一种腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH及其基因和应用

技术领域

本发明涉及一种腹斑倭蛙(Nanorana ventripunctata)抗菌肽Nv-CATH及其基因和应用，属于生物医学领域。

背景技术

近年来的研究表明，抗菌肽是所有动物、植物和微生物防御系统中的一个重要组成部分。它们是机体为抵御病原微生物侵袭而产生的一类小分子活性多肽，具有分子量小、稳定性好、杀菌迅速和不易产生耐药性等特点。这些特性使得抗菌肽具有非常广阔的运用前景，有望替代目前临床上易于产生耐药性的传统抗生素药物。抗菌肽不易产生耐药性的原因是，其杀菌机理与传统抗生素不同。它们主要是作用于细菌的细胞膜,破坏其稳定性，进而细胞膜渗透性发生改变，使得内容物外泄导致细胞死亡。不同物种来源或同一物种中抗菌肽的结构形式和生物活性差别较大。国内外研究人员一直致力于从不同物种中发掘结构新颖的抗菌肽，直接利用或者以其为模板进行分子改造。目前，已有抗菌肽用于海产品保鲜和动物饲料添加剂中。结合生态环境从各种自然资源中发掘具有潜在药用价值的抗菌肽是目前多肽新药研究的一个热点。

两栖动物是抗菌肽资源发掘中最重要的一类资源，其皮肤裸露，为抵御环境中各种微生物的侵袭，它们能够分泌多种分子结构新颖、功能复杂多样的的抗菌肽。这些活性多肽广泛参与机体的各种生理活动，具有各种药理活性，如抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、创伤修复、镇痛等作用。腹斑倭蛙常栖息于海拔高、昼夜温差大的高原沼泽地区，这意味着随着适应性的发展，腹斑倭蛙必然已经形成了一套有效的免疫防御系统来抵御恶劣生存环境中微生物的侵袭。腹斑倭蛙(Nanorana ventripunctata)为两栖纲无尾目蛙科倭蛙属的两栖动物，为中国特有物种，其皮肤中cathelicidin家族的强效抗菌肽尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有强效广谱抗微生物活性(包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)的腹斑倭蛙抗菌肽及其基因和应用。

本发明的抗菌肽Nv-CATH是中国两栖类特有物种腹斑倭蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量3356.98道尔顿，等电点11.56，多肽全序列一级结构(氨基酸序列SEQ IDNO:1)为：

(NCNFLCKVKQRLRSVSSTSHIGMAIPRPRG)，其第2位半胱氨酸和第6位半胱氨酸组成一对分子内二硫键形成环状多肽。

编码该腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH前体的基因(GenBank accession No.OP264074)由714个核苷酸序列组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其自5’端至3’端序列为：

其中，第373–522位核苷酸为成熟腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH的编码基因。

本发明的腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH在制备用于治疗溶血性葡萄球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、琼氏不动杆菌和/或甲型副伤寒杆菌所引起的感染疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种新的具有广谱抗微生物活性(包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌)的腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH，本发明对溶血性葡萄球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、琼氏不动杆菌和甲型副伤寒杆菌引起的感染疾病具有显著的抑制细菌生长的作用。

附图说明

图1为Nv-CATH的细菌杀伤动力学曲线，图中：在37℃下，测定浓度为4×MIC的Nv-CATH对(A)S.aureus ATCC25923，(B)A.junii 13A15578，(C)K.pneumoniae 0813343，(D)S.paratyphi A，(E)E.faecalis ATCC29212，(F)S.haemolyticus 13A13770在0、1、2、4、6、8和12h的杀灭情况；数据为三个独立实验的平均值。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作详细说明。

一、腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH基因的克隆和氨基酸序列测定

1、腹斑倭蛙皮肤总RNA提取

活体腹斑倭蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻10小时，取300mg皮肤组织，加入3mlTrizol溶液，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为腹斑倭蛙皮肤总RNA。

2、腹斑倭蛙皮肤mRNA的纯化：mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的

提取的腹斑倭蛙皮肤总RNA溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀后放置室温冷却，称为A液。将磁珠(SA-PMP)轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1 DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的腹斑倭蛙皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

3、腹斑倭蛙皮肤cDNA文库构建

采用CLONTECH公司Creator

(a)cDNA第一链合成(mRNA反转录)

在0.5ml无菌的离心管加入1μl腹斑倭蛙皮肤mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μlCDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心15秒，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。混合离心管中试剂并以12000rpm离心15秒，在42℃保温1小时。将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

(b)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

95℃预热PCR仪，将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，20秒钟；22个循环(95℃，5秒钟；68℃，6分钟)。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行回收。

(c)PCR产物回收

用PROMEGA公司的

将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，以12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。重复步骤2。12000rpm离心5分钟，将离心纯化柱置于新的离心管中。加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。12000rpm离心30秒，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

(d)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD

(e)酶切、连接以及连接产物的转化

在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl腹斑倭蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。16℃反应2小时。全量10μl加入100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10

4、腹斑倭蛙抗菌肽基因克隆筛选与基因序列测定

根据已报道的两栖动物cathelicidins高度保守的cathelin结构域序列，设计了3’端反向引物Nv-CATH-R1(5’-WSCRCAGRYCTTCACCTCC-3’(W＝A/T；S＝G/C；R＝A/G；Y＝C/T))，并与试剂盒提供的5’PCR primer(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)结合，扩增cathelicidin编码的cDNA的5’端片段。PCR条件为95℃预变性2min，92℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸40s，变性-退火-延伸进行30次循环，然后72℃再延伸10min。通过凝胶电泳纯化PCR产物，并克隆到pMD19-T载体上(Takara，日本)进行DNA测序。

根据测序获得的5’端序列，设计5’端正向引物Nv-CATH-F1(5’-ATGAAGGTCTGGCAGTGTGCG-3’)并与试剂盒提供的3’PCR primer(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCG-3’)结合，扩增编码cathelicidin的cDNA全长序列。PCR反应条件如上所述。最后将PCR产物克隆到pMD19-T载体上并进行测序。具体测序操作步骤如下：使用ABI PRISM 377型应用生物系统DNA测序仪进行DNA测序。最终扩增的PCR产物使用DNA胶回收试剂盒(DP209-02，天根，中国)进行回收。将回收到的片段与pMD19-T载体连接，将连接得到的产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，待转化结束，将转化产物涂布至含有AMP的LB(Luria-Bertani)固体培养基的培养皿上，将培养皿倒置于培养箱中37℃培养16h。挑选单菌落作为模板进行菌落PCR，使用琼脂糖凝胶电泳测定PCR产物并挑选含有目的片段的阳性克隆，标记该菌落，并置于LB液体培养基中培养扩增，将菌液送至生物公司进行DNA测序。

基因测序结果表明编码腹斑倭蛙抗菌肽前体的基因由714个核苷酸(SEQ ID NO:2)组成(GenBank Accession Number:OP264074)，自5’端至3’端序列为:

其中，第373–522位核苷酸为成熟腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH的编码基因。

5、腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH氨基酸序列测定和合成

测序结果表明腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH的全序列一级结构为：

NCNFLCKVKQRLRSVSSTSHIGMAIPRPRG，腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH由上海杰肽生物科技有限公司合成，多肽纯度大于95％。

二、腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH抑制细菌生长的作用

1、Nv-CATH最小抑菌浓度(MIC)值测定

以Luria-Bertani(LB)液体培养基作为培养介质。供试菌株经LB固体培养基复苏后，用无菌水稀释菌落成每毫升含2×10

表1腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH抑制细菌生长的作用：

由表1可见，腹斑倭蛙抗菌肽Nv-CATH具有显著的强效广谱抗菌活性(包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)。

2、Nv-CATH的细菌杀伤动力学曲线测定

为了进一步确定Nv-CATH的杀菌效果，检测了Nv-CATH对S.aureus ATCC25923、A.junii 13A15578、K.pneumoniae 0813343、S.paratyphi A、S.haemolyticus 13A13770和E.faecalis ATCC29212的细菌杀伤动力学。

如图1所示，在4×MIC的浓度下，Nv-CATH诱导S.aureus ATCC25923、A.junii13A15578、K.pneumoniae 0813343、S.paratyphi A、E.faecalis ATCC29212和S.haemolyticus 13A13770这六株细菌100％死亡所需的时间分别为1h、4h、6h、4h、6h和4h。其中，Nv-CATH对S.aureus ATCC25923表现出快速杀菌能力，仅需1h即可使细菌100％死亡。