基于电化学DNA逻辑开关的污染物作用模式判别方法

技术领域

本发明属于电化学分析技术领域，具体涉及基于电化学DNA逻辑开关的污染物作用模式判别方法。

背景技术

环境中污染物种类多样，如重金属、多环芳烃、农药、抗生素等污染物在环境中可长期赋存，不仅对环境生态系统造成破坏，打破生态系统平衡，而且可以通过食物链进入人体，产生急性/慢性毒性、或与DNA发生作用产生“致畸、致癌、致突变”的作用，并导致疾病发生，从而危害人类身体健康。

研究表明，有机污染物进入人体后可以与DNA发生作用并影响DNA的复制过程，其中从作用方式主要包括：1)有机污染物直接插入到DNA碱基层中间，通过苯环与碱基发生π-π作用等；2)有机污染物直接与DNA的碱基发生氢键作用；3)有机污染物在体内酶作用下生成活性自由基，并与DNA活性位点发生作用，造成不可扭转的损伤。因此，探究DNA与有机污染物小分子作用模式，建立DNA与有机污染物小分子分析方法，对揭示污染物致病机理具有重要意义，对研究污染物DNA毒性、评价污染物食用风险、职业暴露风险等方面具有重要价值。

目前研究污染物与DNA作用模式多采用光谱法(如紫外-可见光谱法、荧光光谱法)、电化学DNA传感方法等，上述方法虽然可以研究DNA与污染物的作用模式，但存在一些不足，如光谱法样品需求量大、灵敏度不高，电化学方法难以独立辨识不同作用模式，只能揭示或部分揭示DNA与污染物的作用。

因此，探究DNA与有机污染物作用模式研究方法，提高方法的灵敏性、降低样品使用量、改进作用模式辨识性能，是DNA生物传感技术领域拓展的重要方向之一，对污染物毒理分析、暴露风险评估、环境样品分析等具有重要意义。

发明内容

本发明公开了基于电化学DNA逻辑开关的污染物作用模式判别方法，可用于分析DNA与有机污染物的作用模式，根据不同DNA结构特异性，及各检测单元电化学信号变化，实现DNA与污染物作用模式快速、准确、高灵敏、辨识分析。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

基于电化学DNA逻辑开关的污染物作用模式判别方法，包括如下步骤：

(1)设计逻辑开关DNA

根据DNA碱基互补原理及分子结构特征，设计不同的DNA；

(2)电极活化

对电极进行酸溶液活化和/或电化学活化，得到活化电极；

(3)DNA的活化

将不同的DNA分别溶解后加入活化剂孵育，得到不同的活化DNA溶液；

(4)制备电化学DNA逻辑开关

将不同的活化DNA溶液分别滴加于活化电极表面，孵育后淋洗、吹干，得到不同的电化学DNA逻辑开关；对不同的电化学DNA逻辑开关进行电化学测定，记录电化学信号S1；

(5)有机污染物作用模式判别

取待测有机污染物溶液滴涂于不同的电化学DNA逻辑开关表面，孵育后淋洗、吹干，进行电化学测定，分别记录电化学信号S2；

计算S

进一步地，不同的DNA均为hairpin DNA；

不同的DNA双链stem部分GC或AT碱基对占比、双链stem部分碱基对数、loop碱基数量不同和/或loop各碱基占比。

hairpin DNA序列短、价格低廉、制备方便、热稳定性强，具有单链DNA、双链DNA的结构，同时具备两种结构的特性，在降低检测的成本的同时，可呈现了更高的灵敏度高。

根据双链stem部分GC或AT碱基对占比不同的DNA电化学信号变化值大小比较，可判定其是否与GC或AT碱基层插入作用有关；

根据双链stem部分碱基对数不同的DNA电化学信号变化值大小比较，可判定其是否与碱基层插入作用有关；

根据loop碱基数不同的DNA电化学信号变化值大小比较，可判定其是否与碱基作用有关；

根据loop各碱基占比不同的DNA电化学信号变化值大小比较，可判定其是否与具体种类的碱基作用有关。

进一步地，不同的DNA包括双链stem部分GC碱基对占比＞80％的DNA和双链stem部分AT碱基对占比＞80％。

优选地，不同的DNA包括DNA1、DNA2、DNA3、DNA4；DNA1、DNA2的loop碱基数量5-25、DNA3、DNA4的loop碱基数量10-60；

优选地，DNA1、DNA2中双链stem部分碱基对数5-20，DNA3、DNA4中双链stem部分碱基对数3-15。

进一步地，hairpin DNA3’-端和/或5’-端修饰有活性官能团，活性官能团包括为氨基、羧基、巯基中的一种或几种。

进一步地，不同的DNA双链stem部分第一个互补碱基对均为GC碱基对。

进一步地，电极为丝网印刷金电极；

酸为硫酸、硝酸、盐酸中的一种或几种。

进一步地，活化剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐，工作浓度为500-5000μM。

进一步地，不同的DNA溶解后加入活化剂孵育30min；

不同的活化DNA溶液滴加于活化电极表面孵育1-10h；

待测有机污染物溶液滴涂于不同的电化学DNA逻辑开关表面孵育10-100min。

优选地，取浓度为1-500μΜ的待测有机污染物溶液5-500μL，滴涂于电化学DNA逻辑开关表面。

优选地，电化学DNA逻辑开关制备过程中，通过调控DNA浓度、孵育时间，6-巯基己-1-醇孵育时间等参数使不同的电化学DNA逻辑开关电化学信号相同。

进一步地，电化学测定方法为电化学阻抗法，

电化学活性物质为吡啶钌、六氨合钌、铁氰化钾、亚铁氰化钾中的一种或几种。

本发明提出了一种基于电化学DNA逻辑开关的有机污染物作用模式判别方法，建立、完善和发展了有机污染物与DNA作用模式判别技术，对揭示污染物致病机理具有重要意义，对研究污染物DNA毒性、评价污染物食用风险、职业暴露风险等方面具有重要价值。同时该方法具有快速响应、高灵敏、低成本、稳定性强、抗干扰性强、适用性强等特点，对开发新型DNA生物传感检测技术具有较好的借鉴价值。

本发明通过hairpin DNA的引入显著提升了DNA逻辑开关的灵敏性、降低了判别难度、提升了判别效率，为有机污染物与DNA作用模式研究提供了一种新的分析思路，具有重要意义。

附图说明

图1所示为实施例1活化丝网印刷电极效果图；

图2所示为实施例1电化学DNA逻辑开关DAE1电化学阻抗测定结果；

图3所示为实施例1待测样品A测定结果。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.设计逻辑开关DNA

DNA1核苷酸序列如SEQ ID NO.1：5’-TTTTTTTTTGGGCGCGGAGGGTGGCTGGAGGAGGAGCGCCC-3’，HO-(CH

DNA2核苷酸序列如SEQ ID NO.2：5’-TTTTTTTTTCTTAAAGGGGAGGGTGGCTGGAGGAGGATTTAAG-3’，HO-(CH

DNA3核苷酸序列如SEQ ID NO.3：5’-TTTTTTTTTGGGCGCGGAGGGTGGGTGGCTGGGTGGAGGAGGAGCGCCC-3’，HO-(CH

DNA4核苷酸序列如SEQ ID NO.4：5’-TTTTTTTTTCTTATATACATTTATCTATTTTATTCTTTATATATATAAG-3’，HO-(CH

2.活化丝网印刷金电极的制备

将丝网印刷金电极浸泡于硫酸-H

电极活化结果见图1。从图中可以看出，采样上述方法活化丝网印刷金电极，活化后的电极具有较高的电化学电流值，电极的氧化还原峰电位差较小，表明采用上述方法可以显著提升丝网印刷金电极的电化学性能。

3.DNA溶液的配制

将设计的各DNA(购买合成产品)样品小管离心3-5min，然后轻轻打开盖子，取新配置的Tris-NaClO

4.活化DNA溶液的制备

用Tris-NaClO

5.电化学DNA逻辑开关的制备

取10μL制备的2μM活化DNA1溶液，滴涂于活化丝网印刷金电极界面，孵育6h，取出，用Tris-NaClO

配制50mM KCl溶液，并以此溶液配制4mM K

进一步地，分别使用活化DNA2溶液、活化DNA3溶液、活化DNA4溶液代替上述活化DNA1溶液，进行电化学DNA逻辑开关的制备，制备过程中调控DNA浓度、孵育时间，6-巯基己-1-醇孵育时间，以达到与电化学DNA逻辑开关DAE1相同的组装效果(电化学阻抗信号S1)。获得的电化学DNA逻辑开关分别为DAE2、DAE3、DAE4。

6.污染物作用模式判别

将1μM待测样品A(2,3-萘胺)100μL，分别滴涂于电化学DNA逻辑开关DAE1、DAE1、DAE3、DAE4表面，孵育30min，用Tris-NaClO

测定电化学阻抗S2，然后分别计算各电化学DNA逻辑开关电化学信号变化值S

表1

待测样品A(2,3-萘胺)测定结果见图3。从图3可以看出，待测样品A使用不同的电化学DNA逻辑开关DAE1、DAE2、DAE3、DAE4测定呈现不同的检测信号，其检测信号关系为S

将5μM待测样品氯苯100μL，分别滴涂于电化学DNA逻辑开关DAE1、DAE1、DAE3、DAE4表面，孵育30min，用Tris-NaClO

待测样品氯苯使用不同的电化学DNA逻辑开关DAE1、DAE2、DAE3、DAE4测定呈现类似的检测信号，S

待测样品氯环己烷使用不同的电化学DNA逻辑开关DAE1、DAE2、DAE3、DAE4测定呈现类似的检测信号，S

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。