硅基靶板及其生产方法和应用

技术领域

本发明属于微生物质谱检测技术领域，具体的为一种硅基靶板及其生产方法和应用。

背景技术

质谱仪是利用电磁学原理把离子依据质荷比(M/Z)不同进行分离，进而测量物质的质量与含量的科学仪器。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(简称：MALDI-TOF-MS)是质谱仪家族的一个重要分支，能够简单、快速、准确的同时对多种样品进行分析与鉴定，通常是先将样品(蛋白提取液、基质溶液)固定在靶板的靶点上，再被送入到MALDI-TOF-MS中进行分析与鉴定。

靶板作为样品与基质共结晶的载体，目前采用钢靶。钢靶在实际检测过程重复使用，存在交叉污染和残留问题，造成了分析、鉴定结果的不准确。公开号为CN111017867A的中国专利申请公开了一种制备网络结构硅基点阵的方法，包括：S1.在硅基底上表面自组装微纳米球阵列；S2.在具自组装微纳米球阵列的所述硅基底表面旋涂前驱体溶液；S3.将所述硅基底放置在退火炉中退火，以在所述硅基底表面形成微纳米碗阵列结构；S4.以等离子刻蚀技术对所述经退火的具有微纳米碗阵列结构的硅基底进行刻蚀，形成微纳米葫芦状阵列结构；S5.将所述硅基底进行掩膜光刻以制备点样区；以及S6.将所述具有点样区的硅基底制成靶板。该方法虽然在一定能够制备网络结构硅基点阵，但工艺方法复杂，产品质量难以控制，无法适用于工业化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种硅基靶板及其生产方法和应用，利用亲疏水处理，能够有效束缚样品(蛋白提取液和基质溶液)，使共结晶更均匀。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明首先提出了一种硅基靶板的生产方法，包括如下步骤：

步骤一：在硅片表面镀疏水层；

步骤二：利用激光雕刻在硅片镀有疏水层的正面上雕刻样品点，且样品点的雕刻深度大于等于疏水层的厚度。

进一步，所述步骤一中，在硅片表面镀疏水层前，对硅片进行UV清洗。

进一步，所述步骤一中，采用蒸镀工艺在硅片表面形成疏水层，方法如下：

11)取定量的氟硅烷置于氧化铝坩埚中；

12)将硅片置于硅片支架上后与所述氧化铝坩埚一起置于反应釜内；

13)将密闭的反应釜置于干燥箱，运行干燥性使氟硅烷镀在硅片表面上，即在硅片表面形成疏水层。

进一步，还包括热处理工序，方法如下：

14)将经蒸镀工艺处理后的硅片置于干燥箱内，运行干燥箱，使氟硅烷与硅片之间形成 Si-F键，使氟硅烷固化在硅片上。

进一步，所述步骤二中，在所有样品点均雕刻完成后，在硅片的背面中心贴镀锌铁片。

进一步，还包括步骤三，利用酒精对硅片进行清洗。

本发明还提出了一种硅基靶板，采用如上所述硅基靶板的生产方法制备得到。

本发明还提出了一种如上所述硅基靶板在质谱检测中的应用，其特征在于：挑取单个菌落并均匀涂抹在硅基靶板的样品点内，在室温下待其自然晾干；随后滴加70％甲酸溶液覆盖样品，再滴加饱和基质溶液覆盖样品，自然晾干后进行质谱采谱。

进一步，所述菌落、70％甲酸溶液以及饱和基质溶液之间的容量比为1:1:1。

本发明还提出了一种如上所述硅基靶板在质谱检测中的应用，其特征在于：首先，在离心管内将菌体与无菌水混匀后，加入无水乙醇，振荡混匀后进行第一次离心处理，弃上清液后干燥；其次，在离心管内加入70％甲酸溶液，吹打混匀后室温静置，而后加入乙腈，混匀后进行第二次离心处理，取上清液为样品溶液；最后，取样品溶液至硅基靶板的样品点内，在室温下自然晾干，再滴加饱和基质溶液覆盖样品，自然晾干后进行质谱采谱。

进一步，当菌体为丝状真菌时，在加入70％甲酸溶液的同时，加入与菌体同等体积的玻璃珠，以充分研磨菌体。

本发明的有益效果在于：

本发明的硅基靶板的生产方法，在硅片表面镀疏水层后，利用激光雕刻将疏水层去除后形成样品点，从而制备得到硅基靶板；在进行质谱检测时，硅基靶板作为样品与基质共结晶的载体，硅基靶板上的亲疏水处理能够有效束缚样品(蛋白提取液和基质溶液)，并使得它们共结晶更均匀；靶板上样品在激光作用下发生离子化，再经过高压电场加速，进入无场区，最终达到检测器，从而能够满足质谱检测的要求。另外，本发明的硅基靶板的生产方法还具有工艺流程简单，便于实现工业化生产的优点。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明硅基靶板实施例的结构示意图；

图2为图1的A-A剖视图，具体的，圆柱形凹槽的底面设为球面；

图3为图1的A-A剖视图，具体的，圆柱形凹槽的底面设为平面；

图4为本实施例的硅基靶板采用直涂法在质谱检测中的应用方法的流程图；

图5为本实施例的硅基靶板采用提取法在质谱检测中的应用方法的流程图；

图6为自动激光统计得到的硅基靶板和钢靶的采空率的统计结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本实施例硅基靶板的生产方法，包括如下步骤：

步骤一：在硅片表面镀疏水层；

具体的，在硅片表面镀疏水层前，对硅片进行物理的UV清洗，即将硅片放入紫外光照射机中清洗10-15min后取出。

也可采取化学的酸清洗，具体为：(1)将硅片先用成分比为H

具体的，本实施例采用蒸镀工艺在硅片表面形成疏水层，方法如下：

11)取500μL的氟硅烷置于氧化铝坩埚中；

12)将硅片置于硅片支架上后与所述氧化铝坩埚一起置于反应釜内；

13)将密闭的反应釜置于干燥箱，运行干燥箱使氟硅烷镀在硅片表面上，即在硅片表面形成疏水层。本实施例的干燥箱运行温度为150℃，运行时间60min，而后在自然条件下使硅片降温至常温。

优选的，本实施例采用蒸镀工艺在硅片上蒸镀疏水层后，再对硅片进行热处理，即还包括热处理工序，方法如下：

14)将经蒸镀工艺处理后的硅片置于干燥箱内，运行干燥箱，使氟硅烷与硅片之间形成 Si-F键，使氟硅烷固化在硅片上。具体的，干燥箱的运行温度为180℃，运行时间30min。

优选的，氟硅烷可以选自十七氟癸基三氯硅烷、十七氟癸基三甲氧基硅烷或4-甲基-十三氟癸基三乙氧基硅烷中的至少一种。

步骤二：利用激光雕刻在硅片镀有疏水层的正面上雕刻样品点，且样品点的雕刻深度大于等于疏水层的厚度，具体的，本实施例的样品点成圆形，且样品点的直径为2.6mm，疏水层的厚度为500nm。

优选的，在所有样品点均雕刻完成后，在硅片的背面中心贴铁片，通过铁片与质谱仪器靶槽的磁铁相互吸引更稳固的放置硅靶板，从而可以提高硅片在基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(简称：MALDI-TOF-MS)检测过程的稳定性，具体的，本实施例中采用镀锌铁片。

步骤三：利用酒精对硅片进行清洗。具体的，可以利用酒精对硅片进行超声清洗5-10min；也可以用无尘布利用酒精对硅片进行擦洗，不再累述。

本实施例还提出了一种采用如上所述硅基靶板的生产方法制备得到的硅基靶板，如图1-3 所示。本实施例的硅基靶板，包括靶板本体1，靶板本体1包括硅片2和设置在硅片1正面上的疏水层3，靶板本体1的正面设有样品点4，样品点4的深度大于等于疏水层3的厚度。

进一步，疏水层3采用疏水材料制成，本实施例的疏水层3采用镀在硅片上的氟硅烷制成，氟硅烷通过蒸镀工艺镀在硅片2上。

进一步，样品点4阵列设置在靶板本体正面上，本实施例的靶板本体1上阵列设有6行 8列共48个样品点4。具体的，样品点4为圆柱形凹槽4a，本实施例的圆柱形凹槽的底面设为平面或球面。如图2所示，圆柱形凹槽4a的底面设为球面4b；如图3所示，圆柱形凹槽 4a的底面设为平面3b。具体的，圆柱形凹槽的内径为2-3mm，本实施例的圆柱形凹槽的内径为2.6mm。圆柱形凹槽的深度大于等于疏水层的厚度，如图2所示，圆柱形凹槽的深度等于疏水层3的深度，如图3所示，圆柱形凹槽的深度大于疏水层的深度。

进一步，疏水层3的厚度为100nm-10μm，能够满足束缚样品的要求。

进一步，靶板本体的背面中心贴有镀锌铁片，通过镀锌铁片与质谱仪器靶槽的磁铁相互吸引更稳固的放置硅靶板，从而可以提高硅片在基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(简称：MALDI-TOF-MS)检测过程的稳定性。

本实施例的硅基靶板及其生产方法，在硅片表面镀疏水层后，利用激光雕刻将疏水层去除后形成样品点，从而制备得到硅基靶板；在进行质谱检测时，硅基靶板作为样品与基质共结晶的载体，硅基靶板上的亲疏水处理能够有效束缚样品(蛋白提取液和基质溶液)，并使得它们共结晶更均匀；靶板上样品在激光作用下发生离子化，再经过高压电场加速，进入无场区，最终达到检测器，从而能够满足质谱检测的要求。另外，本发明的硅基靶板的生产方法还具有工艺流程简单，便于实现工业化生产的优点。

具体地，在采用本实施例的硅基靶板进行质谱检测的应用时，具有两种应用方法，分别为：

第一种应用方法：直涂法

如图4所示，该方法中的硅基靶板在质谱检测中的应用方法为：利用接种环挑取单个菌落并均匀涂抹在硅基靶板的样品点内，在室温下待其自然晾干；随后滴加70％甲酸溶液覆盖样品，再滴加饱和基质溶液覆盖样品，自然晾干后进行质谱采谱。具体的，菌落、70％甲酸溶液以及饱和基质溶液之间的容量比为1:1:1，本实施例的菌落、70％甲酸溶液以及饱和基质溶液之间的容量均为1.0μL。

第二种应用方法：提取法

如图5所示，该方法中的硅基靶板在质谱检测中的应用方法为：首先，在离心管内将菌体与无菌水混匀后，加入无水乙醇，振荡混匀后进行第一次离心处理，弃上清液后干燥；其次，在离心管内加入70％甲酸溶液，吹打混匀后室温静置，而后加入乙腈，混匀后进行第二次离心处理，取上清液为样品溶液；最后，取样品溶液至硅基靶板的样品点内，在室温下自然晾干，再滴加饱和基质溶液覆盖样品，自然晾干后进行质谱采谱。

优选的，当菌体为丝状真菌时，在加入70％甲酸溶液的同时，加入与菌体同等体积的玻璃珠，玻璃珠的直径为0.1mm，以充分研磨菌体

具体的，本实施例首先采用1.0μL的无菌接种环挑取5-10mg菌体于容积为1.5mL的离心管中，加入300μL无菌水，将菌体充分混匀，再加入900μL无水乙醇，用涡旋振荡器混匀，而后在12000rpm的条件下离心2分钟，弃上清液后，待其干燥；其次，加入50μ L 70％甲酸，用移液枪吹打混匀，室温放置2分钟，再加入50μL乙腈，充分混匀后，在12000 rpm转速条件下离心2分钟，上清液即为制备好的样品溶液；最后，用微量移液器点1.0μL 样品溶液至硅基靶板的样品孔中，在室温下自然晾干，再用微量移液器滴加1.0μL基质溶液覆盖样品，在室温下自然晾干后进行质谱采谱。

对比实验

利用本实施例的硅基靶板与传统的钢靶进行对比实验，对质谱检测过程中的采空率和平整度进行测量，得到如下结果。

1、采空率

采空是指在质谱仪器状态正常，在进行质谱采集谱图的时候，出现没有质谱峰的情况定义为采空。采空率是指采空的情况占总采集次数的比例。

如图6所示，在利用硅基靶板和钢靶进行质谱检测的参数调整一致的情况下，自动激光采空率统计结果可以得出采空率，硅基靶板的采空率为17.19，钢靶的采空率为20.90，硅基靶板的采空率低于钢靶的采空率，可以说明样品(蛋白提取液和基质溶液)在硅基靶板上的共结晶更均匀，即说明硅靶的结晶均匀情况优于钢靶的结晶均匀情况。

2、平整度

标准差简单理解即是对平均数求标准差，比如一次实验会得到一个平均数，多次实验得到多个平均数，标准误差即是对这些平均数求标准差。其实际意义即是用来表示样本均值与总体均值的离散程度，标准误越小，样本均值和总体均值差距则越小，反之越大。标准误用于预测样本数据准确性，标准误越小，样本均值和总体均值差距越小，样本数据越能代表总体数据。

通过对比表1、表2、表3其中N表示特征峰的数量，根据大肠杆菌三个特征峰4365、6255、9535统计量，它们均值标准差项中，硅基靶板均小于钢靶，说明样品点平整度之间差异为：硅基靶板<钢靶，也即硅基靶板平整度更均一。片间质量差异为：硅基靶板<钢靶，不同硅基靶板之间的差异性小于钢靶。也即，本实施例的硅基靶板可以达到纳米级平整度，使得电场更均一，测试出来质荷比(M/Z)准确度更高。

表1大肠杆菌4365特征峰统计量

表2大肠杆菌6255特征峰统计量

表3大肠杆菌9535特征峰统计量

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。