一种环状RNA circABHD2及在制备子宫内膜癌诊断试剂盒和治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及环状RNA领域，特别是涉及一种环状RNA circABHD2及在制备子宫内膜癌诊断试剂盒和治疗药物中的应用。

背景技术

子宫内膜癌(Endometrial cancer，EC)约占女性癌症总数的7％，在欧美等发达国家已居女性生殖系统恶性肿瘤的首位，严重威胁女性健康。随着经济水平的提高、人口平均寿命的增加以及生活方式和饮食习惯的改变，我国女性罹患该病的风险亦逐年增加，且存在年轻化的趋势。

子宫内膜癌的治疗以手术和化放疗为主，局限于子宫体的患者5年生存率可达95％以上。然而，即便穷尽包括放化疗、内分泌治疗、靶向治疗及免疫治疗等综合手段，局部转移患者的5年生存率仍急速下降为69％，而远处转移患者的五年生存率甚至仅为17％。因此，挖掘子宫内膜癌早期诊断的靶标、抑制子宫内膜癌的侵袭转移显然更有利于患者获得良好的预后。早期在高危人群(肥胖、糖尿病、不规则阴道流血、绝经后阴道流血流液、Lynch综合征等)中筛查子宫内膜癌，并提出有效的抗侵袭转移治疗策略即具有重大的临床意义。

随着高通量RNA测序技术和生物信息学方法的迅速发展，在恶性肿瘤中特异表达的环状RNA不断被发现，环状RNA的保守性、稳定性、疾病特异性和可检测性使其成为恶性肿瘤的潜在诊断、治疗和预后生物标志物。环状RNA对恶性肿瘤的生物学行为调控至关重要，包括细胞增殖，肿瘤生长，细胞周期调控、凋亡，侵袭，迁移，血管生成，化疗耐药性和放疗敏感性等。此外，环状RNA在与恶性肿瘤发生发展相关的各种信号通路中起调节作用，反映了它们作为恶性肿瘤治疗靶标的潜力。同时，已有研究表明circUSP7可诱导抗程序性死亡受体1(PD-1)免疫疗法的耐药性，靶向ciRS-7的PBAE/si-ciRS-7纳米复合物的药物开发可能是治疗肾细胞癌的一种有希望的基因治疗策略。鉴于环状RNA在子宫内膜癌治疗领域尚有宽广的未知空间，深入挖掘环状RNA对子宫内膜癌的作用机制无疑具有重要的潜在科研价值。然而，现有技术暂无关于环状RNA circABHD2的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种环状RNA circABHD2及在制备子宫内膜癌诊断试剂盒和治疗药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过筛选鉴定出一种新的诊断子宫内膜癌的生物标志物，作为子宫内膜癌特异性生物靶点以用于子宫内膜癌的早期诊断和治疗。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种环状RNA生物标志物，所述生物标志物为circABHD2，所述circABHD2是由人15号染色体上的ABHD2基因的第2和3外显子反向拼接环化产生，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供所述的环状RNA生物标志物的特异检测引物，所述特异检测引物为SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列。

本发明还提供所述的环状RNA生物标志物或所述的特异检测引物在制备诊断子宫内膜癌试剂盒中的应用。

本发明还提供所述的环状RNA生物标志物的检测试剂在制备诊断子宫内膜癌试剂盒中的应用。

本发明还提供所述的环状RNA生物标志物在制备抗子宫内膜癌药物或者药物组合物中的应用。

优选的是，所述药物为促进所述环状RNA生物标志物过表达的药物。

本发明还提供所述的环状RAN生物标志物在制备用于子宫内膜癌分子靶向药物或者药物组合物中的应用。

本发明还提供一种诊断子宫内膜癌的试剂盒，包括检测所述环状RNA的特异检测引物，所述特异检测引物为SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列。

优选的是，还包括RNA提取试剂、反转录反应体系、管家基因β-actin引物和RCR反应试剂，去基因组DNA反应体系；所述管家基因β-actin引物为如SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种药物或者药物组合物，包括所述的环状RNA生物标志物、增加所述环状RNA生物标志物的表达量的试剂、增加所述环状RNA生物标志物的表达产物的活性的试剂中的至少一种，以及药物学上可接受的载体。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种环状RNA分子circABHD2，并以该环状RNA作为分子标志物诊断子宫内膜癌。本发明还设计针对环状RNA circABHD2分子的荧光定量检测引物，该引物能很好的检测生物体内的circABHD2表达水平，可为子宫内膜癌的诊断提供一种基于环状RNA的检测方案。此外，circABHD2在子宫内膜癌组织中的表达水平比正常组织显著降低，过表达circABHD2可显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭转移能力。circABHD2在子宫内膜癌的侵袭转移的恶性行为机理中发挥重要作用，可成为治疗转移性子宫内膜癌的特异性靶点，这一发现可为子宫内膜癌的新药研制提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明环状RNA circABHD2的形成模式图、测序验证环化接口峰图及在子宫内膜癌细胞和正常子宫内膜基质细胞中的相对表达水平的图；A是circABHD2形成模式图，B是circABHD2测序验证环化接口峰图，C是circABHD2在子宫内膜癌细胞中的亚细胞定位图；

图2是本发明荧光定量PCR检测环状RNA circABHD2在子宫内膜癌组织及细胞中表达水平图；A是子宫内膜癌肿瘤组织及正常组织中circABHD2的表达情况，B是circABHD2的表达水平与FIGO分期的关系，C是circABHD2在子宫内膜癌中的受试者工作特征(ROC)曲线，D是circABHD2在子宫内膜癌细胞及正常子宫内膜基质细胞中的表达情况；

图3是本发明过表达circABHD2对子宫内膜癌细胞增殖迁移及侵袭功能影响；A是细胞转染过表达circABHD2的质粒(OE-circABHD2)及对照质粒(OE-NC)后circABHD2的相对表达水平，B是CCK-8实验结果，C是克隆形成实验结果，D是划痕实验结果，E是transwell小室实验结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明提供一种环状RNA生物标志物，该生物标志物为circABHD2，circABHD2是由人15号染色体上的ABHD2基因的第2和3外显子反向拼接环化产生，核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

上述方案中，通过RNA测序技术鉴定了在三组子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中差异表达的19个环状RNA，并通过RT-qPCR技术在子宫内膜癌细胞(HEC-1-A，RL95-2和ishikawa)及正常子宫内膜基质细胞(hESC)中检测其表达水平，最终在子宫内膜癌组织中鉴定出一个长度为300nt环状RNA分子circABHD2，其RNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述环状RNA circABHD2由ABHD2基因的第2和3外显子反向拼接环化产生，并通过sanger测序验证其环化接口。

本发明还提供上述环状RNA生物标志物的特异检测引物，该特异检测引物为SEQID NO：2-3所示的核苷酸序列。

上述方案中，通过上述特异检测引物可以特异性扩增出目标环状RNA分子circABHD2的核苷酸序列。

本发明还提供上述的环状RNA生物标志物或所述的特异检测引物在制备诊断子宫内膜癌试剂盒中的应用。

上述方案中，通过扩大临床样本，在32例子宫内膜癌组织和19例正常子宫内膜组织中检测了circABHD2的表达水平，并分析其表达水平与临床特点相关性。经过研究发现，该环状RNA circABHD2在子宫内膜癌细胞及组织中显著低表达；并与子宫内膜癌患者FIGO分期密切相关；且该环状RNA circABHD2具有闭合的环状结构，不容易受RNase R攻击，在生物体内非常稳定，是理想的分子诊断标志物。

该特异检测引物可特异性扩增环状RNA circABHD2，作为早期诊断子宫内膜癌试剂盒中的检测试剂。

本发明还提供上述的环状RNA生物标志物的检测试剂在制备诊断子宫内膜癌试剂盒中的应用。

本发明还提供上述的环状RNA生物标志物在制备抗子宫内膜癌药物或者药物组合物中的应用。

一个优选方案中，所述药物为促进上述环状RNA生物标志物过表达的药物。

本发明还提供所述的环状RAN生物标志物在制备用于子宫内膜癌分子靶向药物或者药物组合物中的应用。

上述方案中，本发明通过向子宫内膜癌细胞HEC-1-A和ishikawa中转染circABHD2过表达质粒或对照质粒并进行功能试验，检测circABHD2对子宫内膜癌细胞侵袭迁移能力的影响，发现circABHD2可显著抑制子宫内膜癌细胞的侵袭迁移能力；通过CCK-8和克隆形成实验检测了circABHD2对子宫内膜癌增殖能力的影响，发现circABHD2显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖活力。因此，该环状RNA circABHD2及其类似物或增加其表达的试剂等可用于制备子宫内膜癌的分子靶向药物组合物中的应用；还能通过过表达circABHD2表达，抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和迁移，可用于制备抗子宫内膜癌药物中。

本发明还提供一种诊断子宫内膜癌的试剂盒，包括检测环状RNA的特异检测引物，特异检测引物为SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列。

一个优选方案中，还包括RNA提取试剂、反转录反应体系、管家基因β-actin引物和RCR反应试剂，去基因组DNA反应体系；管家基因β-actin引物为如SEQ ID NO：4-5所示的核苷酸序列。

上述方案中，检测环状RNA circABHD2及诊断子宫内膜癌的方法包括以下步骤：①提取细胞中的总RNA；②用DNA酶去除提取的RNA中残留的基因组DNA；③将RNA逆转录成cDNA；④采用反向PCR引物进行荧光定量PCR，检测环状RNA circABHD2分子的表达情况。因此，可将包括检测环状RNA的特异检测引物等在内的试剂组合制备成特异性检测circABHD2的试剂盒。

本发明还提供一种药物或者药物组合物，包括环状RNA生物标志物、增加环状RNA生物标志物的表达量的试剂、增加环状RNA生物标志物的表达产物的活性的试剂中的至少一种，以及药物学上可接受的载体。

实施例1筛选和鉴定子宫内膜癌组织的生物标志物circABHD2

1、通过RNA-seq技术鉴定子宫内膜癌中差异表达的环状RNA

收集的临床样本主要来源于接受手术治疗的女性患者(表1)。分别收集子宫内膜癌患者的肿瘤组织和年龄匹配的良性病变患者的正常子宫内膜组织样本各3例。采用高通量RNA测序技术筛选3对子宫内膜癌与正常子宫内膜中的差异环状RNA(变化倍数＞2，p﹤0.05，FDR﹤0.05)。结果发现：相对于正常子宫内膜组织，子宫内膜癌组织中高表达的环状RNA有8条，低表达的有11条。

表1临床样本基本信息

2、CircABHD2作为子宫内膜癌诊断标志物的鉴定

2.1通过以下步骤识别鉴定环状RNA circ ABHD2的存在：

(1)Trizol方法提取子宫内膜癌细胞及正常内膜细胞中的总RNA；

(2)用随机引物将RNA逆转录成cDNA；逆转录的反应体系包括：①去除基因组DNA：RNA 1-xμL(2μg)，DNase I 1μL，10×buffer 1μL，RNase free H

(3)设计反向扩增引物PCR扩增，PCR产物经RNA凝胶电泳确定circ ABHD2可被特异性扩增。荧光定量PCR检测环状RNA circABHD2分子在组织及细胞中的表达情况。根据circBase数据库中提供部分参考序列，设计识别反向PCR扩增引物，引物序列为：F：5'GTGTTTGAACCTGAAGAGCCC 3'(如SEQ ID NO:2所示)，R：5'CATTCATCTTGATCAATGTTACTTATTCT3'(如SEQ ID NO:3所示)；引物扩增环状RNA circABHD2部分序列的大小为215bp。管家基因β-actin引物序列为：F：5'CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG 3'(如SEQ ID NO:4所示)，R：5'ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC 3'(如SEQ ID NO:5所示)；PCR反应体系如下：cDNA 1.0μL；上下游引物各0.3μL；2×Taqman PCR Master Mix 7.5μL；ddH

PCR产物纯化后经sanger法测序验证环状RNA circABHD2的客观存在的接口。结果表明：环状RNA circ ABHD2的形成模式图如图1A所示，其测序验证环化接口峰图如图1B所示。

环状RNA circABHD2的RNA序列如SEQ ID NO:1(序列见表2，序列编号SEQ ID NO:1)所示，其成熟circABHD2序列的长度为300nt。

表2 circABHD2序列表

2.2 FISH实验明确circABHD2的亚细胞定位

使用Ribo

本发明设计并合成了针对circABHD2剪接点的特异性探针。人U6 FISH探针和人18S FISH探针分别用作核和细胞质对照。将细胞载玻片放在24孔板的底部，将2×10

实验结果表明：circABHD2在子宫内膜癌细胞中主要存在于细胞质，如图1C所示。

2.3扩大临床样本后验证circABHD2在子宫内膜癌患者中的表达情况

(1)扩大临床样本收集32例子宫内膜癌患者的肿瘤组织及19例良性病变患者的正常子宫内膜组织。

结果表明：circABHD2在肿瘤组织中的表达水平显著降低(图2A)，circABHD2的表达水平与患者临床FIGO分期相关(表3，图2B)。比较circABHD2在子宫内膜癌中诊断价值，circABHD2的AUC为0.865(P<0.01)，提示circABHD2在子宫内膜癌中具有良好的诊断价值(图2C)。综上，本发明环状RNA circABHD2具有闭合的环状结构，不容易受RNase R攻击，在生物体内稳定存在，是理想的分子诊断标志物。

表3 circABHD2表达水平与临床病理相关性

注：FIGO，国际妇产科学联合会。*P<0.05

2.4细胞水平验证

环状RNA circ ABHD2的在子宫内膜癌(HEC-1-A，ishikawa及RL95-2)中的表达水平明显低于正常子宫内膜基质细胞(hESC)如图2D所示。

实施例2 CircABHD2体内及体外生物学功能的鉴定:

(1)细胞转染实验

构建过表达circABHD2的质粒(OE-circABHD2)，以空载体(pcDNA3.1)为阴性对照(OE-NC)。通过电转染将OE-circABHD2和OE-NC转染至子宫内膜癌细胞。具体步骤如下：

将1×10

结果显示：转染过表达circABHD2的质粒(OE-circABHD2)后可显著提高HEC-1-A和ishikawa细胞中circABHD2的表达如图3A所示。

(2)细胞增殖能力检测

①CCK-8实验

用CCK-8法检测过表达circABHD2的HEC-1-A和ishikawa细胞的增殖能力。待细胞处于对数生长期时，胰酶消化后计数，然后将200μL细胞悬浮液接种于96孔板(1×10

结果如图3B显示：circABHD2可显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖活力。

②克隆形成实验

用克隆形成实验检测细胞增殖能力。收集HEC-1-A和ishikawa细胞，计数后重新铺至6孔板(3×10

结果表明，circABHD2可显著抑制子宫内膜癌细胞的克隆形成能力，如图3C所示。

(3)细胞迁移侵袭实验

①划痕实验

取过表达circABHD2的HEC-1-A和ishikawa细胞，胰酶消化后计数，按1×10

结果显示：circABHD2可显著抑制子宫内膜癌细胞HEC-1-A和ishikawa的迁移，如图3D所示。

②Transwell实验

迁移实验时，在transwell(Costar,Corning,NY,USA)的下室中加入600μL含20％胎牛血清的完全培养基。上室加入含8×10

结果表明：circABHD2能够显著抑制HEC-1-A和ishikawa细胞的侵袭能力，如图3E所示。

上述实施例的实验结果表明，本发明提供了一种新型内源性环状RNA circABHD2，并设计能特异性扩增circABHD2的引物，且能通过测序测定出circABHD2准确的环化位点。RT-qPCR验证发现circABHD2在子宫内膜癌组织及细胞中的表达显著低于正常对照，并与子宫内膜癌患者FIGO分期密切相关。一系列功能试验证实过表达circABHD2可显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖迁移及侵袭能力，在子宫内膜癌的恶性进展过程中起到重要的调控作用。因此，circABHD2具有作为子宫内膜癌诊断分子标志物的潜能，其检测试剂盒可用于子宫内膜癌的诊断；包括circABHD2、增加circABHD2的表达量的试剂及增加circABHD2的表达产物活性的试剂中至少一种的药物组合物可用于制备治疗子宫内膜癌的药物。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。