一种EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法

技术领域

本发明涉及一种EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法。

背景技术

肺癌是世界上最常见的致死性癌症之一，其发病率和死亡率不断上升，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。其中，非小细胞肺癌(NSCLC)每年约占新诊断肺癌病例的80％，且大多数诊断时已为晚期。过去10年来，化疗被视为晚期NSCLC患者的一线治疗，然而，其高毒性和不良副作用导致临床结果较差，患者平均总生存期(OS)为8-10个月，5年生存率仅为15％。近年来，靶向治疗和个性化药物在NSCLC治疗领域取得重大进展。

表皮生长因子受体(EGFR)基因位于人类7号染色体的短臂上，包括28个外显子，是ErbB受体TK家族的成员。EGFR过度表达可能导致细胞增殖，促进血管生成，肿瘤侵袭和转移，并抑制细胞凋亡，在NSCLC的发展和进展中发挥重要作用，研究表明EGFR在肿瘤组织，尤其是NSCLC中有独特的表达，是EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)靶向治疗的重要生物标记物，多项临床试验已证实，EGFR基因突变的晚期NSCLC患者能从EGFR-TKIs治疗中显著获益。

21号外显子L858R是与EGFR TKI敏感性相关的常见致癌突变，占所有突变的41％，据报道，L858R突变蛋白的激酶活性约为野生型激酶活性的20倍，肺癌细胞中EGFR-L858R突变蛋白的表达增加了癌细胞的侵袭性。FDA/NMPA批准奥希替尼/达可替尼用于携带L858R突变的转移性NSCLC患者一线治疗，因此通过检测EGFR基因L858R突变来准确地预测靶向药物治疗NSCLC患者是临床实践中切实可行的实验诊断方法。

目前常用的基因突变检测方法主要是测序法和PCR法。测序法成本高，操作复杂，检测时间较长，假阴性率较高；PCR法又包括实时荧光定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)和等位基因特异性PCR(AS-PCR/ARMS-PCR)。qPCR灵敏度约为5％，对于血液样本及低突变丰度的肿瘤组织样本存在灵敏度不够的问题；dPCR灵敏度高，但操作成本高，检测通量低；AS-PCR灵敏度约1％，对于如血浆或者血液中的循环肿瘤细胞等肿瘤DNA含量低于1％的样本，AS-PCR法灵敏度不足以进行检测。因此，对于血液样本及低含量样本中检测突变，需要一种灵敏度更高、操作简便、成本更低的检测方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明在于提供一种检测EGFR基因L858R低频突变(<1％)的核苷酸组合检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种检测EGFR基因L858R突变的引物，引物序列如下所示：

正向引物：5’-CAGGAACGTACTGGTGAA-3’

反向引物：5’-GCAGCCTGGTCCCTGGTGTC-3’。

一种检测EGFR基因L858R突变的特异性修饰探针，探针序列如下所示：FAM-5’-GGC+GGGCC-BHQ1；其中，FAM代表5,6-FAM荧光修饰基团，BHQ1代表淬灭修饰基团，“+”代表锁核酸修饰碱基。

一种检测EGFR基因L858R突变的核苷酸结合子(Binder)，核苷酸结合子序列如下所示：5’-ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT-3’-ddC；其中，3’ddC代表双脱氧胞苷修饰。

一种检测EGFR基因L858R突变的反应体系，包括：PCR酶反应液，L858R正向引物、L858R反向引物，L858R探针，L858R结合子，纯化水，待测模板；

L858R正向引物：5’-CAGGAACGTACTGGTGAA-3’；

L858R反向引物：5’-GCAGCCTGGTCCCTGGTGTC-3’；

L858R探针：FAM-5’-GGC+GGGCC-3’-BHQ1；

核苷酸结合子：5’-ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT-3’-ddC。

作为优选，L858R正向引物的反应浓度100-500nM；L858R反向引物的反应浓度100-500nM。

作为优选，L858R探针的反应浓度为100-500nM；L858R结合子的反应浓度为1000-5000nM。

作为优选，待测样本DNA的反应浓度为20-50ng。

一种EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法，针对L858R突变位点，将修饰性探针以及修饰性结合子这两种寡核苷酸在同一反应中进行组合检测。

作为优选，首先利用特异性正、反向引物对含有L858R突变的区域进行扩增富集；其次覆盖L858R突变位点的修饰性探针和Binder通过竞争识别突变位点。

作为优选，所述方法包括以下步骤：

1)提取肺癌组织或血浆样本中的DNA；

2)配制用于检测L858R突变的实时荧光PCR反应体系，并分装到PCR反应管中；

3)在实时荧光PCR仪上进行扩增，程序为：预变性95℃5分钟，1个循环；扩增95℃30秒，58℃40秒，40个循环；保持4℃；根据实时荧光PCR仪显示的Ct值判断检测突变的结果。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明采用了改进的寡核苷酸修饰的方法和组合使用寡核苷酸的技术，可以实现血液样本或组织样本中人类EGFR基因L858R突变丰度低于1％的基因突变的快速检测，其优势在于：

(1)灵敏度高，检测下限可达到0.1％；

(2)特异性高，结果为单一阳性信号，易判读；

(3)反应时间短约1小时，操作简单；

(4)基于实时荧光PCR仪，通量大，成本较测序法大大降低，适合临床样本检测；

(5)适用的样本类型广，不局限于高突变的丰度的组织样本或FFPE样本，可拓宽至血液样本。

附图说明

图1为本发明寡核苷酸修饰结构示意图；

图2为本发明的原理结构示意图；

图3为本发明检测不同突变丰度的EGFR基因L858R突变国家参考品结果；

图4为本发明检测L858R质粒结果；

图5为使用单一修饰性探针检测L858R质粒结果；

图6为使用单一结合子检测L858R质粒结果；

图7为使用对照方法A的检测结果；

图8为使用对照方法B的检测结果；

图9为本发明检测L858R质粒结果。

具体实施方式

参照附图对本发明做进一步说明。

如图1～9所示，本发明提供一种检测EGFR基因L858R突变的引物，特异性引物包括如下序列：

正向引物：5’-CAGGAACGTACTGGTGAA-3’(记为SEQ ID NO 1)，

反向引物：5’-GCAGCCTGGTCCCTGGTGTC-3’(记为SEQ ID NO 2)。

本发明还提供一种检测EGFR基因L858R突变的特异性修饰探针和提高扩增特异性的修饰性核苷酸结合子(Binder)；

探针序列如下所述：FAM-5’-GGC+GGGCC-3’-BHQ1；其中FAM代表5,6-FAM荧光修饰基团，BHQ1代表淬灭修饰基团，“+”代表锁核酸修饰碱基。

其中，序列GGC记为SEQ ID NO 3，序列GGGCC记为SEQ ID NO 4。

核苷酸结合子序列如下所述：5’-ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT-3’-ddC；其中，3’ddC代表双脱氧胞苷修饰。其中，序列

5’-ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT-3’记为SEQ ID NO 5。

其中，特异性探针检测L858R突变，其5’末端用5,6-FAM荧光基团修饰，3’末端用BHQ1淬灭基团修饰。探针序列覆盖突变位点，同时，对L858R突变位点进行锁核酸(LNA)特殊修饰，其余碱基和目标序列互补。LNA是一种经过修饰的核酸类似物，它能提高核苷酸链的Tm值，且增大核苷酸与DNA的结合力，从而提高对单碱基错配的敏感度，使探针与L858R突变序列结合，被聚合酶水解发出荧光信号，指示突变的存在；Binder序列原则上与野生型EGFR基因序列完全互补，其3’末端用ddC基团修饰来阻止其自身被DNA聚合酶延伸，Binder通过与野生型的强结合力而抑制野生型模板的扩增，从而提高对错配序列(即：L858R突变序列)的特异性扩增。

本发明还提供一种用于检测EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测法，包括：针对L858R突变位点，将修饰性探针以及Binder这两种寡核苷酸在同一反应中进行组合检测。

首先利用特异性正、反向引物对含有L858R突变的区域进行扩增富集；其次覆盖L858R突变位点的修饰性探针和Binder通过竞争识别突变位点：本发明设计的特异性修饰探针和Binder的TM值、序列长度、修饰基团位置和数量各不相同，导致探针与L858R突变序列结合，Binder与L858R野生型序列结合，在每一循环中均能区分突变型和野生型模板，随着指数扩增阶段的进行，该差异不断累积，最终实现特异性检测突变模板。

本发明提供一种检测EGFR基因L858R突变的反应体系，包括：PCR酶反应液，L858R正向、反向引物，L858R探针，L858R结合子，纯化水，待测模板，扩增体系如下表1所示：

表1

本发明提供一种检测EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法，包括以下步骤：(1)提取肺癌组织或血浆样本中的DNA；(2)按总体积20μL配制用于检测L858R突变的实时荧光PCR反应体系，并分装到PCR反应管中；(3)在实时荧光PCR仪上进行扩增，程序为：预变性95℃5分钟，1个循环；扩增95℃30秒，58℃40秒(收集一次FAM荧光)，40个循环；保持4℃。最后根据实时荧光PCR仪显示的Ct值判断检测突变的结果。其中，FAM信号指示L858R突变，即有FAM信号的为L858R突变阳性，无信号的为L858R突变阴性(野生型)。

本发明采用了改进的寡核苷酸修饰的方法和组合使用寡核苷酸的技术，可以实现血液样本或组织样本中人类EGFR基因L858R突变丰度低于1％的基因突变的快速检测。该检测方法的优势在于：(1)灵敏度高，检测下限可达到0.1％；(2)特异性高，结果为单一阳性信号，易判读；(3)反应时间短约1小时，操作简单；(4)基于实时荧光PCR仪，通量大，成本较测序法大大降低，适合临床样本检测；(5)适用的样本类型广，不局限于高突变的丰度的组织样本或FFPE样本，可拓宽至血液样本。

下面将结合具体实施例进一步说明本发明的有益效果。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：灵敏度和特异性检测

本实施例提供了一种检测人类EGFR基因L858R不同突变丰度的实验方法，包括：所用寡核苷酸的序列、荧光定量PCR反应体系、扩增程序等。所检测样本为提取自福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织的DNA样本，由“第二代EGFR/ALK/MET基因突变检测国家参考品”中EGFR-L858R阳性参考品与阴性参考品(购自中国食品药品检定研究院)分别按一定比例混合而成，样本突变率分别为14.8％、5.2％、2％、0.09％，其中阴性参考品作为对照组。所使用寡核苷酸序列如表2：

表2

按下表3在1.5mL离心管内配制反应体系，分装18μL至PCR反应管中，最终加入上述不同突变率的L858R突变样本及对照阴性样本，反应体系如表3：

表3

样本加入PCR反应管后，将反应管置于荧光定量PCR仪中进行扩增，扩增程序如表4：

表4

结果见图3。在对L858R突变的国家参考品进行检测时，依照本发明实施例的检测结果，阳性参考品14.8％、5.2％、2％、0.09％均有荧光信号，最低检测0.09％突变；阴性参考品无信号，判读为阴性，均符合预期。表明本发明实施例的寡核苷酸组合检测EGFR基因L858R突变的特异性高，灵敏度可达0.1％。

实施例2：本申请寡核苷酸组合检测效果测试

本实施例选用本发明所述的修饰性探针与结合子组合检测，对比单一使用修饰性探针以及单一使用结合子检测人类EGFR基因L858R突变的结果。所检测样本为L858R野生型、突变型质粒(合成于华大基因)混合而成的5％L858R突变混合液，以及L858R纯野生型质粒作为阴性对照。所用核苷酸序列、反应体系和扩增程序见表2、3、4。

结果见图4-图6，图5显示使用单一修饰性探针时检测特异性不高，阳性样本和阴性对照样本均有信号；图6显示使用单一结合子时由于体系内无探针而无荧光信号；而图4为本发明实施例的组合使用修饰性探针与结合子的检测结果，5％突变有信号，阴性对照无信号，能明显区分阳性、阴性结果，表明本申请中寡核苷酸的组合检测效果更好。

对比例：

本发明人在研究过程中，针对本方法检测L858R突变时选用其他2种检测方法A、B进行对比，所检测样本为L858R野生型、突变型质粒(合成于华大基因)混合而成的5％和1％L858R突变混合液，以及L858R纯野生型质粒作为阴性对照，反应程序同表4。

对比例A的引物和探针序列如下表5所示：

表5

其中，序列CATGTCAAGATCACAGATTTTAGGCG记为SEQ ID NO 6；TGACCTAAAGCCACCTCCTTAC记为SEQ ID NO 7；CTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGC记为SEQID NO 8。

对比例A的反应体系如下表6所示：

表6

对比例B的引物和探针序列如下表7所示：

表7

其中，序列CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTG记为SEQ ID NO 9；GCTGACCTAAAGCCACCTCCTTAC记为SEQ ID NO 10；TGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCA记为SEQ ID NO 11。GATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGG记为SEQ ID NO 12。

对比例B的反应体系如下表8所示：

表8

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结果见图7～图9，其中图7为方法A的检测结果，阳、阴性样本均有信号，无法区分1％及以下突变频率的样本，特异性极差；图8为方法B的检测结果，发现该法中1％突变的样本阳性信号极弱，且检测阳性样本的耗时更长，无法检测更低频突变的样本；图9为本专利方法的结果，阳性样本5％、1％均有显著扩增信号，且阴性样本无信号。说明，本申请中突变检测方法的有效性更优。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。