一种头孢菌素类抗生素原料药中特戊酰氯的含量检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种头孢菌素类抗生素原料药中特戊酰氯的含量检测方法。

背景技术

头孢菌素类抗生素具有抗菌谱广、杀菌力强、对胃酸及对β-内头孢菌素酶稳定、过敏反应少的特点，头孢菌素类抗生素具有如下结构：

头孢菌素类的传统合成方法是把母核和侧链经过化学方法结合，由于需要基团保护，合成过程需要经过混酐的工序，该工序需要用到特戊酰氯作为原料，因此最终产品中可能有特戊酰氯残留。特戊酰氯对眼、皮肤、黏膜和上呼吸道有强烈刺激性，虽然尚无足够证据表明酰氯对人体的致癌性，但由于其存在酰卤警示集团，可视为潜在遗传毒性杂质。遗传毒性杂质具有致突变性，较低浓度即可导致DNA损伤，如染色体断裂、DNA重组等，从而增加患癌风险，因此有必要建立药物中残留酰氯的痕量分析方法，对药物安全性进行监控。

现有技术公开了一种头孢唑啉酸中特戊酰氯的残留量检测方法，但其采用的原料药溶解方法存在特戊酰氯不稳定和原料药溶解性差的问题，且公开的头孢唑啉酸中特戊酰氯的检测限度不满足大多数头孢菌素类原料药的限度要求，因此需要建立一种前处理方法稳定可控，检测灵敏度高的分析方法用于测定头孢菌素类原料药中杂质特戊酰氯的含量。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种头孢菌素类抗生素原料药中特戊酰氯的含量检测方法，简单快速、灵敏度高。

为达到上述目的，本发明提供了一种头孢菌素类抗生素原料药中特戊酰氯的含量检测方法，包括如下步骤：

A)取特戊酰氯对照品，加入稀释剂混合，得到对照品溶液；

取头孢菌素类抗生素原料药，加入稀释剂混合，得到供试样品溶液；

B)采用顶空进样-气相色谱-质谱法分别对供试样品溶液和对照品溶液进行测定，外标法定量，测定供试样品溶液中特戊酰氯含量。

本发明优选的，所述稀释剂选自乙醇和N-甲基吡咯烷酮的混合溶剂。

所述乙醇和N-甲基吡咯烷酮的体积比优选为1:1。

本发明创造性的发现现有技术中采用的溶解方法，对照样品特戊酰氯溶解后稳定性差，且供试样品的溶解性差，不能准确进行测试，采用新的稀释剂乙醇:N-甲基吡咯烷酮＝1:1(v/v)能与对照样品反应生成稳定的特戊酸乙酯，且供试样品的溶解性有所改善。且对样品的处理方式不影响测试结果。

在一个优选实施例中，本发明所述的测试方法中对照品溶液的配制是精密称取特戊酰氯对照品，用稀释剂溶解并稀释，配制对照品储备液，精密量取上述对照品储备液，经稀释制得对照品溶液。

在一个优选实施例中，本发明所述的测试方法中供试样品溶液的配制是精密称取头孢菌素抗生素原料药，加稀释剂稀释，即得供试样品溶液。

然后采用顶空进样-气相色谱-质谱法对对照样品和供试样品进行检测，外标法定量。

优选的，所述顶空进样条件为：

顶空平衡温度为65～75℃，更优选70℃；定量环温度为75～85℃，更优选80℃；顶空传输线温度为85～95℃，更优选90℃；顶空平衡时间为20～25min，更优选20min。

进一步优选的，所述顶空平衡温度为70℃；定量环温度为80℃；顶空传输线温度为90℃。

本发明优选的，所述顶空平衡温度、定量环温度、顶空传输线温度依次递增10℃。

优选的，GC循环时间为25min。

本发明对于所述气相色谱-质谱法检测仪器不进行限定，包括但不限于Agilent7890B-5977B气相色谱质谱联用仪。

优选的，所述气相色谱的检测条件为：色谱柱为毛细管气相色谱柱；载气为氦气；采用分流进样模式；

升温程序：起始柱温37～43℃，更优选为40℃，保持4min，以20℃/min速率升温至215～225℃，更优选为220℃，保持5～10min，更优选为5min。

在一个优选的实施例中，所述色谱柱进一步优选为HP-1ms，规格为30m×0.25mm×0.5μm。

优选的，所述载气流速为1mL/min。

优选的，所述分流进样模式中的分流比为10:1。

本发明优选的，所述质谱的检测条件为：

进样口温度为195℃～205℃，更优选为200℃；MSD传输线温度为245℃～255℃，更优选为250℃；四极杆温度为150℃；离子源温度为230℃。

优选的，所述检测方法采用特征离子扫描模式，扫描特征离子m/z 57.1。

优选的，所述头孢菌素类抗生素包括第一、二、三、四代注射用头孢菌素及口服第一、二、三代头孢菌素中的任意一种或多种。

优选的，所述头孢菌素类抗生素包括第一、二、三、四代注射用头孢菌素。

优选的，所述头孢菌素类抗生素包括口服第一、二、三代头孢菌素。

优选的，所述头孢菌素类抗生素包括但不限于头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢硫脒、头孢克罗、头孢噻啶、头孢来星、头孢乙腈、头孢匹林、头孢替唑、头孢噻吩钠、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、头孢孟多、头孢克洛、头孢替安、头孢美唑、头孢丙烯、头孢尼西、头孢雷特、头孢噻肟钠、头孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松、头孢唑肟、头孢甲肟、头孢匹胺、头孢替坦、头孢克肟、头孢泊肟酯、头孢他美酯、头孢地嗪、头孢噻腾、头孢地尼、头孢特仑、头孢拉奈、拉氧头孢、头孢布烯、头孢米诺、头孢罗齐、头孢吡肟、头孢匹罗、头孢唑喃、头孢洛林、头孢吡普。

优选的，所述头孢菌素类抗生素为头孢氨苄。

在一个优选实施例中，本发明所述的检测方法中外标法是以峰面积计算头孢菌素类抗生素原料药中特戊酸乙酯浓度，计算公式如下：

其中，X为供试样品中待测物峰面积；

A

A

C

C

与现有技术相比，本发明提供了一种头孢菌素类抗生素原料药中特戊酰氯的含量检测方法，包括如下步骤：A)取特戊酰氯对照品，加入稀释剂混合，得到对照品溶液；取头孢菌素类抗生素原料药，加入稀释剂混合，得到供试样品溶液；B)采用顶空进样-气相色谱-质谱法分别对供试样品溶液和对照品溶液进行测定，外标法定量，测定供试样品溶液中特戊酰氯含量。

本发明对供试样品的前处理方式和气相色谱质谱条件进行了优化，解决了现有技术中杂质不稳定、原料药溶解性差、检测限不满足原料药限度要求的问题，达到了以下效果：

(1)本发明对原料药和杂质溶剂的选择，提高了特戊酰氯在溶剂体系中的稳定性，且一定程度上解决了原料药溶解性差的问题。

(2)本发明提供的检测方法，采用顶空进样方法，解决了原料药溶解性差的问题的同时，提高了待测样品的分离效率。

(3)本发明所采用的气相色谱质谱分析方法具有如下优点：操作简单快速、定性专属性强；定量准确；灵敏度高；方法稳定性、重复性好；实现了对头孢菌素类抗生素原料药中特戊酰氯的有效分离和检测，在系统适用性、专属性、重复性、线性范围、定量限、检测限、回收率、精密度、稳定性等方面完全符合标准。

附图说明

图1为空白试剂检测图谱；

图2为特戊酰氯对照品检测图谱；

图3为101007920-180129检测图谱；

图4为101007920-190805检测图谱；

图5为101007920-190520检测图谱；

图6为特戊酸乙酯线性曲线图；

图7为对比例1中特戊酰氯对照品气相检测图谱。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的头孢菌素类抗生素原料药中特戊酰氯的含量检测方法进行详细描述。

以下实施例以及对比例中所用原料药、试剂或仪器或辅料均可从市场购得。

实施例1顶空进样-气相色谱-质谱法测定头孢氨苄原料药中特戊酰氯的含量

1.样品：头孢氨苄原料购自华北制药，特戊酰氯购自阿拉丁，乙醇和N-甲基吡咯烷酮购自Scharlau。

2.主要仪器：Agilent 7890B-5977B气相色谱-质谱仪，配备顶空进样器。

3.气相色谱质谱主要参数：

色谱柱：HP-1ms，规格为30m×0.25mm×0.5μm；载气为氦气，载气流速为1mL/min；采用分流进样模式，分流比为10:1；

升温程序：起始柱温40℃，保持4min，以20℃/min速率升温至220℃，保持5min；

进样口温度为200℃；MSD传输线温度为250℃；四极杆温度为150℃；离子源温度为230℃；采用特征离子扫描模式，扫描特征离子m/z 57.1；

GC循环时间为25min；顶空平衡温度为70℃；定量环温度为80℃；顶空传输线温度为90℃；顶空平衡时间为20min。

溶液的配制

a)空白溶液(稀释剂)：乙醇:N-甲基吡咯烷酮＝1:1(v/v)；

b)对照品储备液：精密称取特戊酰氯25mg，置25ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置20ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；

c)对照品溶液：精密量取上述对照品储备液5ml，置10ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液；

d)供试样品溶液：分别称取头孢氨苄3批供试样品(样品批号分别为101007920-180129、101007920-190805、101007920-190520)置顶空瓶中，加稀释剂溶解，摇匀，即得供试样品溶液；

4.样品检测：

精密量取空白溶液、对照品溶液和供试样品溶液1μL进样，记录谱图，按外标法以峰面积计算特戊酸乙酯浓度。出峰情况如图1～图5所示，具体的，图1为空白试剂检测图谱；图2为特戊酰氯对照品检测图谱；图3为101007920-180129检测图谱；图4为101007920-190805检测图谱；图5为101007920-190520检测图谱。

由上述结果可知，本发明适用于头孢菌素类抗生素原料药中特戊酰氯含量的测定。由图2可知，相同测试方法下对照品特戊酰氯峰形良好，出峰时间为6.549min；由图3～图5可知，供试样品中同一保留时间特戊酰氯未出峰，说明本发明中的供试样品未检测出特戊酰氯，样品符合要求。

实施例2方法学考察

对实施例1的检测方法进行方法学验证，分别从线性范围、系统适应性、定量限、检测限、重复性、专属性、回收率、精密度、溶液稳定性几个方面进行验证，以下进行详细的说明。

1)线性关系考察试验

将实施例1配制的对照品储备液进行稀释，即得各级别线性溶液。特戊酰氯线性测试数据如下表1所示，以色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线图，如图6所示。

表1特戊酸乙酯线性结果

结果表明：特戊酰氯在50.170ng/mL～501.695ng/mL浓度范围内线性关系良好，特戊酸乙酯峰面积与浓度的线性回归方程为y＝20.703x-191.01，相关系数r＝0.995。

2)该方法的系统适应性

灵敏度溶液：精密量取实施例1配制的对照品溶液1ml，置10ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得灵敏度溶液；

取实施例1配制的空白溶液进样一针，对照品溶液重复进样5针，灵敏度溶液进样1针，计算特戊酸乙酯峰面积的RSD(相对标准偏差)和灵敏度溶液中杂质的信噪比。其结果如下表2所示。

表2系统适用性结果

结果表明：系统适用性溶液中，特戊酸乙酯峰面积RSD为3％(n＝5)，小于15％，未知杂质峰与特戊酸乙酯峰分离度均大于1.5，1针灵敏度溶液中特戊酸乙酯峰信噪比为14，大于10，系统适用性良好。

3)该方法的定量限和检测限

取实施例1配制的对照品溶液逐级稀释，至S/N≥10时溶液的浓度即为定量限浓度，至S/N≥3时溶液的浓度即为检测限浓度；定量限溶液连续进样6针，检测限溶液进样1针，其结果如下表3和表4所示。

表3定量限结果

表4检测限结果

结果表明：定量限溶液中，特戊酸乙酯6针信噪比均大于10，特戊酸乙酯峰面积RSD为3％(n＝6)，小于15％，定量限浓度为24.945ng/ml，定量限为0.5ppm。检测限溶液中，特戊酸乙酯峰面积为279.5，信噪比为8，大于3，检测限浓度为12.473ng/ml，检测限为0.2ppm。

4)该方法的重复性

重复性溶液：分别精密称取批次为101007920-190805的供试样品99.78mg、100.88mg、99.97mg、100.92mg、101.90mg、102.03mg，分别置顶空瓶，向其中加入实施例1配制的对照品溶液2ml，即得。平行配制6份重复性溶液，各进样一针，计算6份供试样品溶液中特戊酸乙酯含量RSD，其结果如表5所示。

表5重复性测试结果

结果表明：重复性溶液中，特戊酸乙酯含量RSD为2％(n＝6)，小于15％，重复性良好。

5)该方法的专属性

杂质定位溶液：即实施例1配制的对照品储备液；

专属性溶液：精密称取批次为101007920-190805的头孢氨苄原料101.17mg，置顶空瓶，加实施例1配制的对照品溶液2ml，摇匀，即得专属性溶液；

分别取空白溶液、杂质定位溶液、批次为101007920-190805的供试品溶液(50mg/ml)、专属性溶液各进样1针，其专属性结果如下表6所示。

表6专属性结果

结果表明：专属性溶液中，空白溶液、供试品溶液对特戊酸乙酯的检测无干扰，专属性溶液中未知杂质峰与特戊酸乙酯的分离度为3.6，大于1.5，专属性良好。

6)该方法的回收率

特戊酰氯杂质溶液(200ng/ml)：精密量取实施例1配制的对照品储备液4ml，置10ml量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

特戊酰氯杂质溶液(250ng/ml)：精密量取实施例1配制的对照品储备液5ml，置10ml量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

特戊酰氯杂质溶液(300ng/ml)：精密量取实施例1配制的对照品储备液6ml，置10ml量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

回收率溶液：

80％回收率溶液：称取头孢氨苄原料101.7mg、100.6mg、102.3mg，分别置顶空瓶，加入200ng/ml特戊酰氯杂质溶液2ml，摇匀，即得；

100％回收率溶液：称取头孢氨苄原料101.1mg、99.6mg、100.6mg，分别置顶空瓶，加入250ng/ml特戊酰氯杂质溶液2ml，摇匀，即得；

120％回收率溶液：称取头孢氨苄原料100.6mg、102.2mg、99.7mg，分别置顶空瓶，加入300ng/ml特戊酰氯杂质溶液2ml，摇匀，即得；

对照品溶液、批次为101007920-190805的供试样品溶液(50mg/ml)和各浓度回收率溶液各进样1针，计算头孢氨苄原料中特戊酸乙酯的回收率，其结果如表7所示。

表7特戊酸乙酯回收率结果

结果表明：回收率溶液中，特戊酸乙酯的回收率在105％-124％之间，RSD为6％(n＝9)，小于15％，回收率良好。

7)该方法的中间精密度

中间精密度溶液：由另一名实验人员在不同时间按重复性试验项下操作。精密称取批次为101007920-190805的供试品99.8mg、99.4mg、99.8mg、100.1mg、100.7mg、100.3mg，置顶空瓶，向其中加入对照品溶液2ml，即得中间精密度溶液。

平行配制6份精密度溶液，各进样1针，计算12份供试样品溶液中的特戊酸乙酯含量RSD，测试结果如下表8所示。

表8中间精密度测试结果

结论：12份供试品溶液中特戊酸乙酯含量的RSD值为4％(n＝12)，小于20％，中间精密度结果良好。

8)该方法的溶液稳定性

将对照品溶液和批次为101007920-190805的供试样品溶液(50mg/ml)在0h、2h、4h、8h、12h下分别进样1针，并计算各时间点下，对照品溶液和供试样品溶液中杂质峰面积的RSD，根据样品实际考察情况制定溶液的储存时间和条件，测得稳定性结果如下表9所示。

表9稳定性结果

结论：溶液稳定性中，在12h内，对照品溶液中特戊酸乙酯的峰面积RSD为6％，小于15％，供试品溶液中均未检出特戊酸乙酯，说明供试品溶液与对照品溶液在室温下放置12h内，溶液稳定性良好。

对比例1

参照对比文件《气相色谱法测定头孢唑啉酸中特戊酰氯的残留量》(杨铮，欧阳丽影，刘云飞，等)中的样品配制方法及色谱条件来测定头孢氨苄中特戊酰氯(限度为0.375ppm)的含量，具体实验情况及结果如下：

1、色谱条件：色谱柱为HP-1(30m×0.32mm，0.25μm)，柱温为70℃；进样口温度为200℃；检测器温度为250℃；进样量1μl，分流比为10:1。

2、供试品溶液配制：取头孢氨苄原料药约1.0g，精密称定，置10mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

3、对照品溶液配制：精密称取特戊酰氯51.00mg，置100mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释制成每1mL中含特戊酰氯0.51mg的混合溶液。

4、试验结果：①供试品溶液配制过程中，发明人发现头孢氨苄原料药在N,N-二甲基甲酰胺溶剂体系中不能完全溶解，溶液中可见明显的固体不溶物，无法进行检测；②将对照品溶液进行气相色谱检测，结果如图7。根据图7，未在对比文件相同的出峰时间检测到特戊酰氯(可能是特戊酰氯容易与水汽反应分解成特戊酸和HCl)。

因此，对比文件的样品配制方法及色谱条件不适用于本申请中头孢氨苄原料药的检测要求。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。