一种β-内酰胺酶抑制剂

本申请是申请号为202110626296.8、申请日为2021年06月04日、发明名称为“含巯基化合物在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用”的中国申请的分案申请。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种β-内酰胺酶抑制剂。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是治疗革兰氏阴性菌感染最重要和最常用的抗生素，但近年来细菌对其耐药性的日益增加引发了人类的隐忧。碳青霉烯作为β-内酰胺类抗生素的其中一种，被认为是人类抗击细菌感染的最后一道防线，随着碳青霉烯酶的出现，人类逐渐失去这一最重要的筹码。

细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的最主要原因是β-内酰胺酶的产生，其可通过水解β-内酰胺类抗生素的内酰胺环而使抗生素失去抗菌活性。根据DNA序列相似性，β-内酰胺酶可分为四类(A，B，C，D类)，其中A，C和D类酶是丝氨酸-β-内酰胺酶(SBLs)，B类酶是金属β-内酰胺酶(MBLs)，活性位点含有一个或两个锌离子。金属β内酰胺酶主要包括亚胺培南酶(IMPs)、Verona整合子编码的金属β-内酰胺酶(VIMs)和新德里金属β-内酰胺酶(NDMs)。其中NDM-1阳性细菌自本世纪初首次检测以来，已广泛传播。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供含巯基化合物或其衍生物在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用。

本发明第二方面的目的，在于提供含巯基化合物或其衍生物在作为和/或制备提高细菌对抗生素敏感性的药物中的应用。

本发明第三方面的目的，在于提供抗生素及含巯基化合物和/或其衍生物在制备抑制细菌的药物中的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种包含抗生素及含巯基化合物和/或其衍生物的复合药物。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供含巯基化合物或其衍生物在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用。

优选地，所述含巯基化合物为1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)、2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇和3-硫基-1-己醇中的至少一种；进一步为2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)中的至少一种；更进一步为1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)。

2-吡嗪基乙硫醇的分子式为C

2-甲基-3-四氢呋喃硫醇的分子式为C

3-硫基-1-己醇的分子式为C

1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)的分子式为C

优选地，所述衍生物包括含巯基化合物在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

优选地，所述β-内酰胺酶为丝氨酸β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶中的至少一种；进一步优选地，所述β-内酰胺酶为金属β-内酰胺酶。

优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种；进一步优选地，所述金属β-内酰胺酶为NDM-1型金属β-内酰胺酶。

优选地，所述丝氨酸β-内酰胺酶为KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶。

优选地，所述β-内酰胺酶的来源包括自然界中提取或者从基因工程菌株中制备获得。

本发明的第二个方面，提供含巯基化合物或其衍生物在作为和/或制备提高细菌对抗生素敏感性的药物中的应用。

优选地，所述含巯基化合物为2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)中的至少一种；进一步为2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇和3-硫基-1-己醇中的至少一种；更进一步为2-吡嗪基乙硫醇和2-甲基-3-四氢呋喃硫醇中的至少一种。

2-吡嗪基乙硫醇的分子式为C

2-甲基-3-四氢呋喃硫醇的分子式为C

3-硫基-1-己醇的分子式为C

1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)的分子式为C

优选地，所述衍生物包括含巯基化合物在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

优选地，所述细菌为表达金属β-内酰胺酶和/或丝氨酸β-内酰胺酶的耐药细菌；进一步优选地，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种。

优选地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素；进一步优选地，所述抗生素为青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素、硫霉素类抗生素和碳青霉烯类抗生素中的至少一种；更进一步优选地，所述抗生素为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢地尼、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林和阿莫西林中的至少一种。

优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种；进一步优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶和NDM-1型金属β-内酰胺酶中的至少一种；更进一步优选地，所述金属β-内酰胺酶为NDM-1型金属β-内酰胺酶。

优选地，所述丝氨酸β-内酰胺酶为KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶。

本发明的第三个方面，提供抗生素及含巯基化合物和/或其衍生物在制备抑制细菌的药物中的应用。

优选地，所述含巯基化合物为2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)中的至少一种；进一步为2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇和3-硫基-1-己醇中的至少一种；更进一步为2-甲基-3-四氢呋喃硫醇和3-硫基-1-己醇中的至少一种。

2-吡嗪基乙硫醇的分子式为C

2-甲基-3-四氢呋喃硫醇的分子式为C

3-硫基-1-己醇的分子式为C

1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)的分子式为C

优选地，所述衍生物包括含巯基化合物在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

优选地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素；进一步优选地，所述抗生素为青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素、硫霉素类抗生素和碳青霉烯类抗生素中的至少一种；更进一步优选地，所述抗生素为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢地尼、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林和阿莫西林中的至少一种。

优选地，所述细菌为表达金属β-内酰胺酶和/或丝氨酸β-内酰胺酶的耐药细菌；进一步优选地，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种。

优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种；进一步优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶和NDM-1型金属β-内酰胺酶中的至少一种；更进一步优选地，所述金属β-内酰胺酶为NDM-1型金属β-内酰胺酶。

优选地，所述丝氨酸β-内酰胺酶为KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶。

本发明的第四个方面，提供一种药物，包含：

(1)抗生素；和

(2)含巯基化合物和/或其衍生物。

优选地，所述含巯基化合物为2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)中的至少一种；进一步为2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇和3-硫基-1-己醇中的至少一种；更进一步为2-吡嗪基乙硫醇和2-甲基-3-四氢呋喃硫醇中的至少一种。

2-吡嗪基乙硫醇的分子式为C

2-甲基-3-四氢呋喃硫醇的分子式为C

3-硫基-1-己醇的分子式为C

1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)的分子式为C

优选地，所述衍生物包括含巯基化合物在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。

优选地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素；进一步优选地，所述抗生素为青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素、硫霉素类抗生素和碳青霉烯类抗生素中的至少一种；更进一步优选地，所述抗生素为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢地尼、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林和阿莫西林中的至少一种。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的至少一种。

优选地，所述药物的制剂类型包括固体制剂、液体制剂和半固体制剂。

优选地，所述固体制剂包括片剂、颗粒剂、粉剂和胶囊剂。

优选地，所述液体制剂包括注射剂。

优选地，所述半固体制剂包括软膏剂和霜剂。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))或其衍生物在作为和/或制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的应用，含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))或其衍生物对β-内酰胺酶(金属β-内酰胺酶和/或丝氨酸β-内酰胺酶)具有良好的抑制作用，可以保护抗生素不被细菌降解，提高细菌对抗生素敏感性，逆转细菌对抗生素的耐药；同时，含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇)和/或其衍生物与抗生素联用具有良好的协同效果，可作为抑制细菌的复合药物。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1含巯基化合物对β-内酰胺酶抑制活性的测定

底物被酶水解后会引起吸光度值的下降，因此，可以通过吸光度的变化来表征底物水解程度，从而判断酶的活性。以美罗培南(50μM)为报告底物，在300nm波长处测定底物在被金属β-内酰胺酶水解后的吸光度变化。金属β-内酰胺酶包括NDM-1、VIM-2和IMP-7，终浓度分别为2nM、4nM和5nM，缓冲液为50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，并添加ZnSO

1.含巯基化合物对IMP-7型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定

(1)分别将2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)(对照组加入卡托普利，购自上海源叶生物科技有限公司，批号S30916)溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL IMP-7型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为5nM)，于25℃孵育15min，使2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、2、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)及卡托普利与酶充分结合。

(2)体系转入至石英比色皿中，加入50μL美罗培南(终浓度为50μM)后迅速测定吸光度值的变化，记录数据。

(3)计算不同浓度的2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇、1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)及卡托普利对IMP-7型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对IMP-7型金属β-内酰胺酶残存活性作图，通过拟合曲线计算得到IC

2.含巯基化合物对NDM-1型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定

(1)分别将2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)(对照组加入卡托普利，购自上海源叶生物科技有限公司，批号S30916)溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL NDM-1型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为2nM)，于25℃孵育15min，使2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、2、3-硫基-1-己醇、1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)及卡托普利与酶充分结合。

(2)体系转入至石英比色皿中，加入50μL美罗培南(终浓度为50μM)后迅速测定吸光度值的变化，记录数据。

(3)计算不同浓度的2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇、1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)及卡托普利对NDM-1型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对NDM-1型金属β-内酰胺酶残存活性作图，通过拟合曲线计算得到IC

3.含巯基化合物对VIM-2型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定

(1)分别将2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)(对照组加入卡托普利，购自上海源叶生物科技有限公司，批号S30916)溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL VIM-2型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为4nM)，于25℃孵育15min，使2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)(卡托普利)与酶充分结合。

(2)体系转入至石英比色皿中，加入50μL美罗培南(终浓度为50μM)后迅速测定吸光度值的变化，记录数据。

(3)计算不同浓度的2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇、1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)及卡托普利对VIM-2型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对VIM-2型金属β-内酰胺酶残存活性作图，通过拟合曲线计算得到IC

含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))及卡托普利对IMP-7型、NDM-1型和VIM-2型金属β-内酰胺酶的抑制活性的结果如表1所示：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)对NDM-1型金属β-内酰胺酶具有抑制作用，2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇对VIM-2型金属β-内酰胺酶具有抑制作用，2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇对IMP-7型金属β-内酰胺酶具有良好的抑制作用，尤其1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)对NDM-1型金属β-内酰胺酶的抑制作用优于卡托普利。

表1含巯基化合物及卡托普利对IMP-7型、NDM-1型和VIM-2型金属β-内酰胺酶的IC

实施例2含巯基化合物与美罗培南联用抑制产β-内酰胺酶耐药菌效果的评价

采用微量肉汤稀释法测定含巯基化合物与美罗培南联用对产β-内酰胺酶耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)。实验所用的E.coli BL21(DE3)/pMAL-c5x-IMP-7购买自上海生工生物科技有限公司，E.coli BL21(DE3)/pET24a-VIM-2和E.coli BL21(DE3)/pET26b-NDM-1源自西北大学杨科武教授的馈赠，已在文献：张月娟，抗生素耐药靶蛋白金属β-内酰胺酶及其耐药细菌的表征与抑制研究[D]，西北大学，2019年，中公开；还包括购于北京百欧博伟生物技术有限公司的临床分离株E.coli BAA-2452(bla

FICI用于判断两种药物联合使用时的相互作用，根据以下方程定义:FICI＝FIC

具体实验方法如下：

1.含巯基化合物与美罗培南联用抑制产IMP-7型耐药菌效果的评价

(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株((E.coli BL21(DE3)/pMAL-c5x-IMP-7菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL氨苄西林)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×10

(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))对产IMP-7型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。

(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))联用对产IMP-7型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。

(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。

2.含巯基化合物与美罗培南联用抑制产VIM-2型耐药菌效果的评价

(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(E.coli BL21(DE3)/pET24a-VIM-2菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×10

(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))对产VIM-2型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。

(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))联用对产VIM-2型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。

(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。

3.含巯基化合物与美罗培南联用抑制产NDM-1型耐药菌效果的评价

(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(E.coli BL21(DE3)/pET26b-NDM-1菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×10

(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))对产NDM-1型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。

(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))联用对产NDM-1型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。

(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。

4.含巯基化合物与美罗培南联用抑制临床分离株E.coli BAA-2452(bla

(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(临床分离株E.coli BAA-2452(bla

(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))对临床分离株E.coli BAA-2452(bla

(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))联用对临床分离株E.coli BAA-2452(bla

(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。

5.含巯基化合物与美罗培南联用抑制临床分离株E.coli BAA-2340(bla

(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(临床分离株E.coli BAA-2340(bla

(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))对临床分离株E.coli BAA-2340(bla

(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯)，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(含巯基化合物：2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇或1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))联用对临床分离株E.coli BAA-2340(bla

(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。

美罗培南与含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))联用对表达NDM-1、VIM-2、IMP-7或KPC-2耐药菌的抗菌活性的结果如表2所示：抑制剂(含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇、1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))、卡托普利)可以提高美罗培南的抗菌活性：当抑制剂浓度为128μg/mL时，与美罗培南联合使用，可提高美罗培南对多种表达β-内酰胺酶的耐药菌的抑菌效果，且与单独使用美罗培南相比，联合用药能够有效降低美罗培南对耐药菌株的MIC值，最高可降低8倍。

含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇和1,4-丁二醇双(巯基乙酸酯))或卡托普利与美罗培南联用对表达β-内酰胺酶的耐药菌的FICI值如表3所示：含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇)与美罗培南联用对表达NDM-1型金属β-内酰胺酶的耐药菌的FICI值均小于等于0.5，表明两者具有良好的协同作用；2-吡嗪基乙硫醇与美罗培南联用对表达IMP-7型金属β-内酰胺酶的耐药菌的FICI值小于等于0.5，表明两者具有良好的协同作用；2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇与美罗培南联用对表达KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶的耐药菌的FICI值小于等于0.5，表明两者具有良好的协同作用，而卡托普利与美罗培南联用对表达KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶的耐药菌的FICI值大于1，表明两者不具协同作用。

上述结果表明：与美罗培南联用下，含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇)对表达NDM-1型金属β-内酰胺酶的耐药菌具有有效的协同抗菌活性，2-吡嗪基乙硫醇对表达IMP-7型金属β-内酰胺酶的耐药菌具有有效的协同抗菌活性，含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇)对表达KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶的耐药菌具有有效的协同抗菌活性，说明含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇)可以作为NDM-1型金属β-内酰胺酶抑制剂，2-吡嗪基乙硫醇可以作为IMP-7型金属β-内酰胺酶抑制剂，含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇)可以作为KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶抑制剂，能够逆转碳青霉烯耐药菌的耐药性，有效保护美罗培南不被NDM-1型、IMP-7型、KPC-2型金属β-内酰胺酶水解，提高美罗培南对产NDM-1型、IMP-7型、KPC-2型金属β-内酰胺酶的耐药菌的抗菌活性。因此，含巯基化合物(2-吡嗪基乙硫醇、2-甲基-3-四氢呋喃硫醇、3-硫基-1-己醇)可以作为β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素制备成复合制剂。

表2含巯基化合物或卡托普利与美罗培南联用对表达β-内酰胺酶的耐药菌的MIC(μg/mL)

表3含巯基化合物或卡托普利与美罗培南联用对表达β-内酰胺酶的耐药菌的协同抗菌指数(FICI)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。