橘小实蝇生殖发育相关miR-2b-2-5p及其应用

技术领域

本发明属于害虫绿色防治和基因工程技术领域，具体涉及一种橘小实蝇生殖发育相关的microRNA-miR-2b-2-5p及其在橘小实蝇防治中的应用。

背景技术

橘小实蝇又名东方果实蝇，其幼虫也叫果蛆，隶属双翅目，实蝇科，果实蝇属，是一种危害性极强的世界性入侵害虫，严重危害柑橘、香蕉、番石榴、辣椒和瓜类等250余种水果和蔬菜。橘小实蝇成虫具有很强的繁殖能力，产卵量大且后代存活率高，生育周期短，世代重叠，防控难度极大。主要以幼虫危害果实，雌成虫产卵于果实内部，幼虫孵化后取食果肉获取养分，引起果实腐烂、落果，给产业带来严重的经济损失。目前主要在我国台湾、广东、广西、湖南、云南和四川等地有分布，且有不断北移扩散的趋势。因此橘小实蝇的防控仍是我们需要面对的重要问题。

雌虫的生殖发育对于种群的繁衍至关重要，为害虫的综合防治提供重要的靶标。在过去十几年时间里，雌性昆虫在基因组学、生物信息学和分子生物学方面关于繁殖机制的研究取得了重大进展。雌性昆虫的生殖发育主要包括卵巢发育、生殖行为和繁殖力。昆虫的生殖发育受阻如卵巢形态异常、产卵量下降，、繁殖力降低等都会造成种群数量减少，种群繁衍受阻。因此，研究昆虫的生殖发育能够为害虫的绿色防控提供有力的理论基础。

能量代谢是生命的基础，在昆虫中，能量代谢的中心是脂肪体，被认为类似于哺乳动物的肝脏，是一种多功能组织，作用于整合信号、传递能量、控制蜕皮和变态、合成激素、脂质和碳水化合物等。脂肪体是昆虫的“动力工厂”，能够储备脂质和糖原等基础能源，为昆虫的滞育、飞行和发育等生理活动提供能量。此外，昆虫脂肪体还能合成大量蛋白，比如储存蛋白、脂蛋白和卵子发生所必需的卵黄蛋白原Vitellogenin(Vg)等。脂质、蛋白质和碳水化合物是生命的三大能量物质，然而脂质在昆虫中扮演着更为重要的角色，因为脂质不仅用于生长和发育，还用于飞行、迁徙、性信息素合成和分泌各种防御性物质。

miRNA最早是1993年在秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans中被发现的，至今已在271个物种中发现了48万多种miRNAs。miRNAs与靶基因的关系是错综复杂的，一个miRNA可以调控多个靶基因，一个靶基因也可以被多个 miRNAs调控。因此，miRNAs参与调控众多生理活动，如蜕皮变态、生殖、代谢、免疫和抗药性等。

mir-2是果蝇中最大的miRNA家族，也是最早发现的家族之一，在黑腹果蝇基因组中有8个成员(mir-2a-1、mir-2a-2、mir-2b-1、mir-2b-2、mir-2c、mir-13a、 mir-13b-1和mir-13b-2)。mir-2在果蝇、家蚕的成虫头部和线虫的神经元等高表达，因此在神经元发育和神经调节等方面发挥重要的作用(Marco et al 2012)。近年来关于mir-2家族在其他昆虫中的功能研究也有广泛报道，例如在德国小蠊 (Blattella germanica)中，miR-2、miR-13a和miR-13b参与调控保幼激素(JH) 依赖性转录因子Kr-h1的表达，在若虫最后一个龄期抑制Kr-h1以确保完成若虫向成虫的变态(Lozano et al 2015)。在埃及伊蚊中miR-2b参与调控基孔肯亚病毒(Chikungunya virus,CHIKV)的复制，在感染CHIKV后miR-2b表达量上升，而抑制miR-2b导致CHIKV复制增加，表明miR-2b能够抑制病毒的复制(Dubey et al2017)。发明人所在的课题组前期通过小RNA高通量测序筛选得到橘小实蝇生殖组织中差异表达miR-2b-2-5p，是mir-2家族中的一员，为橘小实蝇中首次发现，其功能尚不明确。据此，发明人深入研究miR-2b-2-5p在橘小实蝇能量代谢和生殖发育中的功能，包括其对能量代谢、卵巢发育、产卵量等的影响。

发明内容

针对橘小实蝇绿色防控的问题，本发明提供了橘小实蝇生殖相关的 miR-2b-2-5p及其应用，利用miR-2b-2-5p特异性抑制剂或类似物可抑制卵巢发育，显著降低单雌日均产卵量及总产卵量，影响繁殖力，从而有利于对橘小实蝇的绿色防控。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

橘小实蝇生殖发育相关miR-2b-2-5p成熟体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

miR-2b-2-5p在橘小实蝇防治中的应用：通过miR-2b-2-5p的抑制剂或类似物调控miR-2b-2-5p表达，从而影响橘小实蝇雌虫的生殖发育，降低繁殖力。

进一步地，miR-2b-2-5p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； miR-2b-2-5p类似物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示。

一种绿色防治橘小实蝇的化合物，包括miR-2b-2-5p的抑制剂(核苷酸序列如SEQID NO.2所示)或类似物(核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明是国内外首次公开橘小实蝇miR-2b-2-5p的成熟体系列，并发现 miR-2b-2-5p调控橘小实蝇能量代谢和生殖发育。实验结果表明，利用 miR-2b-2-5p特异性抑制剂或类似物，与对照组相比，卵巢形态出现明显的发育迟缓，单雌产卵量及产卵总量显著降低。因此，本发明提出可通过调控 miR-2b-2-5p在橘小实蝇中的表达来影响橘小实蝇的正常生殖发育，降低繁殖力，从而有利于对橘小实蝇的绿色防控。

附图说明

图1为橘小实蝇miR-2b-2-5p前体发夹结构。

图2为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p抑制剂后整虫糖原和甘油三酯含量。Ant-NC表示抑制剂阴性对照，Ant-2b-2表示miR-2b-2-5p抑制剂， Glycogen表示糖原，TAG表示甘油三酯。*代表在P<0.05水平上有显著性差异， **代表在P<0.01水平上有显著性差异。

图3为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p抑制剂后脂肪体尼罗红染色结果。Ant-NC表示抑制剂阴性对照，Ant-2b-2表示miR-2b-2-5p抑制剂。

图4为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p抑制剂后第7、10、13日龄的卵巢形态图。A为正常发育情况下五个发育时期的卵巢形态，比例尺为200μm，Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ：相应卵巢形态划分为Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ五个等级；B为注射miR-2b-2-5p 抑制剂后橘小实蝇卵巢形态结果，对照组注射等量抑制剂阴性对照；7/10/13d：羽化后第7/10/13天；C为注射miR-2b-2-5p抑制剂后雌虫卵巢形态所属等级统计结果，扇形面积代表相应等级卵巢形态的雌虫占总数的比例(n＝20)， Antagomir-NC表示抑制剂阴性对照，Antagomir-2b-2表示miR-2b-2-5p抑制剂。

图5为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p抑制剂后日均产卵量(*代表在P<0.05水平上有显著性差异，**代表在P<0.01水平上有显著性差异)。

图6为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p抑制剂12d后对照组和处理组的总产卵量。

图7为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p类似物后整虫糖原和甘油三酯含量。mimics-NC表示miR-2b-2-5p类似物阴性对照，mimics-2b-2表示 miR-2b-2-5p类似物。

图8为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p类似物后脂肪体尼罗红染色结果。

图9为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p类似物后第7、10、13日龄的卵巢形态图(A为正常发育情况下五个发育时期的卵巢形态，比例尺为200μm，Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ：相应卵巢形态划分为Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ五个等级；B为注射miR-2b-2-5p 类似物后橘小实蝇卵巢形态结果，对照组注射等量类似物阴性对照；7/10/13d：羽化后第7/10/13天；C为注射miR-2b-2-5p类似物后雌虫卵巢形态所属等级统计结果，扇形面积代表相应等级卵巢形态的雌虫占总数的比例(n＝20))。

图10为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p类似物12d后对照组和处理组的日均产卵量比较。

图11为橘小实蝇羽化后雌成虫注射miR-2b-2-5p类似物12d后对照组和处理组的总产卵量(交配后15天)比较。

具体实施方式

本发明中所用术语miR-2b-2-5p是MicroRNA中的一种，MicroRNA(miRNA) 是一类广泛存在于真核生物中的小分子非编码RNA，长约22nt，主要在转录后水平参与基因表达调控。在昆虫中，miRNA的种子序列起到翻译抑制或者降解 mRNA的作用，miRNA参与了基因转录后调控过程中几乎所有的生物学过程，例如生殖发育、性别决定、细胞增殖分化、神经发生、免疫代谢及细胞凋亡等几乎所有的生物过程。一直以来，人们通过研究昆虫的生殖发育机理来作为害虫绿色防控的主要方法，miRNAs在昆虫生殖发育方面的研究也越来越受到大家的关注。

实施例1：高通量小RNA测序获得橘小实蝇生殖发育相关microRNA—— miR-2b-2-5p

对初羽化橘小实蝇雌成虫不同发育天数卵巢和脂肪体提取RNA。每个样品取样至少50只雌成虫，三个生物学重复。使用TRIZOL总RNA提取试剂(TaKaRa) 进行RNA提取。将2μg纯化的RNA通过TruSeq Small RNA Sample Prep Kits (Illumina,San Diego,CA)试剂盒分别制备初羽化1、5、9、13天卵巢和脂肪体的小RNA文库，然后送至LC-BIO公司测序。之后，使用Illumina Hiseq2500对构建的文库进行测序。最后从雌成虫性成熟过程中差异表达且表达丰度较高的57 个miRNA中选取了橘小实蝇雌成虫不同发育时期卵巢和脂肪体中差异高表达的miRNA-miR-2b-2-5p，其核苷酸序列为5'-UUCUUCAAAGCGGUUGUGAA AU-3'(SEQ IDNO.1)。

实施例2：miR-2b-2-5p特异性抑制剂和miR-2b-2-5p类似物的合成

以测得的miR-2b-2-5p的成熟体序列为参考，委托苏州吉玛基因股份有限公司合成其抑制剂和类似物。

表1 miR-2b-2-5p抑制剂和类似物序列

实施例3：miR-2b-2-5p抑制剂和类似物在调控橘小实蝇能量代谢和生殖发育中的应用

1、显微注射

显微注射用针使用武汉微探科学仪器有限公司的微电极玻璃毛细管，采用日本Narishige公司拉针仪在60.4℃加热下制成，用Narishige公司的微型磨针仪磨成注射用针，用德国Eppendorf公司显微注射仪进行注射实验，注射压强 300-400hPa，注射时间0.2s。采用初羽化3d的橘小实蝇雌成虫作为实验用虫，每头试虫腹部注射1μl 20μM的miR-2b-2-5p抑制剂/类似物，以注射相同量的抑制剂阴性对照/类似物阴性对照(相关序列见表1)，每个处理三个生物学重复，每个处理虫数为120头，共进行两次重复实验。

2、糖原含量检测及甘油三脂(TAG)含量检测

取miR-2b-2-5p抑制剂/类似物注射后第三天的雌虫整虫，按照Glycogen ContentAssay Kit试剂盒操作步骤检测糖原含量，按照Triglyceride(TAG)Content Assay kit试剂盒操作步骤检测甘油三脂(TAG)含量。用GraphPad Primer7软件进行t测验来分析处理组(注射miR-2b-2-5p抑制剂/类似物的雌虫)与对照组(注射miR-2b-2-5p抑制剂/类似物阴性对照的雌虫)之间糖原和甘油三脂(TAG)含量的差异。在注射miR-2b-2-5p抑制剂后第三天取雌虫整虫，检测糖原和甘油三脂的含量变化，结果显示与对照组相比，处理组中糖原含量显著上升，但TAG含量显著下降(图2)；同样的，取miR-2b-2-5p类似物注射后三天的雌虫整虫检测糖原和甘油三脂的含量变化，结果显示与对照组相比，处理组中糖原含量无明显变化，但TAG含量显著上升(图7)。

3、脂肪体尼罗红染色

取miR-2b-2-5p抑制剂/类似物注射后第三天的雌虫整虫，解剖取脂肪体组织，进行染色步骤如下：

1)将脂肪体组织置于1.5mLEP管中，加入PBS浸洗5min；

2)将组织转移到装有4％PFA多聚甲醛固定液的EP管中，固定1h以上；

3)PBS浸洗2次，每次10min；

4)尼罗红染色孵育1h(Nile red原液稀释500倍使用)；

5)PBS浸洗2次，每次10min；

6)DAPI染色孵育30min；

7)PBS浸洗1次，5min。

在体视显微镜下解剖，首先在载玻片上滴1滴抗荧光衰减猝灭剂，将脂肪体从腹部背板上小心取下，置于载玻片上，再盖上盖玻片，注意组织不宜过多，否则会有气泡，影响观察。制好片后于LEICASP8激光共聚焦仪器上进行拍照记录。结果显示注射miR-2b-2-5p抑制剂后脂肪滴的大小，处理组中脂肪滴明显比对照组要小，对照组细胞内脂肪滴颗粒充盈，而处理组中较为稀疏(图3)；注射miR-2b-2-5p类似物后脂肪体尼罗红染色结果相较于对照组，处理组中脂肪滴颗粒有明显增大，且有过度堆积现象(图8)。

4、卵巢形态观察：根据陈敏等对橘小实蝇卵巢形态结构及发育特征进行了分级(陈敏等2014)，我们将橘小实蝇卵巢发育进程划分为五个等级，即羽化初期(Ⅰ级)、卵巢发育初期(Ⅱ级)、卵黄沉积期(Ⅲ级)、成熟待产期(Ⅳ级)和产卵盛期(Ⅴ级)。

miR-2b-2-5p抑制剂/类似物注射后，解剖第7、10、13日龄雌成虫的卵巢，每个处理15头，在体视显微镜下进行卵巢形态观察，并拍照记录，统计分析其所属发育等级。结果显示注射miR-2b-2-5p抑制剂的结果显示对照组中第7、10、13天中第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等级形态的卵巢分别占比75％、70％、80％，而处理组第7、10、13天中第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等级形态的卵巢分别占比25％、30％、20％，更多停留在上一个发育时期甚至发育初期(图4)；注射miR-2b-2-5p类似物的结果显示对照组中第7、10、13天中第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等级形态的卵巢分别占比80％、70％、80％；而处理组第7、10、13天中第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等级形态的卵巢分别占比20％、30％、 30％，更多停留在上一个发育时期甚至发育初期(图9)。

5、产卵量统计：在14.4cm×8.5cm×8.5cm(长×宽×高，口径为6.6cm)的透明塑料盒中放入miR-2b-2-5p抑制剂/类似物注射后第13日龄的雌虫与正常未交配的第13日龄雄虫，每盒2对，每个处理15盒，每隔一天统计交配后15天内雌虫的产卵情况。处理方法：首先在一次性小纸杯侧面扎孔以便雌虫产卵，然后将小纸杯置于透明塑料盒内，在塑料盒盖内放置片状香蕉，倒放透明塑料盒，密封盒口，使香蕉的气味只能通过纸杯上的小孔散发出去，从而引诱雌虫在纸杯上产卵。分别统计处理组和对照组中产卵数量，并计算日均产卵量和产卵总量，用GraphPad Primer7软件进行t测验来分析干扰组(注射miR-2b-2-5p抑制剂/类似物的雌虫)与对照组(注射miR-2b-2-5p抑制剂/类似物阴性对照的雌虫)之间产卵量的差异。结果显示，注射miR-2b-2-5p抑制剂后，从统计开始后1-15d 中第1、3、7、9、11天的处理组每雌单日产卵量均显著低于对照组(图5)，产卵总量统计结果同样显示处理组(360粒)显著少于对照组(677粒)(图6)；注射miR-2b-2-5p类似物后，统计开始后1-15d中第1、5、11天的处理组每雌单日产卵量均显著低于对照组(图10)，产卵总量统计结果同样显示处理组(296粒) 显著少于对照组(561粒)(图11)。

参考文献：

1.陈敏，陈鹏，叶辉，季清娥，黎剑平.桔小实蝇卵巢形态结构及发育特征研究.环境昆虫学报，2014，36(01)：83-88

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