用于鉴定西瓜果皮条纹表型性状的功能性分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定西瓜果皮条纹表型性状的功能性分子标记及其应用。本发明属于分子标记育种领域。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)是世界上重要的园艺作物之一，在世界范围内广泛种植，我国是世界上最大的西瓜生产国和消费国。西瓜果皮条纹作为一种重要的农艺性状和商品性状，直接影响市场上消费者的评价标准。近年来成为国内外育种家研究重点之一，然而果皮条纹种类变异丰富，在不同遗传背景条件下表现不尽相同，调控机理复杂，其中关于果皮模糊型条纹的研究仍主要集中于初步定位及分子标记的开发，有关果皮模糊型条纹基因的精细定位、克隆及其功能分析方面的研究还未见报道。

根据基因序列开发的功能性分子标记，能够直接检测基因，并对等位基因及相对性状进行区分和预测。常规育种周期长并需要对此重复观察，以此得到纯合基因型的植株。分子标记辅助育种技术准确高效鉴定植株基因型，缩短了常规育种所需要的年限。

开发用于鉴定西瓜果皮模糊型条纹表型性状的功能性分子标记，利用功能性分子标记筛选目标条纹品系，实现分子标记辅助选择育种，加速选育进程，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定西瓜果皮条纹表型性状的功能性分子标记及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提出的一种用于鉴定西瓜果皮条纹表型性状的功能性分子标记，命名为CAPS-TWMYB-1，所述的功能性分子标记通过使用TWMYB-1正向引物以及TWMYB-1反向引物扩增西瓜基因组DNA后得到，所述的TWMYB-1正向引物以及TWMYB-1反向引物的序列为：

TWMYB-1正向引物：5'-GCATCTATTCTTTTTACCTTCCATT-3'

TWMYB-1反向引物：5'-GCACAGCTTTTAGTTTTGAGAGG-3'。

其中，优选的，所述的西瓜果皮条纹表型性状包括西瓜模糊型条纹表型性状以及西瓜清晰型条纹表型性状。

进一步的，本发明还提出了所述的功能性分子标记在鉴定西瓜果皮条纹表型性状中的应用。

其中，优选的，所述的西瓜果皮条纹表型性状包括西瓜模糊型条纹表型性状以及西瓜清晰型条纹表型性状。

再进一步的，本发明还提出了一种用于鉴定西瓜果皮条纹表型性状的引物对，所述的引物包括TWMYB-1正向引物以及TWMYB-1反向引物，所述的TWMYB-1正向引物以及TWMYB-1反向引物的序列为：

TWMYB-1正向引物：5'-GCATCTATTCTTTTTACCTTCCATT-3'

TWMYB-1反向引物：5'-GCACAGCTTTTAGTTTTGAGAGG-3'。

再进一步的，本发明还提出了所述的引物对在鉴定西瓜果皮条纹表型性状中的应用。

其中，优选的，所述的西瓜果皮条纹表型性状包括西瓜模糊型条纹表型性状以及西瓜清晰型条纹表型性状。

更进一步的，本发明还提出了一种鉴定西瓜果皮条纹表型性状的方法，所述的方法包括使用所述的引物对扩增西瓜基因组DNA，然后对得到的PCR扩增产物进行Msel限制性内切酶酶切处理的步骤，当酶切产物有274bp条带，则说明该样品为纯合模糊型条纹西瓜品系，当酶切扩增产物有232bp的特征条带，则说明该样品为纯合清晰型条纹西瓜品系，当酶切产物为两条长度分别为274bp、232bp的特征条带，这说明该样品为杂合模糊型条纹西瓜品系。

其中，优选的，所述的方法包括以下步骤：

S1、取西瓜幼嫩叶片为材料，采用经过改良的CTAB法提取总DNA；

S2、以S1得到的DNA为模板，采用TWMYB-1正向引物和TWMYB-1反向引物进行PCR扩增利用TWMYB-1F和TWMYB-1R进行PCR扩增；

TWMYB-1正向引物：5'-GCATCTATTCTTTTTACCTTCCATT-3'

TWMYB-1反向引物：5'-GCACAGCTTTTAGTTTTGAGAGG-3'

PCR扩增反应体系及反应程序如下：

配置PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 4μL；ddH2O 3μL；TWMYB-1F 1μL；TWMYB-1R 1μL；DNA模板1μL；

PCR反应程序：预变性94℃5min，每个循环先95℃变性1min，56℃复性45s，72℃延伸1min；循环35次后，4℃保存，完成PCR的扩增；。

S3、对S2得到的PCR扩增产物进行酶切处理，酶切体系：5μL-PCR产物、0.5μL-Msel限制性内切酶、1μL-10×Buffer Tango、6μL-ddH2O；酶切程序：65℃恒温处理2.5h；

S4、利琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物的检测

利用3％浓度的琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物的检测，在第一个点样孔中加入DM2000 Marker作为分子量标记，其次将酶切产物依次加到点样孔中；设置电压220V，电流150mA，时间25min；电泳结束后，在凝胶成像分析系统下进行检测并保存胶图。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明公开了一个可用于鉴定西瓜果皮条纹表型性状的功能分子标记，可用于分子标记辅助育种，从而提高育种中选择的准确性，可以免去杂交选育的工作，大大缩短优良品种选育周期，提高育种效率并加快育种进程。

附图说明

图1为模糊型条纹品系与清晰型条纹品系实物图；

注：A：西瓜清晰型条纹品系slb；B：西瓜模糊型条纹品系GWAS-38；a：西瓜清晰型条纹局部图；b：西瓜清晰型条纹局部图。

图2为西瓜果皮模糊型条纹表型性状功能性分子标记TWMYB-1对双亲、F

注：泳道1：DM2000Marker；泳道2-4：双亲及F1；泳道5-7：纯合模糊型条纹品系西瓜；8-13：杂合模糊型条纹品系西瓜；14-16：纯合清晰型条纹品系西瓜；17-20：纯合模糊型条纹自然西瓜群体；21-24：纯合清晰型条纹自然西瓜群体。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1分子标记的获得

以模糊型条纹品系GWAS-38(图1B)和清晰型条纹品系slb(图1A)为双亲，杂交获得F

BSA-seq技术结合分子标记的开发在6号染色体上找到目的基因的候选区域，通过基因分型将候选区间定位到190kb区段内，在初定位区间内继续开发功能性分子标记，该标记可被限制性内切酶Msel(酶切位点TTAA)切割，所述功能性分子标记所采用的引物序列为：

TWMYB-1正向引物：5'-GCATCTATTCTTTTTACCTTCCATT-3'

TWMYB-1反向引物：5'-GCACAGCTTTTAGTTTTGAGAGG-3'。

实施例2功能标记的应用方法

本发明提供了一种用于检测西瓜果皮模糊型条纹表型性状的方法，具体来说，该方法为PCR扩增、酶切加电泳检测差异的方法，具体步骤如下：

S1、取西瓜幼嫩叶片为材料，采用经过改良的CTAB法提取总DNA；

S2、以S1得到的DNA为模板，采用TWMYB-1正向引物和TWMYB-1反向引物进行PCR扩增利用TWMYB-1F和TWMYB-1R进行PCR扩增

TWMYB-1正向引物：5'-GCATCTATTCTTTTTACCTTCCATT-3'

TWMYB-1反向引物：5'-GCACAGCTTTTAGTTTTGAGAGG-3'。

PCR扩增反应体系及反应程序如下：

表1 PCR扩增反应体系

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表2 PCR扩增反应程序

S3、对S2得到的PCR扩增产物进行酶切处理，酶切体系：5μL-PCR产物、0.5μL-Msel限制性内切酶、1μL-10×BufferTango、6μL-ddH2O；酶切程序：65℃恒温处理2.5h。

S4、利琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物的检测

利用3％浓度的琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物的检测，在第一个点样孔中加入DM2000 Marker作为分子量标记，其次将酶切产物依次加到点样孔中；设置电压220V，电流150mA，时间25min；电泳结束后，在凝胶成像分析系统下进行检测并保存胶图。

利用该引物对对所有F

纯合模糊型条纹西瓜PCR产物：274bp

TAGCATCAACTCGCTCATGGAGGATATTGTTGGCGCCTCTGTTGACGAAGCCAATAATTATGATCGGAAAAGATATAACGACAATAACGAAGAATCGGTGGAGTTTCGTCGGGTTGAAATGGAGAAGTTGCAGTATTGTGCTCCGGTGAGTACGGCGACGGCGGCAGGGATGGAGTTTGATGTGAAGAAAGAACTTGATTTAGTAGAAATGATAACTCAAGTCAATGAAGTTCATAACGTGATGAAATAATGAATCAATGTGAGAACAAATTTT(SEQ ID NO.1所示)

纯合清晰型条纹西瓜PCR产物：232bp

TAGCATCAACTCGCTCATGGAGGATATTGTTGGCGCCTCTGTTGACGAAGCCAATAATTATGATCGGAAAAGATATAACGACAATAACGAAGAATCGGTGGAGTTTCGTCGGGTTGAAATGGAGAAGTTGCAGTATTGTGCTCCGGTGAGTACGGCGACGGCGGCAGGGATGGAGTTTGATGTGAAGAAAGAACTTGATTTAGTAGAAATGATAACTCAAGTCAATGAAGTT(SEQ ID NO.2所示)