尿调蛋白Sda抗原水平在预测早期肾损伤中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及尿调蛋白Sda抗原水平在预测早期肾损伤中的应用。

背景技术

许多研究表明，尿调蛋白在肾脏损伤中具有保护作用，尿调蛋白的水平可能成为预测肾损伤的生物标志物。尿调蛋白富含N-糖，N-糖含量占蛋白分子量30％。糖基化是尿调蛋白的重要翻译后修饰。在疾病状态下，尿调蛋白的糖基化异常可早于蛋白水平改变。糖基化作为重要的翻译后修饰，可能比单独的蛋白质水平更敏感地预测疾病。糖基化是尿调蛋白发挥免疫调节的关键成分，尿调蛋白N糖修饰中含有一种特殊的Sda抗原。Sda抗原是一种红细胞抗原，在白种人红细胞上广泛分布，在唾液，尿液及乳液中可检测到Sda。尿调蛋白含有的Sda抗原位于多天线N-糖末端，它的结构组成为GalNAcβ(1,4)[Neu5Acα(2,3)]Galβ(1,4)GlcNAcβ(1,3)Gal。Sda抗原合成的限速酶为β(1,4)乙酰胺基半乳糖基转移酶2(beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase2,B4GALNT2)，该酶在胃肠道细胞和肾脏外髓(由表达尿调蛋白的髓袢升支粗段组成)特异性表达。

尿调蛋白许多功能都受糖基化的影响。尿调蛋白抗结石的能力依赖于尿调蛋白的糖链尤其是唾液酸成分。Hallson等人发现当对尿调蛋白进行去糖或去唾液酸处理时，尿调蛋白抑制草酸钙和磷酸钙结晶形成的能力消失。尿调蛋白抗尿路感染的能力是由尿调蛋白的N-糖介导的。Cavallone等人发现尿调蛋白的高甘露糖能与大肠杆菌(E.coli)的Ⅰ型菌毛结合，保护泌尿系统免受大肠杆菌的感染。Serafini等人总结前人的研究发现尿调蛋白Sda抗原上唾液酸能与大肠杆菌的S菌毛结合保护肾脏免受细菌感染。间质性膀胱炎患者尿调蛋白的唾液酸水平下降而尿调蛋白水平无明显改变，去唾液酸尿调蛋白的细胞保护作用降低，可能参与间质性膀胱炎的发病机制。

发明内容

本发明的目的是提供尿调蛋白Sda抗原水平在预测早期肾损伤中的应用。

第一方面，本发明要求保护尿调蛋白上的Sda糖抗原作为标记物在如下任一中的应用：

(A1)制备用于筛查或辅助诊断肾损伤的产品，或筛查或辅助诊断肾损伤；

(A2)制备用于预测肾损伤患病风险的产品，或预测肾损伤患病风险；

(A3)制备用于区分肾损伤患者和健康对照的产品，或区分肾损伤患者和健康对照。

第二方面，本发明要求保护用于检测尿调蛋白上的Sda糖抗原的物质在如下任一中的应用：

(A1)制备用于筛查或辅助诊断肾损伤的产品，或筛查或辅助诊断肾损伤；

(A2)制备用于预测肾损伤患病风险的产品，或预测肾损伤患病风险；

(A3)制备用于区分肾损伤患者和健康对照的产品，或区分肾损伤患者和健康对照。

进一步地，所述检测尿调蛋白上的Sda糖抗原为检测尿液样本中尿调蛋白上的Sda糖抗原的含量。

进一步地，所述用于检测尿调蛋白上的Sda糖抗原的物质为能够与尿调蛋白上的Sda糖抗原特异性结合的物质。

在本发明的具体实施方式中，所述用于检测尿调蛋白上的Sda糖抗原的物质为DBA凝集素。

第三方面，本发明要求保护具有如下(B1)和/或(B2)和/或(B3)所示功能的试剂盒，含有用于检测尿调蛋白上的Sda糖抗原的物质。

(B1)筛查或辅助诊断肾损伤；

(B2)预测肾损伤患病风险；

(B3)区分肾损伤患者和健康对照。

其中，所述用于检测尿调蛋白上的Sda糖抗原的物质可为能够与尿调蛋白上的Sda糖抗原特异性结合的物质。

在本发明的具体实施方式中，所述用于检测尿调蛋白上的Sda糖抗原的物质具体为DBA凝集素。

第四方面，本发明要求保护具有如下(B1)和/或(B2)和/或(B3)所示功能的系统：

(B1)筛查或辅助诊断肾损伤；

(B2)预测肾损伤患病风险；

(B3)区分肾损伤患者和健康对照。

所述系统包括：

(a1)用于检测尿调蛋白上的Sda糖抗原的试剂和/或仪器(如酶标仪)。

(a2)装置；

所述装置包括数据接收模块、数据存储模块、数据比较模块和判断模块；

所述数据接收模块被配置为接收受试者尿液样本中尿调蛋白上的Sda糖抗原的含量值；

所述数据存储模块被配置为存储判断阈值；

所述数据比较模块被配置为接收所述数据接收模块发送的所述受试者尿液样本中尿调蛋白上的Sda糖抗原的含量值，并从所述数据存储模块中调用所述判断阈值与所述受试者尿液样本中尿调蛋白上的Sda糖抗原的含量值进行比较；

所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并根据预定判定条件对比较结果进行判定，判定符合所述预定判定条件的所述受试者为或候选为肾损伤患者，判定不符合所述预定判定条件的所述受试者为或候选为非肾损伤患者(如健康对照)。

其中，所述预定判定条件可为：若所述受试者尿液样本中尿调蛋白上的Sda糖抗原的含量值小于所述判断阈值，则所述受试者为或候选为肾损伤患者；否则，所述受试者为或候选为非肾损伤患者(如健康对照)；和/或

所述判断阈值为非肾损伤患者(如健康对照)的尿液样本中尿调蛋白上的Sda糖抗原的含量值。

进一步地，所述仪器可为酶标仪。所述试剂可包括作为标准品的健康人的尿调蛋白。

第五方面，本发明要求保护前文所述试剂盒或所述系统在如下任一中的应用：

(A1)制备用于筛查或辅助诊断肾损伤的产品，或筛查或辅助诊断肾损伤；

(A2)制备用于预测肾损伤患病风险的产品，或预测肾损伤患病风险；

(A3)制备用于区分肾损伤患者和健康对照的产品，或区分肾损伤患者和健康对照。

在上述各方面中，所述肾损伤均具体可为急性肾损伤(AKI)。可根据2012年KDIGO指南定义。

在上述各方面中，所述健康对照均指体检肾功能正常，无肾脏基础疾病、无泌尿系统感染，年龄>18岁的健康成年人。

本发明有益效果：尿调蛋白上的Sda糖抗原作为肾损伤标志物的确定，有助于检测方法的不断改进，推进肾损伤的早期诊断，确立敏感性特异性更佳的肾损伤生物学标志物。

附图说明

图1为利用凝集素-ELISA方法(尿调蛋白与生物素标记的DBA)检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的标准曲线。纵轴：Y(实测OD450值)；横轴：X(Sda糖抗原浓度U/μl)。

图2为DBA在AKI患者(N＝10例)和健康对照(N＝10例)中表达水平。A为凝集素芯片检测结果；B为凝集素-ELISA(尿调蛋白与生物素标记的DBA结合)检测结果。

图3为凝集素-ELISA(尿调蛋白与生物素标记的DBA结合)方法检测AKI患者(N＝17例)和健康对照(N＝17例)样本尿调蛋白上Sda抗原浓度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、尿调蛋白上的Sda糖抗原作为肾损伤标记物的发现及其应用

一、病例纳入

1、人群纳入标准

急性肾损伤(AKI)患者：10例，符合48小时内血肌酐上升≥0.3mg/dL(26.5μmol/L)或者尿量<0.5mL/kg/h持续6小时。

健康对照(CK)：10例，体检肾功能正常，无肾脏基础疾病、无泌尿系统感染，年龄>18岁的健康成年人。

2、人群排除标准

(1)术前肾脏病史

(2)泌尿系感染

(3)手术为肾脏手术。

3、受试者基本信息

10例急性肾损伤患者均为手术后(非肾脏手术)，5例男性，5例女性，平均年龄57±4岁，符合急性肾损伤的标准。

10例健康对照为体检肾功能正常，体检肾功能正常，无肾脏基础疾病、无泌尿系统感染的实验室工作人员。

二、样本采集与处理

针对后续不同的检测方法，采集的尿液量不同，具体如下：

1、凝集素芯片和生物素直接标记尿调蛋白的凝集素-ELISA方法检测需要尿量至少1000毫升，留尿后立即处理样本，提取并纯化尿调蛋白。

尿调蛋白提取方法：

1)将20g硅藻土与尿液混合，4℃搅拌20min，加入铺有18.5cm Whatman滤纸的布氏漏斗中，真空泵抽吸。

2)过滤完后，用800ml PBS润洗硅藻土。

3)硅藻土抽水分后取出，与150ml超纯水混合，置于4℃冷库中搅拌30min。

4)分装混合液至50ml高速离心管，天平配平后高速离心，20000g，20min，4℃。

5)离心结束后，取出离心管，留上清，弃沉淀(动作轻柔，硅藻土易上浮)。向上清中加入0.1M PB和NaCl分别至浓度0.025M/0.14M(通常PB加入46ml，NaCl加入1.5g)。混合液置于4℃搅拌20min。

6)将混合液加入铺有Whatman滤纸的7cm布氏漏斗中过滤，200ml PBS冲洗。

7)再次抽干硅藻土，将硅藻土与50ml超纯水混合，置于4℃冷库中搅拌30min。

8)混合液装入50ml高速离心管中，天平配平后高速离心，20000g，20min，4℃。

9)离心后上清装入透析袋中(截流量30kD)，体积不超过2/3，封闭两端后置于5L去离子水中透析4℃过夜。

10)第二天，将透析后液体取出，使用0.2μM滤器过滤液体，去除杂质。

11)超滤浓缩，使用截流量30kD超滤管(Millipore)对蛋白进行浓缩。3000rpm，4℃，观察浓缩状态，调整离心时间。

12)浓缩后，使用nanodrop及BCA试剂盒检测蛋白浓度。

13)考马斯亮蓝/银染检测蛋白纯度。

15)标本分装，冻干存于-80℃冰箱。

考马斯亮蓝检测纯度：

1)配制10％SDS-PAGE胶，电泳液。

2)样品准备2-4μg蛋白样品，加水和5×loading缓冲液配成合适体积。还原样品需煮沸10min，非还原样本无需煮沸。

3)上样，电泳，恒压80V，样品到达分离胶层后，调电压至120V。

4)电泳后取出凝胶，将上层的浓缩胶和底部loading切除。

5)考马斯亮蓝染色，30min-1h。

6)脱色，每隔20-30min换一次脱色液，此后，4℃过夜脱色。拍照保存。

2、利用生物素标记的DBA直接检测尿调蛋白上Sda抗原的含量：需要留取尿液5毫升，2500rpm离心20min，分离上清，取一份体积的上清，加9份体积的0.01MPBS缓冲液，直接用稀释后样品用于检测，亦可将上清分装冻存于-80℃冰箱供未来检测使用，冻存样本溶解后，直接用0.01MPBS缓冲液，(按照样本:缓冲液1:9体积比)稀释。

三、样本检测

1、使用商品化凝集素芯片试剂盒(GA-Lectin-70，Raybiotech，USA)检测Sda糖抗原在AKI患者和健康对照中表达水平

具体如下：

1)材料准备。商品化凝集素芯片试剂盒(GA-Lectin-70，Raybiotech，USA)，尿调蛋白干粉。

2)样本准备。将30μg冻干的尿调蛋白重悬于超纯水中。样品用生物素标记，然后在4℃透析过夜。

3)芯片检测。芯片平衡至室温，并置于干燥箱中干燥2h后用100μl稀释液将载玻片封闭30min。将稀释的样品添加到测试孔中，并将阵列在4℃下孵育过夜。从每个孔中倒出样品，并在室温下轻轻摇动，用1×Wash Buffer I洗涤孔和载玻片。随后，将80μl Cy3-链霉亲和素添加到每个孔中。将阵列板在黑暗中于室温孵育1h。倒出Cy3-链霉亲和素，然后洗涤孔和载玻片。1,000rpm离心3min来干燥载玻片。最后，用Agilent SureScan Dx MicroarrayScanner芯片扫描仪于532nm，100％Power扫描载玻片。该芯片包含70种凝集素，以检测8种特定的碳水化合物，包括甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、唾液酸、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、乳糖(Lac)，N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)。

2、利用凝集素-ELISA方法(尿调蛋白与生物素标记的DBA)检测Sda糖抗原在AKI患者和健康对照中表达水平

本发明所提供的用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的ELISA试剂盒，包括：标准抗原、捕获物、检测物，以及酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)、显色液和终止液等。其中，所述标准抗原为健康人尿调蛋白；所述捕获物为抗尿调蛋白的抗体(Meridian公司尿调蛋白多抗K90071C-1)，所述检测物为经生物素标记的能够识别Sda的凝集素DBA。

A.常规器材和试剂

ELISA板(96孔酶标板)，Thermo公司。

铺板缓冲液：碳酸盐缓冲液pH 9.6。

洗涤液：仅含有0.1％体积百分含量Tween 20的pH为7.4的磷酸盐缓冲液(即PBST缓冲液)，简称0.1％PBST。

封闭液：仅含有10g/L BSA的pH为7.4的磷酸盐缓冲液，简称1％BSA。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Vectorlabs SA-5014-1)。

显色底物：四甲基联苯胺(TMB)。

终止液：1M H

样本稀释液：0.01M pH 7.4的PBS缓冲液。

B.标准抗原(健康人尿调蛋白)样品制备以及纯度检测

健康人尿调蛋白样品制备：

1)留取健康人24h尿液，准备缓冲液0.02M PBS，0.1M PB。

2)将20g硅藻土与24h尿混合，4℃搅拌20min，加入铺有18.5cm Whatman滤纸的布氏漏斗中，真空泵抽吸。

3)过滤完后，用800ml PBS润洗硅藻土。

4)硅藻土抽水分后取出，与150ml超纯水混合，置于4℃冷库中搅拌30min。

5)分装混合液至50ml高速离心管，天平配平后高速离心，20000g，20min，4℃。

6)离心结束后，取出离心管，留上清，弃沉淀(动作轻柔，硅藻土易上浮)。向上清中加入0.1M PB和NaCl分别至浓度0.025M/0.14M(通常PB加入46ml，NaCl加入1.5g)。混合液置于4℃搅拌20min。

7)将混合液加入铺有Whatman滤纸的7cm布氏漏斗中过滤，200ml PBS冲洗。

8)再次抽干硅藻土，将硅藻土与50ml超纯水混合，置于4℃冷库中搅拌30min。

9)混合液装入50ml高速离心管中，天平配平后高速离心，20000g，20min，4℃。

10)离心后上清装入透析袋中(截流量30kD)，体积不超过2/3，封闭两端后置于5L去离子水中透析4℃过夜。

11)第二天，将透析后液体取出，使用0.2μM滤器过滤液体，去除杂质。

12)超滤浓缩，使用截流量30kD超滤管(Millipore)对蛋白进行浓缩。3000rpm，4℃，观察浓缩状态，调整离心时间。

13)浓缩后，使用nanodrop及BCA试剂盒检测蛋白浓度。

14)考马斯亮蓝/银染检测蛋白纯度。

15)标本分装，冻干存于-80℃冰箱。

考马斯亮蓝检测纯度

1)配制10％SDS-PAGE胶，电泳液。

2)样品准备2-4μg蛋白样品，加水和5×loading缓冲液配成合适体积。还原样品需煮沸10min，非还原样本无需煮沸。

3)上样，电泳，恒压80V，样品到达分离胶层后，调电压至120V。

4)电泳后取出凝胶，将上层的浓缩胶和底部loading切除。

5)考马斯亮蓝染色，30min-1h。

6)脱色，每隔20-30min换一次脱色液，此后，4℃过夜脱色。拍照保存。

C.检测物(经生物素标记的能够识别Sda的凝集素DBA)

DBA为商品化试剂，来自Vectorlabs B1035-5。

D.检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的使用方法

第一步：采用标准抗原制作标准曲线

(1)准备系列浓度的尿调蛋白(含Sda糖抗原)标准品溶液：依次稀释步骤一制备得到的标准抗原(健康人尿调蛋白)浓度为2000pg/μl、1000pg/μl、500pg/μl、250pg/μl、100pg/μl、50pg/μl、10pg/μl，并以稀释液作为空白孔(0pg/μl)。

(2)将Meridian公司尿调蛋白多抗(货号为K90071C-1绵羊抗人尿调蛋白多抗)用pH9.6的碳酸氢盐缓冲液1:4000(体积比)稀释后，预包被在检测板上，4℃过夜。实验体系为100μl。

(3)1％BSA封闭，37℃，孵育60min。

(4)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；将步骤(1)中准备好的系列浓度的尿调蛋白上的Sda糖抗原标准品溶液上样，37℃，孵育60min。

(5)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；1:2000(体积比)稀释生物素标记的DBA(Vectorlabs，B-1035-5)，上样，100μl/孔，37℃，60min。

(6)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；1:2000(体积比)稀释辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，上样，100μl/孔，37℃，50min。

(7)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；TMB显色液室温显色10-20min，1M H2SO4硫酸终止。

(8)酶标仪450nm处读数。

(9)前述各系列浓度的标准品中，尿调蛋白上的Sda浓度分别对应以2000U/μl、1000U/μl、500U/μl、250U/μl、100U/μl、50U/μl、10U/μl、0U/μl(标准品中每1pg尿调蛋白所携带的Sda含量判定为1U)。分别以上述该值为横坐标，以其对应OD450值为纵坐标，作图得到标准曲线(如图1和表1所示)。

表1、尿调蛋白Sda糖抗原浓度计算方程，四参数Logistic曲线拟合

第二步：待测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的测定

将步骤1中的标准抗原(正常糖基化尿调蛋白)替换为待测人尿液样本，经0.01MpH7.4的PBS缓冲液10倍(体积)稀释后进行检测(注意尿液标本不能用超纯水稀释，超纯水稀释检测体系测不出)，将所得的OD450值代入步骤1所得的标准曲线，从而获得待测人尿液样本中尿调蛋白上的Sda糖抗原的含量。

3、利用凝集素-ELISA方法(生物素直接标记尿调蛋白)检测Sda糖抗原在AKI患者和健康对照中表达水平

1)硅藻土法纯化尿调蛋白。

2)纯化的尿调蛋白用生物素试剂盒标记(Thermo 21435)。

3)未经生物素标记的DBA凝集素用pH9.6的碳酸氢盐缓冲液1:2000(体积比)稀释后，预包被在检测板上，4℃过夜。实验体系为100μl。

4)1％BSA封闭，37℃，孵育60min

5)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；生物素标记后的尿调蛋白0.01MPBS稀释至浓度1μg/ml，上样，37℃，孵育60min。

6)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；1:2000(体积比)稀释辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，上样，100μl/孔，37℃，50min。

7)0.1％PBST洗板，300μl/孔，洗三次，吸水纸拍干；TMB显色液室温显色10-20min，1M H

8)酶标仪450nm处读数。

四、数据处理

每份样本重复两次，取均值。健康人组和AKI组采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

五、结果与分析

凝集素芯片结果显示凝集素DBA检测的Sda糖抗原在AKI患者和健康对照中表达水平差异最明显，P＝0.002(图2中A)。

本发明使用凝集素-ELISA方法再次检测DBA凝集素对尿调蛋白特异性糖型的识别，分别使用生物素直接标记尿调蛋白检测，及尿调蛋白与生物标记的DBA检测。通过预实验发现生物素标记尿调蛋白直接检测对于DBA检测不成功，无法使用该方法(实验体系复杂，耗时长，检测结果效果不佳)。使用尿调蛋白与生物素标记的DBA结合，随后用辣根过氧化物酶标记亲和素检测结合强度，结果显示AKI患者中DBA的表达量明显下降，P＝0.02(图2中B)。

进一步地，使用凝集素-ELISA方法(尿调蛋白与生物素标记的DBA)对急性肾损伤AKI患者(N＝17例，包含步骤一中所述10例)，正常对照(N＝17例，包含步骤一中所述10例)检测尿调蛋白上Sda抗原浓度。AKI患者(54.9+/-43.9U/ml)明显低于正常对照(169.6+/-111.5U/ml)，P＝0.026。具体参见图3。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。