2基因甲基化进行特异性扩增和标记，灵敏度高，特异性强，适用于乳腺癌的早期筛查、辅助诊断和预后评估。

本发明的一种用于检测乳腺癌的试剂盒，其准确度高、便捷性好，且采集临床样本简单方便，检测效率高。

附图说明

图1为COL4A1基因甲基化的扩增曲线图；其中，线1为GAPDH内参基因，线2为COL4A1基因。

图2为NOTCH2基因甲基化的扩增曲线图；其中，线1为GAPDH内参基因，线2为NOTCH2基因。

具体实施方式

下面，结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

甲基化基因的筛选和引物探针组合物的设计

本实施例基于TCGA数据库及临床样本高通量甲基化测序数据，将临床样本高通量甲基化测序数据中乳腺癌患者和健康人群甲基化数据进行差异分析，筛选甲基化差异位点，对筛选到的甲基化差异位点进行临床验证，确定COL4A1和NOTCH2基因甲基化为最佳生物标记物。

根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列，使用PrimerPremier 5设计引物和探针，得到用于检测COL4A1和NOTCH2基因甲基化的引物探针组合物。

具体为：

用于检测COL4A1基因甲基化的引物对包括碱基序列如SEQ ID NO:1所示的第一正向引物(COL4A1-Me-F)和碱基序列如SEQ ID NO:2所示的第一反向引物(COL4A1-Me-R)，检测COL4A1基因甲基化的第一探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有MGB淬灭基团，命名为：COL4A1-Me-Probe(FAM)，碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

用于检测NOTCH2基因甲基化的引物对包括碱基序列如SEQ ID NO:4所示的第二正向引物(NOTCH2-Me-F)和碱基序列如SEQ ID NO:5所示的第二反向引物(NOTCH2-Me-R)，检测COL4A1基因甲基化的第二探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有BHQ淬灭基团，命名为：NOTCH2-Me-Probe(VIC)，碱基序列如SEQ ID NO:6所示。

本实施例取内参基因为GAPDH基因，所述内参基因的第三正向引物和第三反向引物分别记为GAPDH-Me-PF和GAPDH-Me-PR，碱基序列分别如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示；其对应的第三探针标记有CY5荧光基团和BHQ淬灭基团，命名为：GAPDH-Me-Probe(CY5)，序列如SEQ ID NO:9所示。

本实施例的引物探针组合物的碱基序列具体如表1所示。

表1引物探针组合物序列

实施例2

一种用于筛查乳腺癌的试剂盒，包括实施例1中用于检测COL4A1基因和NOTCH2基因甲基化的引物探针组合物以及所述内参GAPDH基因的引物探针组合物；还包括裂解液、亚硫酸氢盐转化剂和PCR反应试剂。

实施例3

本实施例为采用实施例2的用于筛查乳腺癌的试剂盒进行乳腺癌检测的检测方法，包括以下步骤：

1、提取血浆cfDNA；

具体为：

(1)取2ml血浆样本，加入200μL蛋白酶K和1.6ml裂解液，60℃下裂解30min；

(2)向裂解处理后的物料加入3.6mL异丙醇-盐酸胍充分混匀，加入吸附柱中，全速离心30s，加入漂洗液进行洗涤，重复洗涤2-4次后，静置，离心收集DNA。

2、将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转化剂进行转化，将基因中的胞嘧啶转化成尿嘧啶，得到转化样本；

具体为：(1)将游离DNA全部转移至0.2mL离心管中，添加150μL亚硫酸氢盐转化剂，摇匀后置于变温器中，设置条件为：

①98℃，10min；

②62℃，90min；

③4℃保持4h。

(2)待转化反应完成后，移至吸附柱中，洗涤，离心，收集，得到转化样本。

通过轻弹离心管或移液器轻柔吹打操作混匀后短暂离心。

3、将所述转化样本进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结果。

具体为：(1)将目的基因甲基化的引物探针组合物和所述内参基因的引物探针组合物与PCR反应试剂混合，加入适量转化样本，得到时荧光定量PCR反应液，具体成分如表2所示。

表2

(2)将实时荧光定量PCR反应液送入PCR仪器中进行反应，反应条件如表3所示。

表3PCR反应条件

(3)分别读取实时荧光定量PCR反应液的CT值，获得的扩增曲线图如图1-2所示；可以看出，COL4A1基因和NOTCH2基因甲基化对乳腺癌具有极高的敏感性和特异性。

实施例4

本实施例获取基于血浆cfDNA提取的16组纤维腺瘤、50组正常样本(标记为N1～N66)和68组乳腺癌样本(标记为C1～C68)进行实施例3的荧光定量PCR检测，根据检测的CT值换算成相应的分数(Score)，结果如表4所示。

计算方法为：

总分＝各目的基因分数之和；

△CT＝目的基因CT值-内参基因CT值；

CT值与分数的换算方法为：

(1)目的基因的△CT值＜0时，分数(Score)＝3；

(2)COL4A1基因：0≤△CT≤6时，Score(C)＝2；△CT＞6时，Score(C)＝0；

(3)NOTCH2基因：0≤△CT≤5时，Score(C)＝2；△CT＞5时，Score(C)＝0。

表4

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本实施例取临界值(cut-off值)＝3，当总分≥3时，检测结果为阳性，总分＜3时，检测结果为阴性；

灵敏性＝检测结果为阳性的乳腺癌样本数/总乳腺癌样本数；

特异性＝检测结果为阴性的非乳腺癌样本数/总非乳腺癌样本数。

根据表4的检测结果，对检测结果为阳性的乳腺癌样本数和检测结果为阴性的正常样本数进行统计得到表5-6。

表5

表6

从表4-6可得，在从血浆cfDNA提取的16组纤维腺瘤、50组正常样本和68组乳腺癌样本的测试中，本实施例的试剂盒的灵敏性为67.64％(46/68)，特异性为96.97％(64/66)；其中，III期和IV期的乳腺癌样本的灵敏性高于II期以下的乳腺癌样本，说明本发明的试剂盒的检测结果对乳腺癌的辅助诊断具有极高的参考价值。纤维腺瘤与乳腺癌的部位相同，且早期病症极为相似，但是纤维腺瘤为乳腺发生的一种良性病变，乳腺癌则是恶性病变，在临床医学中需要对两者进行区分，本发明的试剂盒的对纤维腺瘤的特异性高达100％，对正常人也具有极高的特异性；证明本发明的试剂盒及其检测方法能有效对COL4A1和NOTCH2基因甲基化检测，并具有优异的灵敏性和特异性，极为适用于乳腺癌的早期筛查和诊断。

本实施例将上述样本采用其它肿瘤标志物进行检测，结果如下：

1、CA125(糖类抗原125)

正常值范围0-25，

灵敏性14.71％(10/68)；

特异性89.39％(59/66)。

2、CA153(癌胚抗原153)

正常值范围0-25，

灵敏性23.53％(16/68)；

特异性92.42％(61/66)。

实验表明，相比常规的CA125和CA153肿瘤标志物，本发明的COL4A1和NOTCH2基因甲基化的灵敏性(67.64％)和特异性(96.97％)大幅提升，尤其是灵敏性的提升尤为显著，说明本发明的试剂盒对乳腺癌的早期筛查、监测病情变化和预后评估均具有良好的参考价值。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。