一种糖化血红蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种糖化血红蛋白的制备方法及 其应用。

背景技术

糖化血红蛋白(HbA1c)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类(主要 指葡萄糖)通过非酶反应相结合的产物。形成糖化血红蛋白的非酶反应具 有持续、缓慢、不可逆的特点，因此糖化血红蛋白的含量是由过去的而非 即时的血糖浓度决定的，与检测前是否空腹、是否注射胰岛素、是否服用 降糖药物等因素无关。通常认为，糖化血红蛋白浓度可有效地反映过去8～12 周平均血糖水平。糖化血红蛋白由HbA1a、HbA1b、HbA1c组成，其中HbA1c占约70％，且结构较为稳定，临床上常用作糖尿病控制的监测指标，其浓度 用占成人血红蛋白的百分比表示。

糖化血红蛋白水平可作为糖尿病的诊断检测手段。中国2型糖尿病防 治指南(2020年版)将“糖化血红蛋白”首次正式纳入到糖尿病诊断标准 中，糖化血红蛋白≥6.5％可作为确诊糖尿病的依据。但低于6.5％的结果并 不能排除糖尿病的可能性，还应该参考葡萄糖测定的结果。若糖化血红蛋 白>9.0％，说明患者持续存在高血糖。

另外，糖化血红蛋白水平可作为评估并发症发生风险的检测手段。有 研究表明，平均HbA1c每减少1％，与糖尿病相关的死亡风险降低21％，心 肌梗塞降低14％，微血管并发症降低37％。HbA1c水平每降低一成，则视网 膜病变风险降低43％-45％。糖化血红蛋白水平作为筛查糖尿病高危人群的检 测手段。由于HbA1水平上升带来的风险具有连续性，那些HbA1c水平低于 糖尿病阈值，但≥6.0％的人应该得到有效的预防干预。但是HbA1c水平低 于6.0％的患者可能也处于危险之中。妊娠期糖尿病的管理中，仅仅控制血 糖是不够的，还应该对糖化血红蛋白水平进行控制，对预防子痫、巨大儿、 畸胎、死胎有积极作用。

临床实验室常规测定HbA1c的方法通常分为两大类：—类是根据糖化 血红蛋白与非糖化血紅蛋白所带的电荷不同，如电泳法、离子交换色谱法； 另一类是根据糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白的结构不同，如免疫法、亲 和层析法。当血红蛋白变异体存在时，不同的检测方法所测定的HbA1c结 果可能不同。

每种检测方法每种方法都有各自的优势，如不受某些成分影响、重复 性好、快速等，但也有方法会受到诸如血液系统疾病、血红蛋白变异体、 氨甲酰化血红蛋白等因素的干扰。但许多临床检验工作者对HbA1c检测方 法的干扰因素了解不多，严重影响了HbA1c检测结果的准确性。

发明内容

本发明提供了一种糖化血红蛋白的制备方法及其应用，以解决现有技 术中糖尿病检测的技术问题。

本发明为解决其问题所采用的技术方案是：

一种糖化血红蛋白的制备方法：

采用人工合成SEQ ID NO.1所示DNA序列，去掉N末端信号肽，设计 引物，用常规PCR方法(载体pET-28a为模板)扩增得到HbA1c基因的片段， 得到重组质粒pET-28a-HbA1c，将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α，在含 有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过PCR鉴定筛选出 阳性克隆，测序结果表明重组的HbA1c片段与设计的序列完全一致。

重组质粒经测序验证后，转化进入大肠杆菌(BL21)，在含有氨苄青 霉素的LB培养基中培养，可在LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴 定，小量制备质粒，用双酶切PCR鉴定筛选出阳性克隆，最终获得含有HbA1c 的重组质粒工程菌。

将重组质粒工程菌分别于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培 养，A600达到0.5-06之间，然后加入终浓度为0.5mM的Isopropylβ -D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)于37℃诱导4h，诱导完成后的菌 液4,000rpm离心10min，收集菌体，并用PBS洗涤沉淀；PBS重悬沉淀 后置于冰浴中，将大量表达得到的菌体，经超声破碎后离心，再进行包含 体洗涤，洗涤完成后用His Trap FF纯化柱将蛋白进行纯化(按照产品说 明书进行试剂配制和纯化)。最终获得的HbA1c重组蛋白,用SDS-PAGE电 泳进行分析，用BCA蛋白定量试剂盒测得其浓度。

基于同一种设计思路，本发明还提供了一种糖化血红蛋白抗体的制备 方法，具体包括以下步骤：S1.按照上述糖化血红蛋白的制备方法获取HbA1c 重组蛋白；S2.HbA1c重组蛋白的表达；S3.鼠抗HbA1c杂交瘤细胞株的建立， 采用鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞按细胞数2～5:1进行混合，采用促融剂使 鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合得到融合细胞，将融合细胞在含有HbA1c 重组蛋白的HAT选择性培养液A中进行培养，8～15天后筛选出能与HbA1c蛋白反应的阳性杂交瘤细胞；S4.利用通过S3获得的阳性杂交瘤细胞分泌 糖化血红蛋白抗体。

上述SEQ ID NO.1的具体序列为

atggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaac gtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggctgctggtggtctacccttggacccagaggt tctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggc tcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggc acctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcaggc tcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattcaccccaccagt gcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaatgccctggcccacaagtatcactaa；

SEQ ID NO.1所对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，具体如下：

MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPK VKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH。

进一步地，在S3中，使鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞按细胞数4:1进行 混合。

进一步地，HAT选择性培养液A为Corning cellgro公司的、型号为 25-046-CIcorning cellgro的细胞培养液。

进一步地，S4包括以下步骤：S4.1向小鼠的腹腔注射降植烷，注射量 为0.5ml/只；S4.2 7-10天后，向小鼠的腹腔注射1×10

进一步地，S4.4的具体操作为：向5ml腹水重悬液中逐滴加入5.0mlPBS； 混合均匀后，再逐滴加入10ml饱和硫酸铵溶液，继续缓慢搅拌30min；静 置2h后离心15分钟，弃去上清，沉淀物用PBS重悬，然后再将该重悬液 过0.22μm滤膜。

进一步地，S4.5的具体操作为：用结合缓冲液、洗脱缓冲液及再生缓 冲液将选定的纯化柱进行平衡，然后将腹水重悬液以1ml/min的速度上样， 上样完成后用结合缓冲液平衡，再用洗脱液洗至基线位置，收集抗体峰溶 液，抗体峰溶液中含有糖化血红蛋白单克隆抗体；用PBS缓冲液将抗体峰 溶液进行透析，将由此得到的糖化血红蛋白单克隆抗体分装，置-70℃冻存。 基于同一种设计思路，本发明还提供了一种糖化血红蛋白抗体，该糖化血 红蛋白抗体由上述制备方法获得。

基于同一种设计思路，本发明还提供了一种试剂盒，其包括ELISA微 孔板，ELISA微孔板包被有上述的糖化血红蛋白抗体。

进一步地，糖化血红蛋白抗体用PBS缓冲液进行封闭，且PBS缓冲液 含有5％BSA和0.2％蔗糖。

进一步地，还包括检测抗体，检测抗体为已标记HRP的抗HbA1c检测 抗体冻干粉。

进一步地，还包括10ml终止液，终止液含有硫酸，且其浓度为2mol/L。

综上所述，本发明提供的糖化血红蛋白抗体的制备方法及具有其的试 剂盒相比于现有技术，至少具有以下技术效果：

1)本发明的杂交瘤细胞株糖化血红蛋白分泌的单克隆抗体具有良好 的特异性，以此为基础建立的检测糖尿病的体外诊断试剂盒，为临床与实 践的不同需要提供了建立快速、特异、敏感的检测方法；

2)本发明所述的定量检测糖尿病的试剂盒不仅检测速度快、血液标本 用量少，且采用蛋白芯片法检测糖化血红蛋白抗体与其他相似抗体的交叉 反应，检测结果的灵敏度高，为临床医师提供更准确的检测结果，极大改 善了糖尿病的监测与管理。

具体实施方式

为了更好地理解和实施，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的 技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所 使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。

实施例一

在该实施例的技术方案中，糖化血红蛋白的制备方法包括以下步骤：

1、抗原(HbA1c重组蛋白)的制备

包括以下步骤：

1)、pET28a-HbA1c重组载体的构建

人工合成SEQ ID NO.1所示DNA序列，去掉N末端信号肽，设计引物， 用常规PCR方法(载体pET-28a为模板)扩增得到HbA1c基因的片段，得到 重组质粒pET-28a-HbA1c，将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α，在含有氨 苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过PCR鉴定筛选出阳性 克隆，测序结果表明重组的HbA1c片段与设计的序列完全一致。

2)、HbA1c重组蛋白的表达

重组质粒经测序验证后，转化进入大肠杆菌(BL21)，在含有氨苄青 霉素的LB培养基中培养，可在LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴 定，小量制备质粒，用双酶切PCR鉴定筛选出阳性克隆，最终获得含有HbA1c 的重组质粒工程菌。

将重组质粒工程菌分别于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培 养，A600达到0.5-06之间，然后加入终浓度为0.5mM的Isopropylβ -D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)于37℃诱导4h，诱导完成后的菌 液4,000rpm离心10min，收集菌体，并用PBS洗涤沉淀；PBS重悬沉淀 后置于冰浴中，超声破菌后12000rpm离心20min，上清和沉淀分别进行 SDS-PAGE电泳，结果表明：表达的HbA1c重组蛋白皆为胞浆不可溶性表达。

3)、HbA1c重组蛋白的纯化和定量

将大量表达得到的菌体，经超声破碎后离心，再进行包含体洗涤，洗 涤完成后用His Trap FF纯化柱将蛋白进行纯化(按照产品说明书进行试 剂配制和纯化)。最终获得的HbA1c重组蛋白,用SDS-PAGE电泳进行分析， 用BCA蛋白定量试剂盒测得其浓度。

2、鼠抗HbA1c杂交瘤细胞株的建立

包括以下步骤：

a.选用6-8周龄、体重18g左右且健康的雌性BALB/c小鼠2只(1#， 2#,3#)，适应性饲养1周后，采集阴性血作为对照用；

b.免疫程序采用4次基础免疫和1次加强免疫。采用中程免疫方案 (0.3mL/只，2周/次)，首次免疫时(50μg/只)按免疫原与等体积的弗 氏完全佐剂搅拌乳化，背部皮下多点注射。此后按免疫原与等体积的弗氏 不完全佐剂搅拌乳化进行常规免疫3次；第4次常规免疫7天后测效价， 结果见表1，免疫小鼠效价明显达到1：320000以上，准备加强免疫；

c.加强免疫不加佐剂，加强免疫剂量为50μg/只，加强免疫后3天， 摘眼球采血，分离血清保存，同时取脾脏；

d.将脾脏细胞与骨髓瘤细胞按细胞数4:1左右进行混合，并在聚乙二 醇(PEG，分子量为1450)的促融作用下进行融合，融合细胞在HAT选择性 培养液(25-046-CI corningcellgro)中进行培养，10天后通过间接ELISA 方法筛选出能与HbA1c蛋白反应的阳性杂交瘤细胞，并将初筛得到的阳性 杂交瘤细胞扩大培养，两天后进行标签蛋白(His-tag)杂交瘤细胞的排除， 以复筛出针对HbA1c蛋白而非标签的杂交瘤细胞；

e.用有限稀释法将获得的阳性杂交瘤细胞连续亚克隆至少两次以上， 每次亚克隆用HT选择性培养基(25-047-CI corning cellgro)进行培养， 亚克隆8-10天后进行ELISA筛选，直至单克隆细胞阳性率为100％为止，获 得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

3、鼠抗HbA1c单克隆抗体的制备及单抗亚型的鉴定

取60ul杂交瘤细胞株HbA1c的培养上清，按照小鼠单克隆抗体亚型鉴 定试剂条说明书鉴定杂交瘤细胞株HbA1c分泌的单克隆抗体的亚型，结果 显示：杂交瘤细胞HbA1c上清的抗体亚型为IgG1。

表1小鼠常规免疫四次后的效价测试结果

实施例二

鼠抗SCCA的腹水单克隆抗体制备及纯化，具体包括以下步骤：

a.选择8-12周龄雌性健康BALB/c小鼠，腹腔注射降植烷，0.5mL/ 只；7-10天后，给每只小鼠腹腔注射1*106～5*106个实施例一的单克隆杂 交瘤细胞株注意从培养皿吹下细胞或稀释细胞需用PBS或无血清培养基；

b.将腹水10000r/min离心15min，除去细胞成分和其他的沉淀物、 脂肪以及油层等，收集中间层；

c.饱和硫酸铵沉淀：吸取5mL中间层移入小烧杯中，在搅拌下，逐滴 加入过0.22μm滤膜的PBS 5.0mL；混合均匀后，再逐滴加入10mL饱和 硫酸铵溶液(pH7.4)，继续缓慢搅拌30min；静置2h后10000r/min离 心15分钟，弃去上清，沉淀物用过0.22μm滤膜的PBS重悬，然后再将 该重悬液过0.22μm滤膜；

d.根据抗体不同亚型，选定GE Healthcare公司的不同的纯化柱，IgG 和IgM的柱子均有相应说明书，根据其说明书配置不同的缓冲液进行纯化： 以IgG抗体纯化为例，先用结合缓冲液、洗脱缓冲液及再生缓冲液将柱子 进行平衡，通常平衡5个柱体积，然后将步骤c的腹水重悬液以1mL/min 的速度上样，上样完成后用结合缓冲液平衡，再用洗脱液洗至基线位置， 收集抗体峰；用PBS缓冲液将抗体进行透析，用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce BCAProtein Assay Kit 23225Thermo Scientific)测定抗体浓度，并将 抗体分装，置-70℃冻存。

实施例三

单克隆抗体的特异性鉴定，具体包括以下步骤：

在本实施例中，分别应用实施例一中所述的HbA1c重组抗原和VIS,NPY, ANGII,RES,ADPN,RBP4,VAP,CART,APC,GHR,NES蛋白(见表2)作 为包被抗原，以实施例二中制备的单克隆抗体作为识别抗体，采用间接 ELISA来检测HbA1c。

表2交叉抗原检测样本的HbA1c数据结果

1)、酶标板的包被

用包被液(Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，Na2N3 1.2g，加ddH2O到 1L，调pH到9.6)将包被抗原稀释成1μg/mL，混合均匀后加入到96孔 酶标板中，每孔100μL，将板密封于4℃过夜。

2)、酶标板的封闭

用含有5％脱脂牛奶的PBS作为封闭液。首先将包被过夜的酶标板拍干， 加入200μL/well的封闭液，37℃封闭2h，用洗板机洗板6次后将酶标板 拍干，并于4℃备用，或-20℃长期保存。

3)、间接ELISA检测方法

在封闭后的酶标板中加入实施例二制备的单克隆抗体，100μL/well， 于37℃温育1h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，再加入一定浓度的生 物素标记goat anti-MouseIgG antibody(购自美国Raybiotech)，100μ L/well，于37℃温育1h；洗板后加入链霉素标记的辣根过氧化物酶(HRP)(购 自美国Raybiotech)，100μL/well，于37℃温育1h；洗板后加入TMB显色 液，待显色完全后，加入2M的浓硫酸终止显色，并用酶标仪(美国Biotek) 测定OD450，并对交叉反应进行比对分析，最终结果表明，实施例二制备的 单克隆抗体仅识别HbA1c。

实施例四

检测糖尿病的酶联免疫试剂盒，该实施例的检测宫颈癌的酶联免疫试 剂盒包括以下组成部分：

1、ELISA微孔板：已包被捕获抗体-单克隆抗体，并用5％BSA，0.2％蔗 糖的PBS溶液进行了封闭，单克隆抗体由杂交瘤细胞株HbA1c分泌产生。

2、标本稀释液15ml：加入0.5％BSA,0.05％的吐温20的PBS缓冲液。

3、检测抗体稀释液15ml：加入0.5％BSA,0.05％的吐温20的PBS缓冲 液。

4、检测抗体：已标记HRP的抗HbA1c检测抗体冻干粉(Santa Cruz, sc-130320)。

5、标准品：HbA1c重组蛋白标准品——干粉重组蛋白HbA1c-4。

6、10X洗涤液30ml：0.2M Tris-HCl,5M NaCl,0.5％吐温20。

7、底物20ml：TMB溶液。

8、终止液10ml：2M H2SO4。

9、试剂盒产品说明书，包装盒，塑料薄膜。

该实施例的检测宫颈癌的酶联免疫试剂盒的操作流程如下：

1)在微孔板加入梯度稀释(1000ng/ml,333ng/ml,111ng/ml, 37.1ng/ml,12.3ng/ml,41ng/ml,13ng/ml,0ng/ml)的HbA1c蛋白标 准品与30个待检测的血样，每个样品做两个重复，每孔加100ul，37℃反 应40分钟；

2)配置1X洗涤液于洗板机上洗板5次共10分钟；

3)在微孔板中加入检测抗体稀释液混匀，加入微孔板中孵育40分钟；

4)再次洗涤并加入底物反应10分钟，加入终止液显色，于酶标板上读 数。

根据读数计算标准曲线，可以得出读数与HbA1c蛋白标准品之间的线 性关系，将样品的OD值代入线性公式得出样品的含量。整个过程不超过1 个半小时。

实施例五

将VIS,NPY,ANGII,RES,ADPN,RBP4,VAP,CART,APC,GHR,NES 抗原稀释至一定浓度后用实施例四的试剂盒进行检测，数据结果见表3和 表4，其中1，2列为标准曲线，3，4，5列为以交叉抗原检测人血清样本 的数据，结果发现各交叉抗原高浓度条件下都未见明显的交叉反应。

表3交叉抗原检测样本的HbA1c数据结果

表4交叉抗原检测样本的HbA1c数据结果

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手 段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于 本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 瑞博奥（广州）生物科技股份有限公司

<120> 一种糖化血红蛋白的制备方法及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgcatc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60

gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag 120

aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag 180

gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac 240

aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat 300

cctgagaact tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 360

aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat 420

gccctggccc acaagtatca ctaa 444

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp

1 5 1015

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

202530

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp

354045

Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

505560

Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp

65707580

Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

859095

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln

115 120 125

Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His

130 135 140

Lys Tyr His

145