一种强化生物基戊二胺合成的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种强化生物基1,5-戊二胺合成的方法及其应用。

背景技术

尼龙聚酰胺(PAs)是一类具有良好的机械性能、耐热性、耐腐蚀性等性质的工程塑料，其中PA66应用最为常见。PA66由等比例的己二酸和己二胺缩聚得到，在纺织、涂料和化妆等行业的需求量大。目前PA66的关键生产原料己二胺主要由化学合成得到，对石油等化石燃料的依赖度极高；另外，由己二腈化学合成己二胺的重要生产技术一直被国外企业所垄断，严重制约我国尼龙行业的发展。

生物基尼龙PA5X因为具有良好的类似特性和可持续的生产方式而备受关注。由戊二胺和二元酸可以合成一系列的尼龙PA5X产品，生物基尼龙PA5X 的生产不仅能够降低尼龙行业对石油资源的依存度，而且能够形成具有自主知识产权的尼龙PA5X生产技术，实现国内聚酰胺工业生产的重大突破。

生物基尼龙PA5X的关键是核心单体戊二胺的高效合成。生物基戊二胺的生产主要依赖于赖氨酸脱羧酶。在高浓度戊二胺的生产过程中，反应体系的pH 会随着产物戊二胺的不断累积而明显升高，而目前所报道的大多数赖氨酸脱羧酶的最适pH在酸性或中性条件下，当pH为8.0时，其催化活性几乎完全丧失。因此强化赖氨酸脱羧酶的耐碱性，是目前生物基戊二胺生产的一个关键。

酶的活性和稳定性在很大程度上受到反应离子环境影响，反应离子环境的改变能够导致蛋白质表面局部溶剂与溶剂主体的差异，影响酶活性位点甚至改变酶的整体结构。Lee等发现Na

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种强化生物基戊二胺合成的方法，其特征在于，通过向反应体系中添加一定量的无机盐，改变反应微环境，进而提高生物基戊二胺合成所必须的赖氨酸脱羧酶的催化效率和耐碱性，从而强化其参与的合成生物基戊二胺过程。所述的强化生物基戊二胺合成的方法，具体而言包括如下步骤：

将赖氨酸脱羧酶与底物L-赖氨酸盐酸盐和辅酶磷酸吡哆醛(PLP)混合，并添加一定量的无机盐于反应体系中，离心后收集上清液得到包含戊二胺的反应溶液。

在本发明方法中，所述的无机盐的阳离子是Na

优选地，无机盐阳离子为Na

优选地，无机盐阴离子为Cl

所述的无机盐的添加量为0.01～10％(w/v)，优选地无机盐添加量为0.1～2.7％(w/v)，更优选地无机盐添加量为0.3～1.8％(w/v)，更加优选地无机盐添加量为0.9～1.8％(w/v)，例如可以是0.9％、1.0％、1.2％、1.35％、1.5％、 1.8％等。

所述的无机盐的添加时机可以在赖氨酸脱羧酶添加之前加入，也可以在赖氨酸脱羧酶添加之后加入。

在本发明方法中，所述的赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶来源于迟缓爱德华氏菌、蜂房哈夫尼菌、耐碱芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、尸杆菌、伯克霍尔德氏菌、青紫色素杆菌、霍乱弧菌、毛链霉菌、反刍动物月形单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、邦戈沙门氏菌、沙雷氏菌属、博代氏杆菌属、霍乱弧菌、气单胞菌属或克雷伯氏菌属中的任意一种；

优选地，所述赖氨酸脱羧酶来源于迟缓爱德华氏菌、克雷伯氏菌属、气单胞菌属或邦戈沙门氏菌。

优选地，所述的赖氨酸脱羧酶的存在形式是游离的、固定化的或者是包含于细胞之内的。

优选地，包含赖氨酸脱羧酶的细胞是新鲜的或者冻存的。

在本发明方法中所述的反应体系的环境是缓冲液或新鲜发酵液。

优选地，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种，优选地，缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。

优选地，所述反应体系的pH为5～11，例如可以是5、6、6.4、7、7.2、7.5、 8、9、10或11等，优选为6～10。

在本发明方法中所述反应体系中底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为0.01～3M，例如可以是0.01M、0.1M、0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M、1.8M、2M、 2.5M、3M。

所述反应体系中辅酶PLP的浓度为0.1～0.5mM，例如可以是0.1mM、0.15 mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM或0.5mM等。

在本发明方法中所述生物基戊二胺合成的反应的温度为35～65℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃等，时间为0.5～24h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、5h、6h、8h、10h、12h、15h、 16h、18h、20h或24h等，优选为1～4h。

所述反应时振荡速率为100～800rpm，优选地，反应时的振荡速率为200～800rpm，例如可以是200rpm、250rpm、400rpm、500rpm、550rpm、600rpm、 650rpm、700rpm或800rpm等。

本发明方法中所述的离心收集上清液时的离心转速为6000～12000rpm，优选地，离心时的转速为10000～12000rpm，例如可以是10000rpm、10500rpm、 11000rpm、11500rpm或12000rpm等，时间为1～30min，例如可以是1min、 2min、5min、10min、20min、30min等。

优选地，所述制备戊二胺的方法包括如下步骤：

(1)将游离的赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞与含有赖氨酸盐酸盐和磷酸吡哆醛的反应体系混合，所述的反应体系中的赖氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.01～3M，磷酸吡哆醛的摩尔浓度为0.1～0.5mM。

(2)添加0.9～1.8％(w/v)的NaCl、KCl、CH

(3)在35～65℃下以200～800rpm振荡反应1～4h，再以10000～12000rpm 离心1～30min，得到包含戊二胺反应溶液。

本发明中，在合成戊二胺后，检测赖氨酸和戊二胺采用的方法为：

(1)在衍生体系中加入600μL 50mM pH 9的硼酸缓冲液、200μL甲醇、60μL稀释样品、130μL ddH

(2)使用反相高效液相色谱紫外检测器进行检测，流动相A为100％的乙腈；流动相B为25mM pH 4.8醋酸钠缓冲溶液，流速0.5mL/min；检测柱为 C18；柱检测温度：35℃；进样量：2～10μL；波长：284nm。

采用梯度洗脱：0min A:B为20:80；2min A:B为25:75；22min A:B为 48.4:51.6；22.01min A:B为20:80；27min A:B为20:80；27.01min结束，所述的梯度洗脱并不仅限于上述梯度洗脱比例。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明提供了一种强化生物基戊二胺合成的方法，通过添加无机盐，改变反应微环境，提高了赖氨酸脱羧酶的反应活性和稳定性，使得赖氨酸脱羧酶在偏碱性条件下保持了较高的催化活性，同时也提高了相应的热稳定性；同时这种强化生物基戊二胺的合成的方法，显著提高了利用赖氨酸脱羧酶高浓度合成生物基戊二胺的催化效率，具有极高的工业应用前景。

附图说明

图1不同阳离子对赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3反应活性的影响。

图2不同浓度NaCl对赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3反应活性的影响

图3实验组赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的pH耐受性的影响

图4对照组赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的pH耐受性的影响

图5赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt4的T

图6强化游离赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3 2M L-赖氨酸高浓度催化应用

图7强化赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3全细胞催化2M L-赖氨酸应用

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，本领域技术人员应该明了，下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

实施例1

本实施例提供一种不同阳离子无机盐额添加对游离赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3 活性的影响。

在500μL反应体系中，底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为10mM，辅酶PLP 浓度为0.1mM，反应体系中赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3终浓度为0.236μg/mL，体系中无机盐添加量0.9％(w/v)，在Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8)中，55℃、 500rpm催化反应1h，12000rpm离心2min，取溶液检测戊二胺含量。不同阳离子无机盐对游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3催化活性的影响如图1所示，其中 Na

实施例2

本实施例中检测不同浓度的NaCl对游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的催化活性的影响。

赖氨酸脱羧酶突变体ΔLdcEt3的反应体系为500μL反应体系，其中底物 L-赖氨酸盐酸盐的浓度为10mM，辅酶PLP浓度为0.1mM，体系中游离的赖氨酸脱羧酶突变体ΔLdcEt3浓度为0.236μg/mL，体系中NaCl添加量(w/v)为 0.45％、0.9％、1.35％、1.8％、2.7％，在Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8)中，55℃、500rpm催化反应1h，12000rpm离心2min，取溶液检测戊二胺含量。不同浓度NaCl对游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的催化活性的影响如图2所示。游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的催化活性随NaCl添加量的增加先增加后减小。在NaCl添加量在0.9～1.8％(w/v)，赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的催化活性最高。

实施例3

本实施例中对比了不同pH缓冲液中，0.9％NaCl(w/v)的添加对于游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的反应活性。

所述缓冲液为，醋酸钠缓冲液(50mM，pH＝5、6)，磷酸缓冲液(50mM， pH＝7)，Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8)，碳酸钠缓冲液(50mM，pH＝9、10、 11)。

在500μL反应体系中，底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为10mM，辅酶PLP浓度为0.1mM，体系中游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3浓度为0.236μg/mL，实验对照组和实验组，对照组不添加0.9％NaCl(w/v)，实验组添加0.9％NaCl(w/v)，在55℃500rpm催化反应1h，12000rpm离心2min，取溶液检测戊二胺含量。不同pH下，0.9％NaCl(w/v)的添加对于游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3影响如表1所示。随着pH的升高，游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的催化活性先升高后降低；相比于未添加0.9％NaCl(w/v)的对照组而言，添加0.9％NaCl(w/v) 后游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3表现出更为良好的催化活性，尤其是pH 8碱性条件，这说明0.9％NaCl(w/v)的添加能够提高了游离的赖氨酸脱羧酶在碱性条件下的催化活性。

表1赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3在不同pH下的相对活性

实施例4

本实施例中检测了添加0.9％NaCl(w/v)对游离赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的 pH耐受性的影响。

将游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3置于不同pH的缓冲液中，其中赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的浓度25μg/mL，分为对照组和实验组，对照组不添加0.9％NaCl (w/v)，实验组添加0.9％NaCl(w/v)，将对照组和实验组置于4℃下保存，在 1h，24h，72h时间点取样并分别在最适条件下反应。本实施例中所用缓冲液与实施例3中所述缓冲液一致。

赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的反应体系为500μL反应体系，赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3浓度为0.236μg/mL，底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为10mM，辅酶PLP 浓度为0.1mM，缓冲液为Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝8)，添加0.9％NaCl (w/v)。在55℃下，500rpm，催化反应1h，经12000rpm离心2min，取溶液检测戊二胺含量。

对照组和实验组的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的pH耐受性结果分别如图3、图4所示。对照组和实验组的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的最耐受pH均为7，但是在 pH 7下放置72h后，对照组赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3剩余活性仅有75.21±3.93％，而实验组赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3剩余活性为105±1.91％；在pH 8条件下，对照组和实验组的赖氨酸脱羧酶的pH耐受性表现出更为明显的差异，72h后，对照组ΔLdcEt3剩余活性仅为10.61±0.61％，而实验组ΔLdcEt3活性变化不显著，剩余活性92.47±4.34％。这表明0.9％NaCl(w/v)的添加明显提高了赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的pH耐受性，特别是耐碱性的提高。

实施例5

本实施例中测定了添加0.9％NaCl(w/v)对游离赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt4的 T

本实例利用Applied Biosystems

实施例6

本实施例中展示0.9％NaCl(w/v)的添加强化游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3 催化2M L-赖氨酸的应用。

在2mL反应体系中，底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为2M，辅酶PLP浓度为0.1mM，体系中游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3浓度为400μg/mL，反应所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8)，实验分为实验组和对照组，实验组不添加0.9％NaCl(w/v)，对照组添加0.9％NaCl(w/v)，在55℃500rpm催化反应2h，取样0.5h，1h，1.5h，2h，然后12000rpm离心2min，在70℃下加热5min终止反应，取溶液检测戊二胺含量。0.9％NaCl(w/v)的添加强化游离的赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3催化2M L-赖氨酸的结果如图6所示，反应进行 2h后，实验组和对照组的L-赖氨酸的转化率均为99％，但是很明显添加NaCl 之后，赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的催化速率明显加快，在反应进行1h，实验组 L-赖氨酸的转化率为97.66±0.17％，而对照组L-赖氨酸的转化率只有84.96± 0.04％，这表明0.9％NaCl(w/v)的添加强化了赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3合成生物基戊二胺的催化效率。

实施例7

本实施例中展示0.9％NaCl(w/v)的添加强化含有赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3 的全细胞催化2M L-赖氨酸的应用。

在500mL反应体系中，底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为2M，辅酶PLP浓度为0.1mM，体系中含有赖氨酸脱羧酶ΔLdcEt3的全细胞OD

综上所述，本发明提供的强化生物戊二胺合成的方法，通过添加额外的无机盐，改变反应微环境，提高了赖氨酸脱羧酶的反应活性和稳定性，使得赖氨酸脱羧酶在偏碱性条件下保持了较高的催化活性，同时也提高了相应的热稳定性；同时这种方法，显著提高了利用赖氨酸脱羧酶高浓度合成生物基戊二胺的催化效率，具有极高的工业应用前景。