荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的制备方法及其应用

技术领域

本发明专利涉及光学传感技术领域，尤其是指一种荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的制备方法及其应用。

背景技术

随着生活水平的的提高，人们的生活方式和饮食习惯也发生了很大改变。真菌毒素是各种真菌在适当温度和湿度下产生的有毒次级代谢产物。食品原料在食品工业的每一个过程中，包括种植、生长、收获、储存、运输和加工，都很容易受到真菌毒素的污染。如果真菌毒素进入食物链，将对人类健康构成巨大威胁。严格控制食品和饲料中的真菌毒素污染已成为世界各地生产商、监管机构和研究人员的重要目标。另外，以心脑血管疾病、恶性肿瘤、慢性呼吸系统疾病和糖尿病为代表的慢性病严重影响了人们的身心健康，也带来了沉重的经济负担。慢性病往往发病比较隐匿，在早期很少有患者会表现出明显的症状，即使表现出轻微症状也容易被忽视。发现后尽早治疗、干预，才能更有效地控制病情发展，在更大程度上减轻对患者健康的危害，因此早期诊断对患者的健康格外重要。

因此，提供一种更方便、灵敏度更高的早期诊断检测方法显得很有必要。

发明内容

在各种检测技术中，光学检测已被证明是最方便的方法。其中，荧光共振能量转移(FRET)系统具有高灵敏度和选择性，是构建荧光免疫传感器经常采用的策略。石墨烯量子点(GQDs)具有优越的比表面积和化学稳定性、更易于功能化、生物相容性好、更清晰和可调节的光致发光(PL)，在生物成像、环境分析、荧光传感器和光催化等领域已经超过了传统的荧光团和半导体量子点。金属增强荧光(MEF)是一种广泛应用于增强荧光强度的技术，这对于提高检测方法的灵敏度具有重要影响。但将具有MEF效应的GQDs作为供体应用于荧光共振能量转移体系还未见报道。

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：

步骤1)：Ag@SiO

步骤2)：Ag@SiO

步骤3)：抗体-Au NPs探针的制备：用0.1mol/L K

步骤4)：荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的制备：将目标溶液加入到步骤3)制备的抗体-Au NPs探针溶液中，混合均匀，并在30-40℃下反应20-60min，添加步骤2)制备的Ag@SiO

用荧光分光光度计测量在无抗原情况下，空白品的荧光强度记为F

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤1)中，Ag@SiO

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤1)中，N,S-GQDs是通过如下方法制备得到的：称取GO粉末和L-半胱氨酸混合，加入超纯水，超声分散后，再加入氨水，超声分散后，转移到高压釜中，在200℃加热4-10h，冷却到15-35℃后，再次超声分散10-60分钟，随后用0.22μm的滤膜过滤掉黑色沉淀，过滤后的上清液用500Da透析袋透析36-60h，所得透析液冷冻干燥20-30h，得到淡黄色的N、S共掺杂的石墨烯量子点粉末(N,S-GQDs)，将N,S-GQDs粉末溶于水中超声分散配置成浓度为10mg/mL的N,S-GQDs悬浮液备用。

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤1)中，所述氨基化的Ag@SiO

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤3)中，Au NPs溶液是通过如下方法制备得到的：取0.1mg/mL HAuCl

在本发明的一个或多个实施例中，Ag@SiO

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤4)中，所述的抗体-Au NPs探针的浓度为10-50μg/mL，所述一定时间为0.5～4h，一定温度为15～55℃；所述的抗体-Au NPs探针溶液和Ag@SiO

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤4)中，荧光分光光度计测量参数为：激发波长为320nm，激发和发射狭缝宽度为10.0nm。

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤2)中抗原为心肌肌钙蛋白I、β淀粉样多肽1-42、甲胎蛋白、细胞角质素片段抗原21-1、高尔基体蛋白73、前列腺特异性抗原、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、葡萄球菌肠毒素A中的一种或多种与BSA偶联的抗原；所述步骤3)中抗体为所述步骤2)中抗原所对应的抗体，所述步骤4)中的目标溶液为含有心肌肌钙蛋白I、β淀粉样多肽1-42、甲胎蛋白、细胞角质素片段抗原21-1、高尔基体蛋白73、前列腺特异性抗原、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、葡萄球菌肠毒素A中的一种或多种的物质。

在本发明的第二方面，本发明提供一种在本发明第一方面所述的制备方法制备得到的荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器在人血清样本中生物标志物的检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明以氧化石墨烯和L-半胱氨酸为原料，通过高温水热反应合成了氮、硫共掺杂的石墨烯量子点(N,S-GQDs)，采用Stober法通过控制正硅酸乙酯的量来控制SiO

2、本发明以Ag@SiO

3、本发明以Ag@SiO

附图说明

图1荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器检测目标物的原理示意图；

图2A为N,S-GQDs的透射电镜图,图2B为Ag NPs的透射电镜图，图2C为Ag@SiO

图3N,S-GQDs和Ag@SiO

图4Ag@SiO

图5a为Au NPs的吸收光谱图，图5b为Ag@SiO

图6本发明实施例2中荧光强度的变化ΔF与cTnI浓度的线性关系示意图；(ΔF通过结合产物的荧光强度减去空白品的荧光强度中得到)

图7本发明实施例3中荧光强度的变化ΔF与OTA浓度的线性关系示意图；(ΔF通过结合产物的荧光强度减去空白品的荧光强度中得到)

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

实施例1

一种Ag@SiO

(1)N,S-GQDs的制备：称取15mg GO粉末和45mg L-半胱氨酸混合，加入15mL超纯水，超声分散30min后，再加入150μL氨水，超声分散30min后，转移到内衬聚四氟乙烯的高压釜中，在200℃加热6h，冷却到室温后，再次超声分散30分钟，随后用0.22μm的滤膜过滤掉黑色沉淀，过滤后的上清液用500Da透析袋透析48h。所得透析液冷冻干燥24h，得到淡黄色的氮、硫共掺杂的石墨烯量子点粉末(N,S-GQDs)。将N,S-GQDs粉末溶于水中超声分散配置成浓度为10mg/mL的溶液备用，所得到的N,S-GQDs的透射电镜见附图2A，其荧光光谱图见附图3a。

(2)Ag@SiO

(3)Ag@SiO

(4)金纳米颗粒的合成：取100mL 0.1mg/mL HAuCl

实施例2

荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器检测目标物的原理示意图如图1所示。

一种荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的制备方法及应用于检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)，其特征在于，包括以下几个步骤：

(1)Ag@SiO

(2)Anti-cTnI-Au NPs探针的制备：用0.1mol/L K

(3)荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器对于心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量的测定

标准曲线的绘制：在2mL离心管中，添加1.0mL 20μg/mL的Anti-cTnI-Au NPs溶液和25μL不同浓度的cTnI(0、0.5、10、20、50、100、500、1000pg/mL)，彻底混合，并在37℃下反应30min。然后，添加50μLAg@SiO

本实施案例中检测cTnI的线性范围为0.5pg/mL-1.0ng/mL，检出限为0.042pg/mL，线性关系见附图6。如表1所示，荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器比以前大多数用于检测cTnI的方法更灵敏，具有更宽的检测范围和更低的检测限。

表1比较目前的方法与之前报道的检测cTnI的方法

(4)荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器对于cTnI样本的检测

为了进一步说明荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的实际应用，将三种不同浓度的cTnI(100，250,500pg/mL)的标准品加至空白人血清样品，并用该方法检测。获得了人血清样品中加标cTnI的荧光响应，结果列于表2，cTnI在三种不同浓度下的回收率在97.06％到105.88％之间，这种良好的回收率和较低的相对标准偏差表明，该方法可以进一步发展用于临床检测cTnI。

表2人阴性血清中不同浓度cTnI抗原的回收率(n＝3)

实施例3

一种荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的制备方法及应用于检测赭曲霉毒素A(OTA)，其特征在于，包括以下几个步骤：

(1)Ag@SiO

(2)Anti-OTA-Au NPs探针的制备：用0.1mol/L K

(3)荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器对于赭曲霉毒素A(OTA)含量的测定

标准曲线的绘制：在2mL离心管中，添加1.0mL 20μg/mL的Anti-OTA-Au NPs溶液和25μL不同浓度的OTA(0、0.5、1、5、10、100、500、1000pg/mL)，彻底混合，并在37℃下反应30min。然后，添加50μL Ag@SiO

本实施案例中检测OTA的线性范围为0.5pg/mL-1.0ng/mL，检出限为0.094pg/mL，线性关系见附图7。如表3所示，荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器比以前大多数用于检测OTA的方法更灵敏，具有更宽的检测范围和更低的检测限。

表3比较目前的方法与之前报道的检测OTA的方法

(4)荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器对于OTA样本的检测

为了证明荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的实际应用价值，我们测定了三组不同浓度的OTA(2.5，25,100pg/mL)，每组3个重复。结果列于表4，OTA在三种不同浓度下的回收率在97.96％到110.36％之间，这种良好的回收率和较低的相对标准偏差说明该荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的可以用于实际样品中OTA的检测。

表4不同浓度OTA的回收率(n＝3)

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。