具有延长真皮成纤维细胞寿命、抗皮肤老化功能的发酵乳杆菌XJC48及其应用

技术领域：

本发明属于微生物领域，具体涉及具有延长真皮成纤维细胞寿命、抗皮肤老化功能的发酵乳杆菌XJC48及其应用。

背景技术：

自臭氧空洞出现至今，过量的紫外辐射(ultraviolet radiation，UV radiation)产生的生化效应已造成严重的环境危害,正严重影响环境以及人类的自身健康。皮肤是接受UV辐照最直接且面积最大的人体器官，过量的UV辐照对其造成的损伤最为严重。UV辐照导致的皮肤损伤被称为光老化，而光老化是导致皮肤细胞提早衰老死亡的主要因素，80％以上的面部老化均由光老化引起。光老化主要表现为皮肤松弛、下垂和皱纹加深，主要机制是光老化皮肤真皮层中的成纤维细胞数量减少，真皮细胞外基质(extracellular matrix，ECM)造成明显的损伤。真皮ECM最重要及含量最高的物质是胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖，这些蛋白的主要功能是维持皮肤的强度、弹性和水分。研究指出，光老化导致皮肤粗糙、松弛、起皱与皮肤中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)增加密切相关。MMPs是一类依赖于锌离子的内肽酶家族，其主要生理作用是降解ECM中的各种蛋白质成分。

UV辐照对皮肤的损害与波长密切相关：中波长UVB的诱变性很强，可以直接导致DNA和RNA损伤从而损伤皮肤细胞，长波长UVA是一种微弱的诱变剂，但它具有很强的穿透能力，可以影响真皮甚至皮下组织区域。当在相同辐照剂量时，暴露于UVB对皮肤的损伤比暴露于UVA大得多，但是因为太阳中UVA辐射实际上没有被大气层吸收所以皮肤受到UVA的损伤也是不可忽视的。

随着人们越来越关注皮肤健康，追求健康年轻的皮肤，美容护肤逐渐成为人们关注的热点，无时无刻的UV辐照成为皮肤衰老的主要元凶。目前抗光老化是国内外讨论的热点问题，近年来相关的研究呈指数型增长。因此，寻找有效、安全的修复皮肤UVA损伤、缓解炎症、延长光照后真皮细胞寿命、预防皮肤光老化方法具有重大的应用研究价值。

乳酸菌(Lactic acidbacteria，LAB)是一类利用糖类发酵产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌。乳酸菌被美国FDA认证为安全微生物，是与人类关系最为密切的微生物之一。乳酸菌可以保持肠道微生态平衡，抑制肠内有害菌生长，控制内毒素，减少腐败物质产生，制造营养物质，刺激组织发育等。近年来，乳酸菌的抗光老化活性被发现，文献报道了嗜酸乳杆菌KCCM 12625可以通过减少皮肤衰老过程中产生的MMP-1、MMP-9的表达，同时增加了前胶原蛋白的表达，减少真皮层胶原蛋白流失；干酪乳杆菌B9-1的胞外多糖作用于UV损伤的皮肤细胞后可下调MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-10表达水平，从而增强皮肤细胞中抗胶原酶、抗弹性蛋白酶活性，可有效减少光照后的胶原蛋白降解。上述研究证明益生菌可以通过降低MMPs、保护真皮成纤维细胞等方式修复紫外受损皮肤。

国内外对具有抗皮肤光老化功能因子的研究，目前主要集中于多肽类、多糖类和黄酮类物质。现今化妆品市场从植物提取物时代进入微生态护肤时代，在化妆品行业也出现许多与益生菌相关的护肤品。因此，寻找具有抗皮肤衰老能力的益生菌，可以延长皮肤真皮细胞寿命、修复紫外损伤的皮肤，有利于更安全有效地改善皮肤光老化问题，具有广阔的市场发展空间和较高的市场价值。

发明内容：

本发明的第一个目的在于提供一株发酵乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)XJC48。本发明的发酵乳杆菌XJC48在体内、体外均明显减低UV诱导的真皮成纤维细胞的MMPs表达水平、延长真皮细胞寿命，有效抗皮肤老化。

本发明的发酵乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)XJC48，其于2022年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62495。

本发明的第二个目的提供上述发酵乳杆菌XJC48在制备预防和/或治疗皮肤老化问题如皱纹增多、感染等产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种预防和/或治疗皮肤老化的产品，其含有发酵乳杆菌XJC48作为活性成分。

优选，所述的发酵乳杆菌XJC48是以发酵乳杆菌XJC48的活菌菌体、菌体破碎物、发酵液或发酵上清液的形式使用。

优选，所述的产品为食品、药品或保健食品。

进一步优选，所述的药品含有发酵乳杆菌XJC48、药物载体和/或药物辅料。

进一步优选，所述的食品是发酵乳杆菌XJC48发酵生产得到的乳制品、豆制品或果实制品；或所述食品包括含有发酵乳杆菌XJC48的固体饮料。

本发明的第四个目的是提供一种鉴别发酵乳杆菌XJC48的引物对，引物对包括如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明的第五个目的是提供一种鉴别发酵乳杆菌XJC48的方法，其是以上述引物对作为扩增引物对待测菌进行PCR反应扩增，如果扩增出479bp的产物，则为发酵乳杆菌XJC48，如果没有扩增出479bp的产物，则不是发酵乳杆菌XJC48。

本发明的第六个目的是提供了一种对样本中发酵乳杆菌XJC48进行定量检测的方法，采用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4作为qPCR扩增反应的引物进行qPCR反应扩增，在空白对照不存在荧光信号前提下，如果产生荧光信号，说明样品中含有发酵乳杆菌XJC48；如果不产生荧光信号，则样品中不含有发酵乳杆菌XJC48。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明中的发酵乳杆菌XJC48来源于阳光充足的新疆奶酪，为本土来源的优良菌株。

2、与传统抗光老化的化学药物相比，本发明具有对生态环境无毒副作用、无残留风险，绿色安全。

3、本发明使用方便、安全，在基因、细胞多水平证实均无对人体有潜在的危害，具有安全、高效的优点。

4、本发明的发酵乳杆菌XJC48是具有良好的抗皮肤老化作用的乳杆菌，具体体现为：

a、提高UVA损伤后人真皮成纤维细胞存活率49.62％；b、分别降低1.40倍、11.64倍UVA损伤后人真皮成纤维细胞中的MMP-1和MMP-2的表达水平；c、能调节IGF-1/Akt/FOXO细胞寿命调节通路，延长真皮成纤维细胞寿命；d、抑制皮肤致病菌。

因此，发酵乳杆菌XJC48在制备修复或治疗皮肤老化的产品(如食品、药品和护肤品等)中，具有巨大的应用前景。

Limosilactobacillusfermentum XJC48于2022年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62495。

附图说明

图1是乳杆菌延长皮肤真皮细胞寿命的能力评估；

a)图为不同UVA辐照剂量对人真皮成纤维(Human Dermal Fibroblasts，HDF)细胞存活率的影响；b)图为有效修复UVA损伤HDF细胞的乳杆菌发酵上清液；c)图为不同分子量发酵上清液对HDF细胞存活率的影响；其中NC为空白对照，MRS是模型组，XJC48、R60、C64是不同的发酵乳杆菌；

图注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与正常对照组(NC)原液组相比，

图2是乳杆菌发酵上清液对UVA损伤的HDF细胞因子的影响；

a)图为乳杆菌发酵上清液对UVA损伤的HDF细胞MMP-1表达水平的影响；

b)图为乳杆菌发酵上清液对UVA损伤的HDF细胞MMP-2表达水平的影响；

图注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与模型组(MRS)组相比，其中NC为空白对照，MRS是模型组，P69、P87、P27、Q5、R60、XJC48、C64和C60分别是不同的发酵乳杆菌。

图3是发酵乳杆菌XJC48的延长细胞寿命机制探究；

图a)是寿命调节通路；图b)是发酵乳杆菌对UVA损伤HDF细胞mRNA表达水平的影响；

图注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与模型组(MRS)组相比。

图4是发酵乳杆菌XJC48的基因组信息和安全性评价。

图5是发酵乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)XJC48的分子靶标验证；

图注M为DNAmarker，1为发酵乳杆菌XJC48经分子靶标序列(SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4)扩增后的PCR产物电泳图，2-94为其他乳杆菌经分子靶标序列扩增后的PCR产物电泳图。

图6是本发明对含发酵乳杆菌XJC48菌落数样品的检测灵敏度评价；

采用本发明提供的qPCR检测方案对含发酵乳杆菌XJC48菌落数样品进行定量检测：A.结果提示当样本中菌落浓度≥1×10

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS琼脂平板(g/L)：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母膏粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0ml/L、K

高产胞外多糖的MRS肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏粉5.0g/L、柠檬酸三胺2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、MgSO

实施例1乳杆菌的分离、保藏、鉴定

1.1益生菌的分离及菌种库保藏

采集中国新疆维吾尔自治区发酵食品作为样本，共204份。在无菌环境下，取0.1g奶酪样本加入10ml MRS液体培养基，震荡混匀后于37℃厌氧条件下富集培养24h，吸取0.5ml菌液做梯度稀释。加入生理盐水制成10

1.2乳杆菌的鉴定

采用细菌DNA提取试剂盒(Mabio，CHINA)进行细菌DNA提取，后采用2×PCR mix(Dongshengbio，CHINA)进行PCR扩增。PCR扩增引物采用16S rRNA基因通用引物，上游引物序列为27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；下游引物序列为1492R：5’-CTAC GGCTAC CTT GTT ACGA-3’。PCR反应条件为：预变性95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min30s共35个循环，72℃退火延伸10min。对PCR产物进行切胶回收，后进行一代测序(由苏州金唯智生物科技有限公司完成)。将获得的16S rRNA基因序列比对NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，结果显示与乳杆菌同源性最高。对于比对结果中Identity和Coverage均与已知乳杆菌相似度大于99％的菌株，可确定为乳杆菌。

经鉴定后，756株益生菌中有515株乳杆菌。其中本专利所要求保护的菌株16SrRNA基因序列如SEQ ID No.1所示(ATGCGCTTATTAGGATTAGACGTTGGCTCCAAGACGGTGGGGGTGGCGGAAAGCGATCCCTTGGGCTGGACGGCCCAAGCCGTGGAAATCATCCCCATTGATGAGGAAGCGGAGGTCTTTGGCTTAGAGCGGGTGGCGGAACTGGTTAAATCCCGTCAGGTCGCTGGCTTTGTGCTCGGCCTACCCAAGAACATGAATAACACGGAGGGACCACGGGTTGAAGCGGCACGCCATTACGGTGAGCTCTTGGAGGAGCGGTTTGGTTTGCCAATCGACTATCAAGATGAGCGCTTAACCACGGTCCAAGCCCACCGGATGTTAGTCGAAGAGGCTGACGTTTCCCGGCGCAAACAAAAAAAGGTGATCGACGAATTGGCGGCCACCTTAATCTTACAGAATTACTTGGATCGCCACGGTAAGTTGTGCGCCAAGCTATAG)。将该序列比对NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，结果提示其与发酵乳杆菌同源性最高，命名为发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)XJC48，于2022年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62495。

发酵乳杆菌XJC48的菌体呈短杆状，在MRS琼脂平板该菌菌落呈淡黄色圆形、边缘光滑，该菌在37℃厌氧环境下于MRS培养基中培养8小时即达稳定期，异型发酵，代谢葡萄糖产酸产气。

实施例2发酵乳杆菌XJC48的培养及乳杆菌发酵液的制备

将发酵乳杆菌XJC48从甘油管中接种至MRS琼脂平板上，于37℃厌氧培养48h，挑取单菌落接入高产胞外多糖的MRS肉汤培养基中，于37℃厌氧培养48h。采用10000g×4℃离心5min，获取发酵上清，采用1mol/L NaOH将发酵液pH调整至7.35-7.45。采用0.22μm滤膜过滤调整pH值后的发酵上清液，获得发酵乳杆菌XJC48发酵的无细胞上清液，冻存于-80℃待用。其他乳杆菌的发酵上清液也参照此方法制作。

实施例3发酵乳杆菌XJC48发酵上清抗皮肤细胞UVA损伤能力的评估

3.1细胞培养

人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts，HDF)细胞在37℃，5％CO

3.2建立UVA辐射的HDF光损伤细胞模型

采用人真皮成纤维细胞HDF(Procell，CHINA)作为研究对象，采用完全培养基对HDF细胞进行培养。将传代HDF细胞种于孔板中，当细胞增殖覆盖孔板80％面积时，进行UVA辐射。UV辐照的条件为：采用UVA灯管(川谷照明科技，中国)，分别给予0、15、30、45、60min的UVA照射，辐射剂量为0、0.819、1.638、2.457、3.276mJ/cm

3.3不同剂量UVA照射HDF细胞的存活影响

HDF细胞培养至对数期，收集细胞。96孔板内设正常对照、不同剂量处理组，以1×10

如图1a，随着UVA照射剂量的增加，HDF细胞的存活率下降。在UVA辐射时间45min，辐照剂量累计为2.46J/cm

3.4乳杆菌发酵上清液对UVA损伤的HDF细胞存活率的影响

HDF细胞培养至对数期，收集细胞。96孔板内设正常对照、模型、阳性对照和处理组，以1×10

培养24h细胞长至单层后，吸走培养基，用无菌PBS清洗3次，清除原有培养基后，每孔加入100μL无菌PBS。正常对照组用锡纸包裹，避免受到UVA照射。处理组给予45min的UVA照射，辐射剂量为2.46J/cm

照射后处理组每孔加入100μL体积分数10％乳杆菌发酵上清液的完全培养基(即将实施例2的上清液按照体积比1:9的比例加入到完全培养基中)继续培养，阳性对照组是加入100μL体积分数10％干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain Shirota)发酵上清液的完全培养基。模型组加入100μL体积分数10％MRS培养基继续24h后，用CCK-8法测定细胞存活率。

如图1b结果所示，乳杆菌的发酵上清液对UVA损伤的HDF细胞的存活率高于模型组，且有统计学意义。如图1c结果所示，为了进一步确定发酵乳杆菌中具有抗UVA能力的组分，对发酵乳杆菌发酵上清液用10kDa超滤膜进行分离，发现在发酵乳杆菌XJC48发酵上清液的<10kDa组分与原液具有同样水平的修复UVA损伤的HDF细胞的能力。

实施例4发酵乳杆菌XJC48发酵上清对UVA损伤的HDF细胞因子的影响

(1)6孔板内设正常对照、模型、阳性对照和处理组如实验例3中培养，细胞计数后将细胞悬液浓度调整至5×10

(2)培养24h细胞长至单层后，弃去培养基，用PBS清洗3次，清除原有培养基后，每孔加入2mL无菌PBS。空白对照组用锡纸包裹，避免受到UVA照射。处理组给予45min的UVA照射。

(3)照射后处理组每孔加入2mL含最小无毒性浓度乳杆菌发酵上清液的完全培养基、模型组每孔加入2mL体积分数10％MRS培养基、阳性对照组是加入2mL体积分数10％干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain Shirota)发酵上清液的完全培养基继续培养24h后，用0.25％含EDTA的胰酶收集孔内细胞，用等体积PBS清洗2次。

(4)使用HiPure Total RNA Mini Kit提取、HDF细胞的RNA。根据试剂盒的说明，使用Evo M-MLV逆转录酶从1μg总RNA合成cDNA。用于定量RT-PCR的MMP-1、MMP-2、IGF-1、Akt、FoxO-4和GAPDH的引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成(表2)。使用LightCycler96使用以下条件进行qPCR测定：95℃30s；95℃5s、60℃30s共40个循环；95℃5s、60℃60s、95℃1s。使用LightCycler96 SW软件分析数据得出扩增循环数值(cycle threshold,ct),按照ΔΔct方法计算得到各基因的表达水平。

表2RT-PCR所用引物

由图2可知，UVA损伤模型组(MRS组)显著上调了HDF细胞中的MMP-1、MMP-2mRNA的表达水平，而8株有抗UVA能力的菌株作用后大部分能显著下调MMP-1、MMP-2的mRNA表达水平。其中发酵乳杆菌XJC48的效果最为明显，下调MMP-1mRNA水平3.07倍、下调MMP-2mRNA水平10.14倍。结果表明，与其他乳杆菌相比，发酵乳杆菌XJC48的发酵上清液具有最强的降低UVA辐照导致HDF细胞中MMPs的表达水平的能力，具有较强的抗UVA损伤能力。

实施例5发酵乳杆菌XJC48发酵上清修复UVA损伤细胞的机制研究

5.1细胞样品制备

(1)6孔板内设UV组和XJC48组，均设3个实验平行孔，细胞如实施例3中培养，细胞计数后将细胞悬液浓度调整至5×10

(2)弃去培养基，用无菌PBS清洗3次，每孔加入100μL无菌PBS。阳性对照组用锡纸包裹，避免受到UVA照射。处理组给予45min的UVA照射。

(3)照射后每孔加入100mL的10％发酵乳杆菌XJC48发酵上清液的完全培养基继续培养24h后，放入-80℃冰箱保存。

5.2RNA抽提

转录组测序实验主要由上海美吉生物医药科技有限公司完成。采用TRIzol(Invitrogen，USA)法提取样本中的总RNA，并使用DNase I(TaKara，Japan)去除基因组DNA。分别用2100Bioanalyser(Agilent Technologies，USA)、ND-2000(NanoDropTechnologies，USA)方法检测RNA样品的质量，以保证使用合格的样品(OD260/280＝1.8～2.2，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，28S:18S≥1.0，total RNA>1μg)进行转录组测序。

5.3文库的建立和测序

RNA文库的建立采用TruSeqTM RNA sample preparation Kit(Illumina，America)试剂盒，并按说明书进行操作。经TBS380定量后，文库使用Illumina Nextseq测序平台(Illumina，America)进行高通量测序，测序读长为PE150。

5.4测序数据质量控制及比对分析

使用SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)去除接头序列、修剪低质量碱基等。使用软件HiSat2将质控后的原始数据与参考基因组比对，并对测序覆盖度、基因覆盖度等进行分析。使用软件edgeR进行差异表达计算；使用软件KOBAS进行KEGG PATHWAY富集分析。

在寿命调节通路中涉及胰岛素信号通路、P13K-Akt信号通路、叉头盒O类(Forkhead box O,FoxO)信号通路。目前研究表明这三个通路在调控衰老中的具有重要作用：抑制酵母和果蝇中胰岛素信号通路中的关键因子可以延长寿命；FOXO信号通路也被发现在全球百岁老人群体起着重要作用，而P13K-Akt信号通路连接胰岛素信号通路和FOXO信号通路。

如图3a所示，在寿命调节通路中，胰岛素信号通路是指胞外的类胰岛素一类生长因子(insulin-like growth factors-1,IGF-1)和胞膜上的受体(IGF-1R)结合，激活底物胰岛素受体亚基(Insulin receptor substrate,IRS)；PI3K-Akt信号通路是指上游被激活的IRS促进胞内磷脂酰肌醇激酶PI3K的活性，PI3K催化PIP3生成，从而激活Akt；在FoxO信号通路中在细胞核中的FoxO调控DNA转录，影响SOD、CAT的表达，从而解除ROS的毒性。若上游激活的Akt促进FoxO磷酸化，从而抑制FoxO入核，抑制其功能。

本研究的转录组测序结果表明，在发酵乳杆菌XJC48干预之后，不同程度地激活了HDF细胞中的涉及胰岛素信号、PI3K-Akt信号和FoxO信号的寿命调节通路中的多个重要基因，包括IGF-1和P13K基因表达量显著增加，推测发酵乳杆菌XJC48通过调节IGF/P13K-Akt通路而影响HDF细胞寿命。

如图3b，发酵乳杆菌XJC48使UVA损伤的HDF细胞中IGF-1的mRNA转录水平上调4.76倍、Akt上调了1.82倍、FoxO-4上调了3.82倍。这一结果验证了上一节差异基因涉及的信号通路分析的结果，表明发酵乳杆菌XJC48可通过调节细胞寿命通路IGF-1/Akt/FoxO通路而修复UVA对HDF造成的损伤。

实施例6发酵乳杆菌XJC48对皮肤常见致病菌的抑菌效果评价

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等致病菌是导致皮肤炎症、皮肤感染的常见致病微生物。采用牛津杯法评估发酵乳杆菌XJC48的抑菌效能，具体操作如下：将大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、蜡样芽胞杆菌ATCC 14579的单菌落分别接种于LB液体培养基(环凯，中国)中，37℃，200r/min培养6h，调节浓度至1×10

实施例7发酵乳杆菌XJC48基因组及表型的安全性评价

7.1乳杆菌的基因组特征及安全性评估

采用Illumina Nextseq 550二代测序及Nanopore MinION三代测序平台对515株乳杆菌进行全基因组测序。细菌基因组DNA提取方法同前。二代测序采用AMT Rapid DNA-Seq Kit for Illumina(CISTRO,CHINA)建库，采用High Output v2.5 kit(Illumina,USA)试剂盒测序。三代测序采用Rapid Barcoding Sequencing Kit(Nanopore,UK)建库，后采用R9.4.1芯片(Nanopore,UK)测序。下机数据分别采用Trimmomatic(v0.39)及Filtlong(v0.2.0)软件进行质控，后采用Unicycler(v0.4.8)软件进行组装。组装后乳杆菌的基因组采用Quast(v5.0.2)软件进行基因组质控评估，采用Abricate(v0.8.13)软件查找并注释毒力基因及耐药基因。

经测序获得图4发酵乳杆菌XJC48基因组完成图，对发酵乳杆菌XJC48进行测序后发现该菌株基因组总长度1,910,530bp，GC含量为51.71％。采用prokka软件注释发现XJC48基因组一共有2118个蛋白质编码基因、58个tRNA基因和7个rRNA基因。采用Abricate软件比对VFDB(Virulence Factor Database)、ARG-Annot(Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation)、CARD(the Comprehensive Antibiotic Research Database)、Resfinder数据库，均未发现发酵乳杆菌XJC48含有毒力基因或耐药基因。

7.2乳杆菌对抗生素的敏感性

根据欧盟食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)标准，使用微量肉汤稀释法检测本专利发酵乳杆菌XJC48对8种抗生素的敏感性。该8种抗生素为：氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素。将生长至对数生长期的乳杆菌悬液调整至0.5麦氏浊度，后加入不同浓度的抗生素稀释剂(浓度从0.5-64μg/mL)，37℃厌氧培养48h。48h后读取菌株对每种抗生素的最小抑菌浓度(minimal inhibitconcentration，MIC)，发酵乳杆菌XJC48对8种抗生素的MIC如表3，可知该菌对EFSA规定的8种抗生素菌敏感。

表3发酵乳杆菌XJC48对抗生素的MIC

7.3乳杆菌的溶血试验

在无菌环境下，用接种环接种目标乳杆菌于血平板上，37℃培养48h，观察溶血现象。图3b可知，48h后观察发酵乳杆菌XJC48菌落周围未出现溶血现象，而阳性对照溶血葡萄球菌ATCC6538菌落周围出现透明溶血环，表明发酵乳杆菌XJC48不具有溶血风险。

实施例8发酵乳杆菌XJC48的特异分子靶标识别

8.1乳杆菌的特异分子靶标挖掘

采用Prokka(v1.11)、Roary(v3.11.2)软件对发酵乳杆菌XJC48及NCBI数据库内其他94株发酵乳杆菌及其它1400株乳杆菌的全基因组进行泛基因组分析。获得核心基因组后，采用Gubbins(v2.4.1)识别包含碱基取代密度较高的基因。基于泛基因组分析获得的发酵乳杆菌XJC48有别于其它乳杆菌的特异序列。采用Oligo(v7)软件针对特异序列进行引物设计，获得识别该菌的特异性分子靶标序列引物SEQ ID No.3(5’-CTTGGAAGTGCTGCGTCATT-3’)和SEQ ID No.4(5’-CTCCACAGAAAAGGCGTGTG-3’)。

8.2.乳杆菌特异分子识别靶标有效性验证

采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)及琼脂糖电泳验证发酵乳杆菌XJC48的特异分子识别靶标序列的有效性。检测模板为细菌的DNA，DNA提取方法同前。

PCR反应体系配置如下：

以下为PCR反应条件：

PCR结束后取5-10μl PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳。若发酵乳杆菌XJC48能在479bp处形成单一特异条带，而其他乳杆菌不能形成479bp的单一条带，则说明该对靶标具有良好识别发酵乳杆菌XJC48的效能。

如图5和表4所示，除发酵乳杆菌XJC48的DNA加入引物SEQ ID No.3和SEQ.ID No.4扩增后形成479bp的特异性扩增产物外，其余乳杆菌分离株均未见特异扩增产物形成。结果提示分子靶标序列SEQ ID No.2(ATGCAAACGGATAATGAAAAGTACAATGAAACTGTACAGCCGAATACTGCTTTCTTAAATGAACTTAAAGCAAAGCTGCCTGAATTCTTTACCAAGGAAGGATCTTTTGATTTAGATAAGTTTAGGAACCAACTAAAAGATAAGAATATTAATGAGCTGAGTGAGGGTTATCAGCTAGATTTCATTGGTAAGGATTATGCTCGTCGCCAGGCTGGTGAAATGCCGAGTACTGTAATTGTCCCCGATGAAAAGCAAAATCAAGGTGAAGGAAAAGATAGTAAGAACCTCTTTTTCACCGGTGATAACTTGGAAGTGCTGCGTCATTTGCAAAACAATTATCAAAATAAGATTGATGTTATTTACATTGATCCGCCGTATAACACAGGCAGCGATGGCTTTGTTTATCCAGATTCTTTTGAATACAGTGATGAGAAACTAAAAGATATGTTTGGCCTTGATGATGATCAAGTTGAACGATTGAAGAGTATTCAGGGAAAAGCTAGTCATTCTGCTTGGCTAACCTTTATGTATCCAAGATTATCTTTAGCGAAAAAGTTGTTATCGGGTGAAGGAATTATCTTCATTTCTATAGATGATAATGAAAAAGACAATTTATCAGAAATTATGGATGAATTGTATGGTGAAAGTAATTTTATAACTAATTTTGTTTGGGAGAAAAAGAAAAAACCGTCTTTTTTAAACGGAAATGTAGGTCAAAAGTTTGAATATGTAGCGTGTTATTCAAAAAATAGAAAAAAAACACACGCCTTTTCTGTGGAGCAGACGGAAAGAGGAAAAAAGTATCCGTTTAATAATGCAGGAAATTCAGAAAGCACTTTAACATTTCCTAAAAATACTGTTAATTTTACTAAAATTAAAAACAACATTATCAAAAGTCAAGATATGTCTGGCGGCAACATTAAAACGATACTTTTAAATGATGTAATAATAAGCAATCATAAAAATACTAATGCTTTTTCACTTAAGGGAGAATGGAGATACTCTCAAGATAAATTAGATGATTTACTTTCTAATGGTGCCCAAATAACGATAAGCAGCGTTCCGTTCCGTCCGAATTTAGTTAAAAACGGCGGAGAAACTAAGAAAATGCATAACTTATTAACACTGAGTCATTATCCTGTTGGTTCTAATGAGGATGCTACAAAAGAATTAATGAGCTTATTGGGATTAAATATTTTTGATTACAATAAACCTAGTTCATTAATTAAATTGTTAGTTAAAAGTTATACATATAATATGAAACATGCAATTGTTATGGACTTCTTCGCTGGCTCTTCTACTACTGCCGATGCAGTCATGCAACTAAATGCAGAAGATGATGGTCATCGTAAATTCATCATGGTGCAGAAACCTGAAAAAACGTATGAAGTTGATAAAGAAACAGGTGAAGCTAAATTAGATAAGAGCGGCAATAGAATTCCTACAAAGGGCGGTAAAGCAGCTTATGAAGCTGGGTATATGACCATTGATCCAATTTCACGCGAACGTATCCGTTGTGCTGCTAAAAAGATCCGCGAAAATAACGAACTAACGTTACCAAAGGATTTTGATGGAAGCTTCAAACACTATCGAGTAGTTAAGCCAGTCAAACAAACACTCGAAGAAATTGAAGACTTCGATCCAAATAATATTAATTTGTTTACTGATATGGTGGATGGCTTCTCTAGTCAGACTTTAGGTATTGATGGGGATGCTACAGGTGAAGAAACAATTCTGACGACCTGGCTTGCTAAAGATGGTTATCCATTTGATGCTAATGTTGAAGATGTTAACTTTGGAAGTTACATTGCCCATAAAGTTGAAGATAATCGTCTGTACTTAATTAAAGATCATTGGGGAGCAGAACAGACTAAAGAATTGTTGAACCAACTGGGTACGCATCAATTAGAAGTCCAAAGTGTCGTTATTTTTGGCTATTCCTTCAATATTGCTGAATTGCGCGAATTAGAGAATGGTCTG)能特异的鉴别发酵乳杆菌XJC48与其它乳杆菌。

2-94的乳杆菌菌株信息如下表4所示。

表4靶标扩增结果

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实施例9发酵乳杆菌XJC48特异分子识别靶标的定量检测方法

本实施例8提供了一种对样本中发酵乳杆菌XJC48进行定量检测的方法，采用SEQ.ID No.3及SEQ.ID No.4作为qPCR扩增反应的引物，具体操作如下：

9.1模板DNA制备

按实施例1方法提取含发酵乳杆菌XJC48样本中的微生物DNA，作为待检测模板；

9.2qPCR检测体系及扩增程序

qPCR检测所需的DNA模板制备方法采用实施例1中的组织微生物DNA提取方案执行。HP的qPCR反应体系配置如下：

以下为qPCR扩增程序：

9.3qPCR结果读取

利用Roche

9.4新检测方案对发酵乳杆菌XJC48检测灵敏度评价

应用生理盐水将浓度为1×10

绘制标准曲线：以样品中发酵乳杆菌XJC48浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为发酵乳杆菌XJC48定量检测的标准曲线。标准曲线如图6所示，引物对所述发酵乳杆菌XJC48的拟合标准曲线为y＝-3083x+37.77，相关系数R2为0.9878。

虽然本发明已将较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的内容为准。