调节植物镁离子吸收和转运的方法

技术领域

本发明涉及植物矿物质吸收和转运，具体涉及水孔蛋白在调节植物镁离子吸收和转运中的用途。

背景技术

水孔蛋白(aquaporin，AQP)是细胞膜上能选择性地高效转运水分子的膜内在蛋白，属于MIP(major intrinsic protein)超家族。AQP家族都具有高度保守的结构特征与功能结构域。通常是以四聚体形式存在，少数则以二聚体或单体形式存在。对于四聚体的AQP，每个单体形成独立的水通道。

AQP依据其序列将植物水孔蛋白分为七个亚类：质膜膜内在蛋白(plasmamembrane intrinsic proteins，PIPs)、液泡膜膜内在蛋白(tonoplast intrinsicproteins，TIPs)、类Nod26膜内在蛋白(Nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)和小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins，SIPs)、GlpF类膜内在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins，GIPs)、HIPs(hybrid intrinsic proteins)和XIPs(Xintrinsic proteins，XIPs)三个类别。其中PIP类水孔蛋白分为PIP1、2、3三个亚类。

AQP几乎存在于植物各个器官和组织，优先在维管束组织、导管、木质部薄壁细胞和韧皮部等涉及水分运输的相关细胞和组织中表达。植物AQP除了转运水分外，还可以运输许多其他小分子物质，如中性小分子甘油、H

植物AQP的表达受非生物胁迫的调控，如干旱、冷、盐胁迫和水淹以及ABA等信号分子的调控。植物AQP的活性调控方式涉及AQP的磷酸化、异聚化、糖基化和甲基化等以及细胞环境的质子梯度(pH)和Ca

发明内容

水孔蛋白主要对水分的跨膜运输起主要作用，本发明发现水孔蛋白不仅具有水分运输功能，也具有镁离子的吸收和转运功能。因此同时将水分的运输和矿物质镁的转运结合起来，对植物的生长发育无疑是非常有利，将会大大提高其生长效率，增加其生物量和产量。

本发明第一方面提供一种调节植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因缺镁或高镁引起的状况、或调节植物长势的方法，包括：调节水孔蛋白的表达或活性。

在一个或多个实施方案中，所述方法上调水孔蛋白的表活或活性；从而上调植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因缺镁引起的状况、或促进植物生长。

在一个或多个实施方案中，所述方法下调水孔蛋白的表活或活性；从而下调植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因高镁引起的状况、或抑制植物生长。

在一个或多个实施方案中，所述植物是大戟目植物；优选是大戟科植物；更优选是木薯属植物。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白选自以下的一种或多种：PIP、TIP、NIP、SIP、GIP、HIP和XIP。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白选自PIP1、PIP2、PIP3中的一种或多种。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白或其基因源自大戟目植物，优选源自大戟科植物，更优选源自木薯属植物。

在一个或多个实施方案中，所述水孔蛋白的氨基酸序列选自以下的一种或多种：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个(如1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个或多个实施方案中，编码所述水孔蛋白的核酸序列选自以下的一种或多种：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(优选地1-30，更优选地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中水孔蛋白的表达或活性包括：

(1)将水孔蛋白基因转入植物，获得转化的植物；和/或

(2)将水孔蛋白基因或编码蛋白的促进剂与植物接触。

在一个或多个实施方案中，所述促进剂包括能将水孔蛋白磷酸化、异聚化、糖基化和甲基化的试剂或增加细胞环境的质子梯度(pH)、Ca

在一个或多个实施方案中，所述水孔蛋白基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述水孔蛋白的表达由35S启动子驱动。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中水孔蛋白的表达的方法包括：

(1)提供携带含有水孔蛋白基因的核酸构建物的农杆菌，

(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或整合载体。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中水孔蛋白的表达的方法还包括：(3)选择出转入了水孔蛋白基因的植物组织、器官或种子；和(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在一个或多个实施方案中，所述下调水孔蛋白的表活或活性包括：将下调水孔蛋白基因转录、蛋白表达或蛋白活性的抑制剂转入植物中。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂包括特异性干扰水孔蛋白基因转录和/或表达、或下调水孔蛋白活性的抑制分子。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以水孔蛋白基因或其转录本或表达蛋白作为抑制靶标。优选地，所述抑制分子以SEQ ID NO:2或其RNA对应物或SEQ ID NO:1所示的蛋白作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以水孔蛋白基因或其转录本作为抑制靶标的dsRNA或其构建物。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是使用选自ZFN、TALEN和CRISPR的技术敲除或敲减水孔蛋白基因的试剂，例如sgRNA。在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含Cas酶(例如Cas9)、其编码序列、和/或表达所述Cas酶的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中水孔蛋白表达的方法包括：

(i)提供携带可干扰水孔蛋白基因表达的核酸构建物的农杆菌，所述核酸构建物含有或产生所述抑制剂；

(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或整合载体。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中水孔蛋白表达的方法还包括：

(iii)选择出转入了所述核酸构建物的植物组织、器官或种子；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

本发明第二方面提供一种物质在调节植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因缺镁或高镁引起的状况、调节植物长势中的用途，所述物质选自下组：水孔蛋白基因或编码蛋白、或其促进剂或抑制剂。

在一个或多个实施方案中，所述水孔蛋白基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述植物是大戟目植物；优选是大戟科植物；更优选是木薯属植物。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白选自以下的一种或多种：PIP、TIP、NIP、SIP、GIP、HIP和XIP。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白选自PIP1、PIP2、PIP3中的一种或多种。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白或其基因源自大戟目植物，优选源自大戟科植物，更优选源自木薯属植物。

在一个或多个实施方案中，所述物质为水孔蛋白基因或编码蛋白、或其促进剂，并且所述物质上调植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因缺镁引起的状况、促进植物生长。

在一个或多个实施方案中，所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。优选地，所述核酸分子是含有水孔蛋白编码序列的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述水孔蛋白的氨基酸序列选自以下的一种或多种：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个(如1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个或多个实施方案中，编码所述水孔蛋白的核酸序列选自以下的一种或多种：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(优选地1-30，更优选地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个或多个实施方案中，所述物质为水孔蛋白基因或编码蛋白的抑制剂，并且所述物质下调植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因高镁引起的状况、抑制植物生长。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂包括特异性干扰水孔蛋白基因转录和/或表达、或下调水孔蛋白活性的抑制分子。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以水孔蛋白基因或其转录本或表达蛋白作为抑制靶标。优选地，所述抑制分子以SEQ ID NO:2或其RNA对应物或SEQ ID NO:1所示的蛋白作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以水孔蛋白基因或其转录本作为抑制靶标的dsRNA或其构建物。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是使用选自ZFN、TALEN和CRISPR的技术敲除或敲减水孔蛋白基因的试剂，例如sgRNA。在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含Cas酶(例如Cas9)、其编码序列、和/或表达所述Cas酶的核酸构建物。

本发明还提供一种水孔蛋白基因在鉴定植物对镁离子的吸收和转运能力、预测植物长势的分子标记中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述水孔蛋白基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述植物是大戟目植物；优选是大戟科植物；更优选是木薯属植物。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白选自以下的一种或多种：PIP、TIP、NIP、SIP、GIP、HIP和XIP。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白选自PIP1、PIP2、PIP3中的一种或多种。

在一个或多个实施方案中，水孔蛋白或其基因源自大戟目植物，优选源自大戟科植物，更优选源自木薯属植物。

在一个或多个实施方案中，所述水孔蛋白的氨基酸序列选自以下的一种或多种：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个(如1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个或多个实施方案中，编码所述水孔蛋白的核酸序列选自以下的一种或多种：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(优选地1-30，更优选地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明另一方面还提供抑制水孔蛋白表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物，所述多核苷酸具有：

(1)SEQ ID NO:3所示的序列或其相应DNA序列，或与其具有至少90％序列相同性的序列，

(2)源自(1)的siRNA，或

(3)含有式I所示的结构：

Seq

式I中，Seq

X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq

在一个或多个实施方案中，siRNA长度为10-35bp，优选15-30bp。

在一个或多个实施方案中，X包含SEQ ID NO:4。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体。

本发明的积极进步效果在于：大家普遍认为水孔蛋白具有水分吸收和转运的功能，目前尚没有发现其对Mg

附图说明

图1：MePIP2；7过表达转基因木薯的Southern blotting分析。A：Hind III；B：XbaI。

图2：MePIP2；7RNA干扰转基因木薯的Southern blotting分析。

图3：野生型和转基因木薯中MePIP2；7基因表达水平分析。

图4：缺镁条件下MePIP2；7和MGT9在根和叶中的不同时间点的表达模式。

图5：细菌突变体MM281互补分析。

图6：酵母双杂分析。

图7：BiFC结果分析。

图8：共定位分析。

图9：野生型和转基因植株在不同镁离子浓度下长势分析。A：植株照片；B：根干重；C：地上部分干重。

图10：大田野生型和转基因植株大田表型。A：过表达植株不同部位叶片照片；B：干扰植株不同部位叶片照片；C：基部叶片叶绿素水平；D：过表达植株照片；E：干扰植株照片；F：储藏根重量；G：根长宽比。

图11：不同组织中Mg

图12：MeMGT9在不同组织中的表达分析。

图13：大田不同组织碘染、淀粉含量及SUT基因表达分析。A：大田野生型和转基因植株基部成熟叶片(上：野生型与过表达植株叶片；下：野生型与RNAi植株叶片)的碘染检测。B：大田野生型和过表达植株顶部、中部和基部叶片中的淀粉含量。C：大田野生型和RNAi植株顶部、中部和基部叶片中的淀粉含量。D：大田野生型和过表达植株纤维根FR和发育根DR中淀粉含量。E：大田野生型和RNAi植株纤维根FR和发育根DR中淀粉含量。F：MeSUT1在野生型和过表达植株不同组织中的表达量。G：MeSUT1在野生型和RNAi植株不同组织中的表达量。H：MeSUT2在野生型和过表达植株不同组织中的表达量。I：MeSUT4-1在野生型和过表达植株不同组织中的表达量。J：MeSUT4-1在野生型和RNAi植株不同组织中的表达量。K：MeSUT2在野生型和RNAi植株不同组织中的表达量。

具体实施方式

本发明发现水孔蛋白不仅具有直接转运水分的功能，还具有Mg

因此，本发明首先提供一种调节植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因缺镁或高镁引起的状况、或调节植物长势的方法，包括：调节水孔蛋白的表达或活性。本文所述植物可以是任何植物，优选模式植物(例如拟南芥、烟草)或大戟目植物，例如大戟科植物。

本文所述“缺镁引起的状况”或“低镁引起的状况”指植物由于吸收镁离子过少而引起的植物或环境的改变。缺镁或低镁的原因可以来自环境或来自植物本身，例如环境中镁离子浓度下降，或植物对镁离子的吸收能力下降。缺镁或低镁引起的状况包括但不限于：叶片失绿、叶尖和叶片边缘褪色(例如从绿色变为淡黄色)、叶片基部褪色，严重时叶片干枯、脱落。此外，缺镁或低镁还会出现植株矮小，生长缓慢的现象，根系发育不正常、灌浆不良等。

本文所述“富镁引起的状况”或“高镁引起的状况”指植物由于吸收镁离子过多而引起的植物或环境的改变。富镁或高镁的原因可以来自环境或来自植物本身，例如环境中镁离子浓度上升，或植物对镁离子的吸收能力增加。富镁或高镁引起的状况包括但不限于：镁富集导致与Ca

本文所述“水孔蛋白”和“AQP”可互换使用，指水孔蛋白基因(包括cDNA序列、基因组序列、或其组合)编码的多肽。水孔蛋白包括但不限于PIP、TIP、NIP、SIP、GIP、HIP和XIP，其中PIP包括PIP1、PIP2或PIP3。本文所述各类水孔蛋白可源自任何植物，优选模式植物(例如拟南芥、烟草)或大戟目植物，例如大戟科植物。在示例性实施方案中，使用木薯的水孔蛋白MePIP2；7(GenBank accession No.MN746350，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码序列如SEQ ID NO:2所示)。

各类水孔蛋白还包括具有与相应水孔蛋白相同功能的变异形式。多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。通常，这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，优选地1-30个、1-20个、1-10个、1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，优选地为10个以内，更优选地为5个以内)氨基酸。

任何与所述水孔蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:1所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有该蛋白相似或相同功能的多肽也包括在本发明内。所述“相同或相似功能”主要是指调控镁离子吸收和转运的能力。

在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，即保守性变异体。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乳酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在氨基末端和/或羧基末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。

本发明还包括所要求保护的多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO:1差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

此外，任何一种水孔蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。本文中，水孔蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的水孔蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述生物活性片段至少保持50％的全长水孔蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长水孔蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明还涉及水孔蛋白的配体、抗体或其抗原结合片段，作为水孔蛋白的抑制剂的一种。所述配体是抑制性配体；所述抗体可以是全抗体、纳米抗体、单抗、双抗或多抗中的任意，优选单抗。本文中，抗体的抗原结合片段是抗体中可以与抗原(水孔蛋白)结合并发挥抑制作用从而减低抗原活性(镁离子吸收)的部分，包括但不限于Fab、F(ab’)

本发明还涉及编码本文所涉多肽(包括水孔蛋白或其变体、类似物、衍生物，抗体或其抗原结合片段)的多核苷酸序列。所述多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。如本文所用，简并变异体在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选至少70％，更优选至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于木薯，但是来源于其它类似的植物(尤其是与木薯属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO:1所示)具有一定同源性(如具有70％以上，如80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的水孔蛋白的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的水孔蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还包括靶向沉默水孔蛋白基因的多核苷酸序列，包括但不限于反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA。通过研究水孔蛋白编码序列，发明人提供示例性的dsRNA(的一条链)如SEQ ID NO:3所示。dsRNA在植物体内或体外的化学或相关酶例如(RNase或Dicer)作用下消化，得到能够干扰基因表达的siRNAs。可将dsRNA和/或其消化得到的siRNA转入植物细胞，从而干扰基因表达。因此，本发明包括所述dsRNA及其所包含的siRNA。

本发明还提供了一种包括本发明的多核苷酸(例如水孔蛋白编码序列或dsRNA)的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子(例如35S启动子)，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。所述载体可以是表达载体或整合载体，前者用于表达基因、dsRNA、相关酶、sgRNA等；后者用于将所需表达的核酸序列整合到基因组中。示例性的载体例如p1301和pP35RNAi。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl

本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本文所述多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明提供了所述水孔蛋白基因的用途，用于调节植物对镁离子的吸收和转运；或用于筛选对于调节植物镁离子吸收有用的物质(即：所述物质通过调节水孔蛋白基因的表达来调节植物镁离子吸收)；或用于鉴定植物对镁离子的吸收和转运能力；或用于预测植物长势的分子标记。本文所述分子标记可以是基因、多核苷酸、多肽或蛋白。

本文所述“调节”包括“上调”和“下调”。因此，本文所述方法包括上调水孔蛋白的表活或活性，从而上调植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因缺镁引起的状况、或促进植物生长。所述方法还包括：下调水孔蛋白的表活或活性，从而下调植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因高镁引起的状况、或抑制植物生长。本发明还提供，水孔蛋白基因或编码蛋白、或其促进剂在上调植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因缺镁引起的状况、促进植物生长中的用途；和水孔蛋白基因或编码蛋白的抑制剂在下调植物对镁离子的吸收和转运、改善植物因高镁引起的状况、抑制植物生长中的用途。

任何可提高水孔蛋白的活性、提高其的稳定性、促进其表达、延长其有效作用时间、或促进其基因转录和翻译的物质均可用于本发明，作为水孔蛋白基因的“促进剂”，用于调控植物农艺性状。例如提高水孔蛋白基因的转录、表达或活性的载体。

在得知了所述水孔蛋白基因的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述水孔蛋白基因的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带水孔蛋白基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的水孔蛋白；或者，可以使水孔蛋白基因的促进剂与植物接触。示例性地，上调植物中水孔蛋白的表达的方法包括：(1)提供携带含有水孔蛋白基因的核酸构建物的农杆菌，(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。因此，所述方法还包括：(3)选择出转入了水孔蛋白基因的植物组织、器官或种子；和(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

或者，为了上调水孔蛋白的活性，可以将水孔蛋白的促进剂与植物接触。水孔蛋白的促进剂包括但不限于能促进水孔蛋白的磷酸化、异聚化、糖基化和甲基化等以及细胞环境的质子梯度(pH)、Ca

在另一方面，任何可降低水孔蛋白的活性、降低其稳定性、抑制其表达、减少其有效作用时间、或降低其转录和翻译的物质均可用于本发明，作为水孔蛋白的抑制剂。所述抑制剂可用于调控植物对镁离子的吸收转运。

因此，本发明提供了另一种调控植物镁离子吸收转运的方法，所述方法包括：降低所述植物中水孔蛋白基因的表达(包括使水孔蛋白基因不表达或低表达)；从而降低镁离子吸收转运。可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低水孔蛋白基因的表达或使之缺失表达。示例性地，为了下调水孔蛋白的表活，可将特异性干扰水孔蛋白基因转录和/或表达、或下调水孔蛋白活性的抑制分子转入细胞或植物，使得细胞或植物不表达或降低表达水孔蛋白。所述抑制分子以水孔蛋白基因或其转录本或表达蛋白作为抑制靶标。因此，所述抑制分子可以以SEQ ID NO:2或其RNA对应物或SEQ ID NO:1所示的蛋白作为抑制靶标。所述抑制分子可以是已知能够抑制水孔蛋白活性的小分子化合物、水孔蛋白的抗体或配体或其结合片段、或者是干扰水孔蛋白基因表达的反义核酸、microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、或sgRNA。在示例性实施方案中，本发明使用以SEQ ID NO:2的第57-495位中的核苷酸序列作为抑制靶标的dsRNA或siRNA。

此外，为了下调水孔蛋白基因表达或活性，可在细胞中转入基因敲除载体。因此，所述抑制剂可以是使用选自ZFN、TALEN和CRISPR的技术敲除或敲减水孔蛋白基因的试剂，例如sgRNA。适用于本发明的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术为本领域所周知。各技术各自通过DNA识别域与核酸内切酶的共同作用实现靶基因的敲除。在这些实施方案中，所述抑制剂还包含Cas酶(例如Cas9)、其编码序列、和/或表达所述Cas酶的核酸构建物。

在具体实施方案中，下调植物中水孔蛋白表达的方法包括：(i)提供携带可干扰水孔蛋白基因表达的核酸构建物的农杆菌，所述核酸构建物含有或产生所述抑制剂；(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官；(iii)选择出转入了所述核酸构建物的植物组织、器官或种子；和(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

实验内容

(一)实验材料

1.植物材料

野生型木薯(Manihot esculenta Crantz)TMS60444；

本氏烟草。

2.菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)：DH5α、TOP10；

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：LBA4404(RifrChlr)、GV3101(RifrTetr)；

沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)细菌突变体MM281；

酵母NMY51。

3.质粒

pMD18-T，pA7-GEMHE，pCAMBIA1301s(pCAMBIA1301骨架，Kanr)，pBSRNAi(pBluescriptSK骨架，Ampr)，pP35RNAi(pCAMBIA1300骨架，Kanr)，pm-rk，p1300-GFP，p1300-35S-X-cYFP，p1300-35S-nYFP-X，pPR3-N，pBT3-STE，pNubG-Fe65，pTSU2-APP。

(二)实验步骤

1.载体构建

(1)过表达载体构建

以木薯cDNA为模板，参考网站(https://phytozome.jgi.doe.gov)序列，克隆MePIP2；7基因。将PCR产物连接到pMD18-T中，序列经测序验证后，经BamHⅠ和HindⅢ酶切位点连接到pCambia1301S载体，形成终表达载体p1301-35S::MePIP2；7。

(2)MePIP2；7RNA干扰载体构建

干扰片段扩增：分别针对MePIP2；7设计含Kpn I和Cla I位点的特异引物进行扩增，引物序列见附录。再将酶切位点换成Xho I和BamH I扩增同一片段用作反向重复序列。

中间载体构建：分别通过Kpn I和Cla I，Xho I和BamH I双酶切对应的扩增片段将pBSRNAi中对应片段置换为目标片段。在第一片段置换后菌落PCR选取单克隆测序验证片段正确性，在反向重复片段置换后利用外侧引物或内含子上引物PCR选取单克隆，抽提质粒酶切PCR验证所构建发夹结构的正确性。

终载体构建：通过Kpn I和BamH I双酶切将中间载体上已构建的各发夹结构置换到pP35RNAi中构成最终RNAi表达载体。所有载体在导入根癌农杆菌前后做PCR和酶切验证。

(3)亚细胞定位载体构建及转化

通过Sal I和Spe I双酶切将MePIP2；7不含终止密码子的CDS序列连在p1300-GFP载体上。通过重组方法将不含终止密码子的MeMGT9序列连接在p1300-GFP载体上，获得正确克隆，转化农杆菌。

(4)BiFC及共定位载体构建及转化

通过XbaI和BamH I将MeMGT9连在p1300-35S-nYFP-X载体，通过Sal I和Spe I将MePIP2；7连接在p1300-35S-X-cYFP载体上，转化农杆菌。

(5)酵母双杂载体构建

通过重组方法分别将MeMGT9连在pm-rk-RFP和pPRN-3载体，将不含终止密码子的MePIP2；7CDS序列连在pBT3-X-STE载体上。

(6)细菌突变体载体构建

通过同源重组的方法分别将MePIP2；7、MeMGT4和MeMGT9 CDS连在pTRC99A载体上。

2.转化

(1)木薯悬浮愈伤遗传转化

组培苗培养1个月，取顶芽或腋芽诱导获得体胚和脆性胚性愈伤组织，将构建的载体进行遗传转化，获得转基因植株。

(2)烟草转化

将p1300-35S-nYFP-MeMGT9+p1300-35S-cYFP-MePIP2；7，p1300-35S-nYFP-X+p1300-35S-X-cYFP，p1300-GFP，pm-rk-RFP，p1300-MeMGT9-GFP，p1300-MePIP2；7-GFP+CD3-mCherry，p1300-MePIP2；7-GFP+pm-rk-RFP-MeGT9载体或组合分别转化烟草。

(3)酵母转化

将pPR3-N+pBT3-MePIP2；7-STE，pNubG-Fe65+pTSU2-APP，pPR3-N+pTSU2-APP，pPR3-MeMGT4+pBT3-MePIP2；7-STE，pPR3-MeMGT9+pBT3-MePIP2；7-STE组合分别转化酵母NMY51。

(4)细菌转化

分别将1927、pTRC99A、pTRC99A-MePIP2；7、pTRC99A-MeMGT4和pTRC99A-MeMGT9载体转化细菌突变体MM281，获得阳性克隆。收集阳性克隆菌液分别在含有10μM、100μM和1mMMgSO4的培养基上点斑。

3.不同镁离子条件下长势分析

取相同长度茎段分别扦插在还有0uM、50uM、500uM、1.5mM和6mM等不同浓度镁离子的MS培养基中，26℃，1.5月，统计地上和地下部分的长势。

4.大田条件下不同组织镁离子含量、镁离子转运蛋白和淀粉含量分析

对大田生长6个月的野生型和转基因株，取相同位置不同组织的样品，保持样品完整不受损伤，用超纯水(>18MΩcm-1)清洗2次，25mM CaCl

分析暗周期末不同组织淀粉含量的变化。总淀粉提取和测定方法如下：总淀粉提取方法：称取鲜重约200mg植物组织，在液氮中研磨，迅速取50mg样品入2.0mL EP管中，迅速加入700μL甲醇，充分震荡混匀，终止酶活性；加入25μL核糖醇贮存液(0.2mg/mL，极性内标，加入25μL水(导电率小于0.05μs)，混匀后检查pH值(大约5-6)，70℃摇15min(1min后打开盖子)，14,000g离心3min；上清移入干净离心管中加入700μL纯水，测pH值；沉淀加500μL氯仿(CHCl3)，混匀，37℃摇5min，14,000g，离心3min，将上清移入离心管中，在两次混合的上清中加入500μL CHCl

淀粉总含量的测定方法：根据Total Starch试剂盒(K-TSTA，Megazyme)，将提取的淀粉用50μL的75％的乙醇润湿，震荡混匀是样品重复分散，防止在加热过程中结块，加入1.5mlα-淀粉酶，沸水孵育12min，使植物组织中的淀粉充分糊化，期间各两分钟震荡混用，防止由于酒精蒸发导致样品喷出EP管；将EP管转移到50℃水浴中，加入50μL淀粉葡糖苷转移酶，孵育30min，将EP管中的全部液体转移到15mL试管中，定容到10mL，取约100μL的样品加入3mL GOPOD，50℃孵育20min；空白对照用同样量的水代替样品；葡糖糖对照为100μL葡糖糖标样(1mg/mL)加入3mL GOPOD试剂。所有样品在510nm下测定其吸光值。

5.细菌突变体MM281互补分析

挑取沙门氏菌S.typhimurium MM281单克隆接种于含有Chl(34，136ul)和Kan(50)及10mM Mg

分别构建pTRC99A-MePIP2；7，pTRC99A-MeMGT4，pTRC99A-MeMGT9载体，转化MM281感受态，1927为阳性对照，MM281-pTrc99A为空载对照。挑取MM281、MM281-pTrc99A、MM281-pTrc99A-MeMGT9、MM281-pTrc99A-MeMGT4和MM281-pTRC99A-MePIP2；7的单菌落在试管中过夜培养。然后再按50:1(50mLLB:1mL菌液)的比例接种于含有相应抗生素的锥形瓶中扩大培养，测菌OD

6.酵母双杂

利用Dualsystems Biotech.系统进行膜体系酵母双杂实验。将诱饵基因MePIP2；7序列扩增通过Sfil酶切位点分别连在pBT3-N和pBT3-STE载体上，构建N端或C端与VP16-LexA-Cub分别融合的pBT3-N-MePIP2；7和pBT3-MePIP2；7-STE载体。将构建的不同组合的载体分别转入NMY51酵母菌株[MATa his3△200trp1-901 leu2-3,112ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4 agar stab]，其中pBT3-N-MePIP2；7与pOst1-NubI共转、pBT3-MePIP2；7-STE与pOst1-NubI共转作为实验组,pTSU2-APP和pNubG-Fe65共转作为阳性对照，pPR3-N和pTSU2-APP共转作为阴性对照。分别在二缺和四缺培养基上筛选。通过分析表明pBT3-MePIP2；7-STE可用于后续的互作验证试验。

构建pPR3-N-MeMGT9载体，将pPR3-N-MeMGT9与pBT3-MePIP2；7-STE、pBT3-MePIP2；7-STE和pPR3-N、pTSU2-APP和pNubG-Fe65、pPR3-N和pTSU2-APP共转化NMY51酵母菌株，检测是否存在互作。

7.叶绿素含量测定

取待测木薯叶片，蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干水分，称取1g质量的叶片放入离心管中，加入5mL 95％乙醇提取叶绿素。叶片浸泡95％酒精在黑暗中12-24h提取色素，至叶片白色为止，分光光度计法测定OD

Chl a＝12.7×OD

Chl b＝22.9×OD

Chl a+Chl b＝8.02×OD

所测定叶绿素含量单位为μg/mL，需要换算成mg/g。

8.叶片碘染

取田间位置相同的叶片，用95％酒精脱去叶绿素直到叶片基本变成白色，再以1％Lugol’s溶液(准确称量3.75g KI和1.25g I

9.利用qRT-PCR分析基因表达情况

利用1μg总RNA，在20μL反应体系中经反转录酶ReverTra Ace(货号TRT-101，TOYOBO，上海)反转录作用合成cDNA，用于Real time PCR检测。PCR反应在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪上进行，20μL体系中包括2×SYBR Master Mix(货号QPK-201，TOYOBO，上海)10μL，cDNA 50ng，Forward Primer和Reverse Primer各400nmol/L。反应条件为：95℃变性1min；95℃变性15s，60s退火延伸30s，40-50个循环数；Actin基因作为内参。每个样品三个重复，根据相对Ct值计算所检测基因的相对表达量，单个样本中各基因的相对表达量计算公式为：ΔCt＝Ct

实验结果

实施例1.转基因植株的获得与鉴定

图1显示MePIP2；7过表达转基因木薯的Southern blotting分析。标记探针为潮霉素磷酸转移酶基因，内切酶：Hind III(图1，A)和Xba I(图1，B)，M：λ-HindⅢ。M：marker，2-23：转基因株系。OE：过表达。

图2显示MePIP2；7RNA干扰转基因木薯的Southern blotting分析。标记探针为潮霉素磷酸转移酶基因，内切酶：左图中18和27为Xba I酶切，其他为HindⅢ酶切，右图为EcoRI酶切。M：λ-HindⅢ。M：marker，3-27：转基因株系。Ri：干扰。

图3显示野生型和转基因木薯中MePIP2；7基因表达水平分析。WT：野生型，Actin为内参。选择选取OE-2、OE-14、OE-23、Ri-7、Ri-18和Ri-27进行后续分析。

实施例2.MePIP2；7与MeGT9互作

图4显示缺镁条件下MePIP2；7和MeMGT9在根和叶中的不同时间点的表达模式。利用qRT-PCR对缺镁条件下MePIP2；7和MeMGT9的表达模式进行分析，MePIP2；7和MeMGT9在根和叶中表达均受诱导，其中MGT9在叶中上调表达，根中先下调后升高再降低。MePIP2；7叶中先下调再上调，后逐渐下调，在根中先下调后逐渐上调，48h表达量最高。

图5显示细菌突变体MM281互补分析结果。1927：阳性对照，MM281)：突变体，pTRC99A：空载，pTRC99A-MePIP2；7，pTRC99A-MeMGT4，pTRC99A-MeMGT9：不同载体转化MM281突变体。细菌突变体MM281互补分析表明MePIP2；7不具有Mg

图6显示酵母双杂分析结果。pPR3-N+pBT3-MePIP2；7：空载对照，pNubG-Fe65+pTSU2-APP：阳性对照，pPR3-N+pTSU2-APP：阴性对照。各组载体共转化酵母NMY51。酵母双杂结果表明MePIP2；7与MeMGT9存在互作，在四缺板且有5mM的3-AT板子上可以生长，且变蓝色。

图7显示BiFC分析结果。nYFP+cYFP：阴性对照，nYFP-MeMGT9+cYFP-MePIP2；7共转化烟草。BiFC结果表明nYFP-MeMGT9和cYFP-MePIP2；7共转化烟草，质膜检测到荧光，表明二者存在互作。

图8是共定位分析结果。p1300--GFP：阳性对照，pm-rk：阳性对照(质膜定位)，CD3-mCherry：质膜定位marker，p1300-MePIP2；7-GFP、p1300-MeMGT9-GFP和pm-rk-MeMGT9为不同载体。亚细胞定位结果表明MePIP2；7定位于质膜，MeMGT9定位于质膜和叶绿体，共定位结果表明两者可以共定位于质膜，表明二者存在一定的互作。

实施例3.组培条件下MePIP2；7增强对镁离子的吸收，促进植物生长

取野生型和转基因植株相同长度的茎段，扦插在含有0uM、50uM、500uM、1mM和6mMMg

实施例4.大田条件下MePIP2；7促进Mg

5月将三亚收获的茎秆移栽至五厍农场，11月初收获。过表达和RNAi转基因植株分别种在相邻的两行，每个株系依次种植10株，每行中间都有野生型作为对照。种植密度按行距80cm、株距100cm进行。结果如图10所示，对位于同一行中的野生型和转基因植株不同部位叶片的形状和颜色进行分析，发现与野生型相比，MePIP2；7过表达转基因植株各部位的叶片生长正常，均无明显差异。位于相邻行的野生型植株各部位的叶片和RNA干扰转基因植株上部叶片表型均正常，而RNA干扰植株中下部叶片的边缘缺绿黄化，且自上而下缺绿黄化现象加剧。块根变得更加细长，储藏根的重量显著降低，比野生型降低了74.49％。储藏根变得更加细长，长宽比是野生型的2.38倍。

然后，利用ICP-MS技术，对野生型和转基因植株不同组织中Mg

此外，结合MePIP2；7与MeMGT9存在互作，且MeMGT9具有Mg

碘染及淀粉含量分析表明，干扰的植株基部叶片暗周期末淀粉积累，基因表达分析也验证了叶片中积累碳水化合物导致SUT类家族基因表达受诱导。结果如图13所示：叶片碘染(图13A)、淀粉含量测定(图13B-E)、利用qRT-PCR分析基因表达模式(图13F-K)。这些结果进一步表明干扰MePIP2；7之后影响了Mg

本文所用引物

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 调节植物镁离子吸收和转运的方法

<130> 216326

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 281

<212> PRT

<213> Manihot esculenta

<400> 1

Met Ala Lys Glu Val Thr Glu Glu Ala Gly Glu Ala Ser Gln Gln Glu

1 5 1015

Arg Asp Tyr Val Glu Pro Pro Pro Ala Pro Leu Phe Asp Pro Gln Glu

202530

Leu Gly Leu Trp Ser Phe Tyr Arg Ala Val Ile Ala Glu Phe Ile Ala

354045

Thr Leu Leu Phe Leu Tyr Val Thr Ile Ala Thr Val Ile Gly Tyr Lys

505560

Lys Gln Thr Asp Pro Cys Ala Gly Val Gly Leu Leu Gly Ile Ala Trp

65707580

Ser Phe Gly Gly Met Ile Phe Ile Leu Val Tyr Cys Thr Ala Gly Ile

859095

Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Leu Gly Leu Phe Leu Ala

100 105 110

Arg Lys Val Ser Leu Val Arg Ala Ile Ala Tyr Met Val Ala Gln Cys

115 120 125

Leu Gly Ala Ile Cys Gly Val Gly Ile Val Lys Gly Ile Met Lys Asp

130 135 140

Phe Tyr Asn Ala Gln Gly Gly Gly Ala Asn Thr Val Ala Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ser Lys Gly Thr Ala Leu Gly Ala Glu Ile Ile Gly Thr Phe Val Leu

165 170 175

Val Tyr Thr Val Phe Ser Ala Thr Asp Pro Lys Arg Asn Ala Arg Asp

180 185 190

Ser His Val Pro Val Leu Ala Pro Leu Pro Ile Gly Phe Ala Val Phe

195 200 205

Met Val His Leu Ala Thr Ile Pro Ile Thr Gly Thr Gly Ile Asn Pro

210 215 220

Ala Arg Ser Phe Gly Ala Ala Val Ile Tyr Asn Asn Asp Lys Ala Trp

225 230 235 240

Asp Asp Gln Trp Ile Phe Trp Val Gly Pro Phe Val Gly Ala Leu Ala

245 250 255

Ala Ala Ile Tyr His Gln His Ile Leu Arg Ala Thr Ala Ile Lys Ala

260 265 270

Leu Gly Ser Phe Thr Thr Thr Thr Asn

275 280

<210> 2

<211> 846

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA

<400> 2

atggcgaagg aagtgacaga agaggcagga gaggcttcgc agcaagaaag agactatgta 60

gaaccaccac cagcaccact tttcgaccca caagagcttg gtctctggtc tttttacaga 120

gctgtcatcg cagagttcat cgcaactctt ctctttctct atgtaactat tgccacagtg 180

attggctaca agaagcaaac tgacccttgt gccggcgttg gccttttagg cattgcatgg 240

tcttttggcg gcatgatttt catccttgta tactgtactg ctggaatatc aggtggtcac 300

attaacccag ctgtgacatt gggcttattc ttggcaagga aggtgtcact ggtgcgagct 360

attgcttata tggtggctca gtgtttagga gcaatatgtg gagttggcat agttaagggg 420

attatgaagg atttctataa tgctcaagga ggtggtgcta atactgtggc tgatacatac 480

tctaaaggaa ctgctcttgg agctgagatt attgggactt ttgtccttgt ctacactgtc 540

ttctctgcca ctgatcccaa gcgtaacgca cgtgattctc acgttcctgt tttggctccc 600

ttgccgattg ggtttgcagt ttttatggtg cacttagcca ccatccccat aacaggcact 660

ggaatcaacc cagctcgtag ctttggtgct gctgttatat acaacaacga caaagcctgg 720

gatgaccagt ggatcttctg ggtagggcca tttgtgggag cactagctgc agcaatatat 780

caccagcaca tactgagagc cacagccatt aaagcattgg gatctttcac caccaccacc 840

aactaa 846

<210> 3

<211> 439

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RNAi

<400> 3

tguagaacca ccaccagcac cacuuuucga cccacaagag cuuggucucu ggucuuuuua 60

cagagcuguc aucgcagagu ucaucgcaac ucuucucuuu cucuauguaa cuauugccac 120

agugauuggc uacaagaagc aaacugaccc uugugccggc guuggccuuu uaggcauugc 180

auggucuuuu ggcggcauga uuuucauccu uguauacugu acugcuggaa uaucaggugg 240

ucacauuaac ccagcuguga cauugggcuu auucuuggca aggaaggugu cacuggugcg 300

agcuauugcu uauauggugg cucaguguuu aggagcaaua uguggaguug gcauaguuaa 360

ggggauuaug aaggauuucu auaaugcuca aggagguggu gcuaauacug uggcugauac 420

auacucuaaa ggaacugcu 439

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RNAi

<400> 4

auuuaaauua uuuauuucuu cuuuuccauu uuuuuggcua acauuuucca ugguuuuaug 60

auaucaugca gguacgagcg 80

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 5

cggatccatg gcgaaggaag tgacagaag 29

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 6

cccaagcttt tagttggtgg tggtggtgaa ag 32

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 7

cggggtacct gtagaaccac caccagcac 29

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 8

ccatcgatag cagttccttt agagtatg 28

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 9

cgcggatcct gtagaaccac caccagcac 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 10

ccgctcgaga gcagttcctt tagagtatg 29

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 11

cggtcgacat ggcgaaggaa gtgaca 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 12

cccactagta cggtggtgaa agatcc 26

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 13

tgaaaaagcc tgaactcacc g 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 14

tatttctttg ccctcggacg 20

<210> 15

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 15

attcgagctc ggtaccatgg cgaaggaagt gacagaattc gagctcggta ccatggcgaa 60

ggaagtgaca ga 72

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 16

gcaggtcgac tctagattag ttggtggtgg tggtga 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 17

attcgagctc ggtaccatga ggtctcaccc cctgct 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 18

gcaggtcgac tctagattat tccagcaacc gcttgt 36

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 19

attcgagctc ggtaccatgg tatttcgcga catggc 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 20

gcaggtcgac tctagatcaa gatccaacca gacctt 36

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 21

tctattttat gtaatggcca ttacggccat ggcgaaggaa gtgacaga 48

<210> 22

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 22

cgaattcctg cagatggccg aggcggcccc gttggtggtg gtggtga 47

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 23

gtatcaacgc agagtggcca ttacggccat ggtatttcgc gacatggc 48

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 24

atcgaattct cgagaggccg aggcggcctc aagatccaac cagacctt 48

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 25

cacaacgtct atatcatggc tctagacatg gtatttcgcg acatggc 47

<210> 26

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 26

cgagctctat cgatcaatca ggatcctcaa gatccaacca gacctttgt 49

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 27

accatcacca tcacgccatg gtcgacatgg cgaaggaagt gacaga 46

<210> 28

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 28

cgttcttctg cttgtccatc actagtacgt tggtggtggt ggtgaaag 48

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 29

cggagctagc tctagaatgg tatttcgcga catggc 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 30

tgctcaccat ggatccagat ccaaccagac ctttgt 36

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 31

accatcacgc catggtcgac atggtatttc gcgacatggc 40

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 32

gctcaccatc actagtacag atccaaccag acctt 35

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 33

cgattgggtt tgcagttttt 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 34

tggctgtggc tctcagtatg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 35

tttctagctg cacgcacaac 20

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 36

cgagcagtca accttgtcat tg 22

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 37

attccttttg caatggcatc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 38

tttggctgag gggatatcag 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 39

caaaatggcc ttgagctttc 20

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 40

gctccaggtc catcaccta 19

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 41

tgtagagcgc ttcttgctga 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 42

gcagacttga gattggcaca 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 43

tgatgagtct ggtccatcca 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 44

cctcctacga cccaatctca 20