杀藻申氏杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及杀藻申氏杆菌及其应用。

背景技术

根瘤菌科(Rhizobiaceae)的细菌在农业耕地、湖泊、森林等多种生态环境中广泛分布，能够有效促进环境中元素循环，特别是部分菌株的固氮功能，对农作物有效利用氮源做出了不可替代的贡献。申氏杆菌属(Shinella)是根瘤菌目(Rhizobiales)的一大分支。申氏杆菌属这一属名是在2006年由Dong-Shan An等研究人员提议成立的(An,D.S.,Im,W.T.,Yang,H.C.&Lee,S.T.(2006).Shinella granuli gen.nov.,sp.nov.,and proposal ofthe reclassification of Zoogloea ramigera ATCC 19623as Shinella zoogloeoidessp.nov.Int J Syst Evol Microbiol 56,443–448.)，以菌株谷粒申氏杆菌(Shinellagranuli)ATCC 19623为模式菌。此后，申氏杆菌属的描述又于2009年被修订完善。主要补充了形态学、生理生化特征和细胞脂肪酸的组成方面的数据(Matsui,T.,Shinzato,N.,Tamaki,H.,Muramatsu,M.&Hanada,S.(2009).Shinella yambaruensis sp.nov.,a3-methyl-sulfolane-assimilating bacterium isolated from soil.Int J Syst EvolMicrobiol 59,536–539.)。目前，申氏杆菌属涵盖了从多种微生态环境分离得到的8个种的菌株(https://lpsn.dsmz.de/genus/Shinella)。申氏杆菌属的菌株多数是从有机物丰富的环境中分离得到的，环境压力对微生物菌种表型进化的影响使得这类菌株形成了能够适应多生态环境的特性。因此，申氏杆菌属的菌株对有机物的降解能力及其应用也备受关注。比如：对4-氨基苯磺酸盐的降解(Biala,S.,Chadha,P.,&Saini,H.S.(2014).Biodegradation of 4-aminobenzenesulfonate by indigenous isolate Shinellayambaruensis SA1 and its validation by genotoxic analysis.Biotechnol.Bioprocess.Eng.19,1034–1041.)、对氯苯酞的降解(Liang,B.,Wang,G.,Zhao,Y.,Chen,K.,Li,S.,&Jiang,J.(2011).Facilitation of bacterial adaptation to chlorothalonil-contaminated sites by horizontal transfer of the chlorothalonil hydrolyticdehalogenase gene.Appl.Environ.Microbiol.77,4268–4272.)、对苯酚的降解(SepehrS.,Shahnavaz B.,Asoodeh A.&Karrabi M(2019).Biodegradation of phenol by cold-tolerant bacteria isolated from alpine soils of Binaloud Mountains in Iran.JEnviron Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng 54,367-379.)、对诺尼古丁(QiuJ.,Li N.,Lu Z.,Yang Y.,Ma Y.,Niu L.,He J.&Liu W(2016).Conversion ofnornicotine to 6-hydroxy-nornicotine and 6-hydroxy-myosmine by Shinellasp.strain HZN7.Appl Microbiol Biotechnol 100,10019-10029.)的降解以及对吡啶的降解(Bai,Y.,Sun,Q.,Zhao,C.,Wen,D.&Tang,X.(2009).Aerobic degradation ofpyridine by a new bacterial strain,Shinella zoogloeoides BC026.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36,1391–1400.)。

随着气候变暖和淡水生态系统富营养化程度日趋加重，蓝藻过度繁殖导致蓝藻水华现象在全球范围频繁爆发，蓝藻水华已严重影响人类的生产生活，甚至对人类生命造成危害(王俊,张义生.化学污染物与生态效应.北京,中国环境科学出版社,1993；Perron MC,Qiu BS,Boucher N,et al..Use of chlorophyll a fluorescence to detect theeffect of microcystins on photosynthesis and photosystem II energy fluxes ofgreen algae.Toxicon,2012,59:567-577)。我国的内陆湖泊近年来也成了蓝藻水华爆发的重灾区。富营养化及蓝藻水华治理刻不容缓(杨柳燕,肖琳.湖泊蓝藻水华爆发、危害与控制.北京,科学出版社,2011)。虽然物理和化学方法在控制蓝藻水华危害方面发挥着重要作用，但这些方法多数具有高资金投入、防治期短、潜在的二次污染风险等缺点，难以彻底解决水华问题。我们希望能够借助于生物手段有效控制有害藻类生物量，从而达到防治目的。生物防治技术具有高效、特异性强和环境友好等优点(秦伯强,王小冬,汤祥明,等.太湖富营养化与蓝藻水华引起的饮用水危机——原因与对策.地球科学进展,2007,22(9):896-906；史顺玉.溶藻细菌对藻类的生理生态效应及作用机理研究.中国科学院武汉水生生物研究所,2006)。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有溶藻功能的申氏杆菌属新物种。

第一方面，本发明要求保护一申氏杆菌属新物种。

本发明要求保护的申氏杆菌属新物种具体为杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.25922。

所述杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203为革兰氏阴性细菌，好氧，在30℃下，R2A培养基上培养72小时后，可形成湿润，光滑和奶油色至浅黄色菌落；细胞呈短杆状，菌株的生长温度、盐耐受以及酸碱耐受范围分别是15-32℃、0-3％NaCl和pH 6.0-8.0，最适生长条件是30℃、0-1％NaCl、pH 7；菌株氧化酶检测为阳性，硝酸盐还原阴性；能利用麦芽糖、L-鼠李糖、蔗糖和纤维二糖为唯一碳源；菌株的主要脂肪酸是C

第二方面，本发明要求保护一种培养物。

本发明所要求保护的培养物为前文第一方面中所述杀藻申氏杆菌(Shinellaalgicida)SD203的培养物，具体是将所述杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203在细菌培养基中培养得到的物质。

上述培养物中，所述物质包括所述杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203(菌体自身)和所述杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203的代谢物。

上述培养物中，所述细菌培养基可为固体培养基或液体培养基。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体培养基的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

在本发明的具体实施方式中，所述细菌培养基具体为R2A培养基。

第三方面，本发明要求保护一种代谢物。

本发明要求保护的代谢物为前文第一方面所述的杀藻申氏杆菌(Shinellaalgicida)SD203的代谢物。

术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。

第四方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明要求保护的菌剂含有前文第一方面中所述的杀藻申氏杆菌(Shinellaalgicida)SD203、前文第二方面中所述的培养物和/或前文第三方面中所述的代谢物。

所述菌剂为溶藻的菌剂，可用于治理水华。

上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

第五方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的杀藻申氏杆菌(Shinellaalgicida)SD203或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂在如下任一中的应用：

(A1)溶藻；

(A2)制备用于溶藻的产品；

(A3)治理水华；

(A4)制备用于治理水华的产品；

(A5)土壤改良；

(A6)菌肥制剂生产。

第六方面，本发明要求保护一种用于溶藻的产品。

本发明要求保护的用于溶藻的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第七方面，本发明要求保护一种用于治理水华的产品。

本发明要求保护的用于治理水华的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第八方面，本发明要求保护一种溶藻的方法。

本发明要求保护的溶藻的方法，可包括如下步骤：用前文第一方面中所述的杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂对待处理的藻样本进行处理。

第九方面，本发明要求保护一种治理水华的方法。

本发明要求保护的治理水华的方法，可包括如下步骤：用前文第一方面中所述的杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂对待治理的水华水体进行处理。

在上述各方面中，所述藻可为蓝藻；所述水华可为蓝藻水华。

在本发明的具体实施方式中，所述蓝藻为水华鱼腥藻。

第十方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的杀藻申氏杆菌(Shinellaalgicida)SD203在制备前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂中的应用。

实验证明，本发明菌株SD203与现已被科学研究的申氏菌属的有效描述菌种有部分明显的差异特征，包括表型、生理生化及细胞化学组分等方面。同时基于基因水平的系统进化分析进一步说明了菌株SD203能区别于现有申氏菌属的各有效种，充分证明了本发明菌株SD203代表了申氏菌属的一个新物种，命名为杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)。同时发现菌株SD203能够裂解蓝藻细胞，证明了本发明菌株生物防治蓝藻生长的能力，在富营养化污水(蓝藻水华)治理方面具有广泛的应用前景。可用于污水处理、土壤改良、菌肥制剂生产等方面。

保藏说明

分类命名：杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)；

参椐的生物材料：SD203；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：CGMCC；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2022年10月17日；

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25922。

附图说明

图1为菌株SD203在R2A培养基上30℃培养72h的细胞透射电镜照片。

图2为菌株SD203的极性脂成分检测结果。

图3为菌株SD203对水华鱼腥藻FACHB-245的溶藻活性图示。a,显示菌株SD203周围的溶藻圈；b,显示菌株SD203培养液对藻细胞的裂解情况：绿色为正常藻细胞；黄色是被裂解的藻细胞。

图4为基于菌株SD203和申氏杆菌属所有有效描述菌种的16S rRNA基因序列构建系统发育树。系统发育树以Rhizobium smilacinae DSM 100675

图5为基于申氏杆属有效描述菌种及相关菌种核心基因构建的系统进化树，显示菌株SD203的分类学地位。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203的分离与鉴定

一、菌株SD203的分离筛选

本发明菌株SD203分离自四川简阳三岔湖湖水样品。菌种分离使用R2A培养基作为分离培养基，培养基成分为：葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、

分离筛选方法：从四川简阳三岔湖湖心取2L表层水，用孔径为3μm的无菌滤膜过滤，除去藻类等大颗粒杂质，收集滤液于无菌容器中；接着用孔径为0.22μm的无菌滤膜将上述滤液过滤，将细菌富集于滤膜上；滤膜剪碎，浸没于20mL的无菌生理盐水中，振荡30min，制备菌悬液。取上一步的菌悬液稀释至10

二、菌株SD203的鉴定

菌株SD203在30℃条件下，生长于R2A培养基(美国BD培养基)上，对这株菌进行形态学、生理生化、细胞化学及基因水平的研究，其他特殊情况将予以说明。

1、菌株SD203的细胞形态观察和生理生化特征检测

菌株SD203的生长温度检测范围为4、10、15、28、30、32、37、40和45℃；生长盐浓度(NaCl)检测范围为0-15％(0-15g/100ml)的12个(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15)浓度梯度；生长pH检测范围为pH4-11之间的8个(4、5、6、7、8、9、10、11)梯度。菌株的生理生化特征使用API 50CH、API ZYM，以及BIOLOG GEN III碳源等检测试剂盒检测。其他菌株生理特征，包括革兰氏染色属性、氧需求、接触酶活性、氧化酶活性、明胶水解活性，淀粉水解活性和纤维素水解活性，主要参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著出版发行项:北京:科学出版社,2001.2)进行。

鉴定结果显示，菌株SD203为革兰氏染色阴性细菌，好氧。菌株在30℃下，R2A培养基上培养72小时后，可形成湿润，光滑和奶油色至浅黄色菌落；细胞呈短杆状，如图1。菌株的生长温度、盐耐受以及酸碱耐受范围是15-32℃、0-3％NaCl和pH6.0-8.0，最适生长条件是30℃、0-1％NaCl、pH 7。菌株SD203氧化酶检测为阳性，硝酸盐还原阴性；能利用麦芽糖、L-鼠李糖、蔗糖和纤维二糖为唯一碳源。菌株SD203与近缘菌种代表菌株Shinella curvataJCM 31239,Shinella kummerowiae JCM 14778,Shinella granuli JCM 13254以及Shinella zoogloeoides DSM 287的表型特征差异见表1。

表1、菌株SD203与申氏杆菌属近缘对照菌株表型特征差异表

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注：+，表示为阳性；-，表示为阴性；w，为弱阳性。

由表1所示结果可见，本发明菌株SD203与已发表的申氏杆菌的近缘菌株在生长条件、生理生化特征等部分表型特征上存在明显差异。

2、菌株SD203的细胞化学组成成分检测

通过GC气相色谱、HPLC液相色谱和TLC薄层色谱检测菌株SD203的脂肪酸、醌类型、极性脂等细胞化学组分(Sasser M.Identification of bacteria by gasghromatography of cellular fatty acids,MIDI Technical Note 101.Newark,DE:MIDIinc；1990.Minnikin DE,O’Donnell AG,Goodfellow M,Alderson G,Athalye M et al.Anintegrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones andpolar lipids.J Microbiol Methods 1984；2:233–241.)。菌株SD203的脂肪酸成分见表2,结果显示菌株SD203的主要脂肪酸是C

表2、菌株SD203的脂肪酸成分

3、菌株SD203溶藻活性检测

(1)琼脂块法初筛溶藻菌

从中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库购得水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae FACHB-245)藻株作为检定藻。采用点接法将菌株SD203接种于R2A培养基上，30℃下培养7d后，用无菌打孔器将长有菌落的琼脂块取出置于藻平板上(藻培养基：NaNO

(2)叶绿素a法复筛溶藻菌

将菌株SD203进行活化并制备斜面菌种，将生长良好的斜面菌种接入种子培养基(R2A液体培养基)中(500ml三角瓶培养基装量为200ml)，30℃、180r/min摇床培养48h左右，再分别接入R2A液体培养基(500ml三角瓶培养基装量为200ml)进行扩大培养，接种量为10％(v/v)左右，接完种后置于30℃、180r/min摇床培养6d，再用无菌离心管对发酵液进行离心，在细胞浓度为5×10

其中，实验组为接入菌株SD203和水华鱼腥藻FACHB-245的培养液；对照组为不接入菌株SD203而只接种了水华鱼腥藻FACHB-245的培养液。

实验共设置三次重复，结果以均值±标准差的形式表示。

代入公式计算后，得到菌株SD203对水华鱼腥藻FACHB-245藻株的溶藻率为83.35±0.29％。确证菌株SD203具有良好的溶藻活性。

4、菌株系统进化地位的确定

提取菌株SD203的基因组DNA进行测序，并将其中的16S rRNA基因序列(SEQ IDNo.1)在国际权威细菌分类学分析数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中进行在线比对(Kim OS,Cho YJ,Lee K,et al.2012,Introducing EzTaxon-e:a prokaryotic16S rRNAgene sequence database with phylotypes that represent uncultured species.IntJ Syst Evol Microbiol,62:716-721.)。结果显示本发明菌株SD203与申氏杆菌属的菌种相似性最高。本发明菌株SD203的16S rRNA基因序列与已知菌种的最高相似性分别是：Shinella curvata JCM 31239

为进一步明确菌株的系统进化地位，在EZbiocloud上比较并计算菌株SD203的全基因组序列与近缘对照菌的全基因组序列的平均核苷酸相似性(ANI值)(Yoon SH,Ha SM,Lim J,Kwon S,Chun J.A large-scale evaluation of algorithms to calculateaverage nucleotide identity.Antonie van Leeuwenhoek 2017；110:1281–1286.)。全基因组序列比较分析显示，菌株SD203与Shinella curvata JCM 31239、Shinellakummerowiae JCM 14778、Shinella granuli JCM 13254、以及Shinella zoogloeoidesDSM 287的平均核苷酸相似性(ANI)分别为89.0％、85.4％、85.4％、85.2％。这些值均远低于95％这一区分原核微生物基因种的ANI阈值。在基于全基因组的核心基因的系统进化树上，菌株SD203在申氏杆菌属内占据了一个种的分类地位(图5)。

这些结果表明，本发明菌株SD203是申氏杆菌属的一个新发现的基因种。

综上多相分类学研究数据分析，本发明菌株SD203与现已被科学研究的申氏菌属的有效描述菌种有部分明显的差异特征，包括表型、生理生化及细胞化学组分等方面。同时基于基因水平的系统进化分析进一步说明了菌株SD203能区别于现有申氏菌属的各有效种，充分证明了本发明菌株SD203代表了申氏菌属的一个新物种，命名为杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)。同时发现菌株SD203能够裂解蓝藻细胞，证明了本发明菌株生物防治蓝藻生长的能力，在富营养化污水治理方面具有广泛的应用前景。可用于污水处理、土壤改良、菌肥制剂生产等方面。

杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203于2022年10月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.25922。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。