一种磁性银化分子印迹聚合物微球及其制备与在富集多不饱和脂肪酸中的应用

(一)技术领域

本发明涉及分子印迹聚合物领域，尤其涉及一种磁性银化分子印迹聚合物微球及其制备与在富集多不饱和脂肪酸中的应用。

(二)背景技术

金松酸主要分布在裸子植物种子中，是榧籽油的特征性脂肪酸，是一种特殊结构的Δ5-亚甲基间隔不饱和脂肪酸。研究表明，金松酸具有生物活性，并已被证明具有多种有益作用，例如降低大鼠的血清和肝脏甘油三酯水平、抗炎作用、增加胰岛素敏感性、抗肿瘤等，因此金松酸在改善生活质量和健康方面很值得研究。目前由于金松酸来源少、含量低，不易获得高含量的产品，因此关于金松酸的利用研究报道较少。

DHA和EPA两者同属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，同时两者均是ω-3长链多不饱和脂肪a-亚麻酸的代谢产物，并且是人类不能自身合成的必需脂肪酸，在鱼油中含量较多。在体内代谢过程中均可由α-亚麻酸生成，但生成量较低，主要通过食物补充。其中EPA 被称为“血管清道夫”，具有疏导清理心脏血管的作用；DHA是大脑细胞形成、发育及运行不可缺少的物质基础，具有补脑健脑的作用。α-亚麻酸属ω-3系列不饱和脂肪酸，为无色至浅黄色液体，是人体必需脂肪酸之一，具有诸多生理功能，如降血脂、防血栓等。除作保健品外，也是重要的化工原料。以甘油酯形式存在于许多干性油中，尤以豆麻籽油、苏子油等含量较高。

与经典脂肪酸相比，金松酸含有独特的Δ5-亚甲基间隔不饱双键结构；DHA为4,7,10,13,16,19二十二碳六烯酸，EPA为5,8,11,14,17二十碳五烯酸；α-亚麻酸属ω-3系列不饱和脂肪酸。目前分离不饱和脂肪酸的方法主要有受控低温结晶、尿素包合、分子蒸馏、银离子络合技术、液相色谱和超临界二氧化碳萃取。然而，上述方法效率低，选择性不高，通常难以一步获得高纯度的金松酸。我们前期公开了酶法选择性富集结合尿素包和分离金松酸的专利(CN109796328B)，金松酸产率较高，但金松酸纯度一般70-80％，要进一步提高纯度至～95％需与银离子色谱耦合，步骤繁琐，耗时长。

分子印迹聚合物(MIPs)是一类对目标分子具有高选择性和亲和力的新型材料。它们具有高选择性、特异性识别能力，并被广泛应用于从复杂样品中富集目标物的选择性吸附材料。但分子印迹分离多不饱和脂肪酸的研究还比较少见。专利CN101906186A公开了一种脂肪酸类分子印迹聚合物的制备方法，以亚油酸或硬脂酸为目标，研究了功能单体(2,6-二氨基吡咯烷酮或丙烯酰胺)在乙睛溶液中与模板分子形成印迹复合物的能力。然而该方法并未将形成的分子印迹聚合物用于实际样品中目标脂肪酸的分离，因此方法的选择性、有效性不清楚。专利CN102585156公开了一种α-亚麻酸分子印迹聚合物材料的制备方法，以α-亚麻酸为模板分子，β-环糊精为功能单体，通过六亚甲基二异氰酸酯或甲苯2,4-二异氰酸酯交联形成聚合颗粒。聚合物石油醚萃取24h，然后甲醇/乙酸(6:4)洗脱24h，多的分子印迹聚合物，并从模拟脂肪酸溶液(120mg/Lα-亚麻酸乙醇)中分离α-亚麻酸。该方法本质上是利用β-环糊精天然腔体内部疏水包合疏水的脂肪酸，对不同脂肪酸没有选择性，因此不能称之为分子印迹。此外该萃取应用时，所用原料为亚麻酸，不存在其他竞争脂肪酸，因此不符合实际分离场景，因此萃取选择性难以体现，实际效果难以判断。此外不论丙烯酰胺、2,6-二氨基吡咯烷酮还是六亚甲基二异氰酸酯在食品中应用都是不期望的。

银离子络合技术是一种基于银离子与具有碳-碳双键的不饱和有机化合物的络合反应的分离方法。当有机化合物的碳数与双键数或大p键数之比较小且不存在空间位阻时，就越容易发生络合反应。双键多，络合越强，形成的络合物越稳定。银离子络合法选择性受结构类似物影响较大，通常要求待分离目标不饱和脂肪酸的起始浓度较高。因此从香榧混合脂肪酸出发(金松酸起始浓度8-10％)分离金松酸优势不明显。然而银离子在液液萃取中分离多不饱和脂肪酸效果有限，因此通常负载于活性炭载体上以银离子柱色谱方式使用，纯化效果较好，但载荷量小，时间长，且银离子损失严重，成本高，难以规模化应用。

因此如果能找到安全有效的分子印迹单体与多不饱和脂肪酸形成印迹聚合物，再将银离子结合到分子印迹聚合物上通过与双键的络合作用可能会增强分子印迹的选择性，有可能提高模板多不饱和脂肪酸的选择性和回收率。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种磁性银化分子印迹聚合物微球及其制备与在富集多不饱和脂肪酸中的应用，该复合银离子的磁性分子印迹聚合物可以一步萃取分离得到高纯度的金松酸等多不饱和脂肪酸，识别选择性高，回收率好、分离方法高效、简洁，经济，条件温和、适用面广，材料可重复使用等优点，尤其适用于目标脂肪酸起始浓度低的原料分离，同时该方法亦适用于α-亚麻酸、DHA、EPA等其他多不饱和脂肪酸的分离纯化。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种磁性银化分子印迹聚合物微球，所述聚合物微球按如下步骤制备：

(1)磁性纳米微球Fe

(2)表面接枝双硫酯键的Fe

(3)模板分子/功能单体预聚体的制备：将模板分子加入有机溶剂中，室温搅拌溶解后，加入功能单体，在1-5℃下自组装5-15h(优选4℃、12h)，使模板分子与功能单体在有机溶剂中以弱相互作用形成模板分子/功能单体预聚体，再加入银盐，获得含银离子的预聚体混合溶液；所述模板分子包括金松酸、鱼油乙酯或α-亚麻油；所述功能单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸，优选为甲基丙烯酸；所述鱼油乙酯中EPA质量含量为70％、DHA质量含量为28％。

(4)磁性银化分子印迹聚合物微球：室温下，将步骤(2)制备的Fe

进一步，步骤(1)正硅酸四乙酯体积用量以Fe

进一步，步骤(2)甲苯体积用量以磁性纳米微球Fe

进一步，步骤(3)有机溶剂为下列之一：乙腈、甲苯、乙腈/甲苯(4：1，v/v)，优选为甲苯、乙腈/甲苯(4：1，v/v)。所述有机溶剂体积用量以模板分子物质的量计为300-600mL/mmol，优选500mL/mmol；所述模板分子与功能单体投料物质的量之比为1：5-10，优:1：6；所述银盐包括硝酸银；所述银盐与模板分子投料物质的量之比为1-5:1，优选3:1。

进一步，步骤(4)中引发剂与步骤(3)模板分子投料物质的量之比为100-300：1，优选200：1；交联剂质量用量以步骤(3)模板分子投料物质的量计为100-500mg/mmol，优选500mg/mmol；Fe

进一步，步骤(3)中的银离子还可以在步骤(4)中与引发剂和交联剂一起加入。

进一步，步骤(4)滤饼还可以采用刻蚀法制备磁性银化分子印迹聚合物微球，所述刻蚀法按如下步骤制备：滤饼用pH5.1的醋酸缓冲液室温刻蚀30min，再次过滤，再次过滤的滤饼用纯水清洗，60℃真空干燥24h，获得磁性银化分子印迹聚合物微球。

本发明还提供一种所述磁性银化分子印迹聚合物微球在富集不饱和脂肪酸中的应用，所述的应用为：将复合脂肪酸的正己烷溶液中加入磁性银化分子印迹聚合物微球，在水浴温度为25-35℃(优选30℃)下振荡24h，磁吸附后，用正己烷/乙酸乙酯(9：1，v/v)洗脱24h，将洗脱液旋转蒸发脱除溶剂，微滤(优选滤膜孔径0.45μm)，获得不饱和脂肪酸；所述复合脂肪酸包括香榧油、鱼油乙酯、α-亚麻酸；所述不饱和脂肪酸包括金松酸、亚麻油、DHA、EPA。

进一步，所述混合脂肪酸的正己烷溶液中混合脂肪酸的浓度为0.5-5mg/mL，优选1mg/mL；所述正己烷体积用量以磁性银化分子印迹聚合物微球质量计为0.1-1.0ml/mg，优选0.25ml/mg。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种磁性银化分子印迹聚合物微球及其制备方法与在富集多不饱和脂肪酸中的应用，具有分离效率高、选择性强等优点，尤其适合样品中目标多不饱和脂肪酸含量低的原料。如用于香榧油中金松酸的富集，实现了一步将金松酸浓度从10％提高至87.61％；同时该材料、方法具有广谱适用性，用于亚麻油、鱼油原料，单次纯化得到的亚麻酸纯度达到93.34％，DHA+EPA总纯度达85.58％。

本发明合成的磁性银化分子印迹聚合物微球，通过功能单体聚合物实现目标分子空间识别，进一步结合银离子的双键选择性，协同刻蚀有效增加了微球比表面积，极大地提高了对不饱和脂肪酸的萃取选择性及萃取效率，同时具有易分离、可洗脱后重复使用等优点，从而明显降低了成本，具有产品纯度高，工艺简单、环保、经济等诸多优点。

(四)附图说明

图1、实验流程图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

金松酸标品按如下步骤制备：

(1)将4.8g硝酸银溶解于100mL甲醇/水(9：1，v/v)溶液，称量80g200目的柱层析硅胶，将硝酸银甲醇溶液与硅胶边搅拌边混合均匀，在暗处放置30min。然后将银化后的硅胶置于100℃干燥，在使用前于130℃下活化1h，制备好的银化硅胶于2h内使用完成，防止银离子被氧化。

(2)在80g银化硅胶中加入200mL正己烷，搅拌均匀后避光静置1h。缓慢注入预先装有50mL正己烷的柱子(柱子用黑纸包裹)，直至正己烷液面高于硅胶面1cm，平衡2h后使用。

(3)称取2g香榧油乙酯化样品(参照孟祥河，杨奇波，肖丹，夏朝盛，樊律廷.香榧籽油金松酸的分离及其1，3－甘油二酯的制备研究.中国粮油学报,2020,35(7),72-78.)，用1mL石油醚溶解，进样待样品液面与填料表面平齐后，用正己烷/乙酸乙酯(95:5,v/v)的洗脱剂洗脱，通过活塞控制流速为1mL/min，以10mL每管的体积收集流分，收集30管。将收集的样品用温和的氮气吹干后，重新加入1mL色谱级正己烷溶解。将样品过膜后用气相色谱法进行分析。其中23-26管中为金松酸乙酯，收集，气相测定金松酸乙酯纯度为99％，用于后续金松酸标品。

香榧油质量组成：棕榈酸8.94％，硬脂酸3.24％，油酸32.59％，亚油酸39.41％，亚麻酸0.61％，松油酸0.52％，金松酸9.95％。

实施例1、磁性分子印迹聚合物微球及其应用--功能单体为丙烯酸，溶剂为乙腈

1、磁性分子印迹聚合物微球的制备

(1)溶胶凝胶法制备包覆二氧化硅的磁性纳米微球Fe

将20mL正硅酸四乙酯与1g的Fe

(2)Fe

采用4-氯甲基苯基三氯硅烷(4-CPS)对磁性纳米微球Fe

(3)金松酸/功能单体预聚体的制备：

将0.1mmol的金松酸标品作为模板加入到50mL乙腈中，室温搅拌溶解完全，加入0.6mmol功能单体丙烯酸，在4℃下自组装12h，使金松酸标品与功能单体在乙腈中以弱相互作用形成金松酸/功能单体预聚体，获得预聚体混合溶液。

(4)磁性分子印迹聚合物微球的制备：

在室温下，将100mg步骤(2)制备的Fe

(5)空白分子印迹微球(记为NIPs)的制备方法除无需添加模板外与MIPs相同。

2、磁性分子印迹聚合物微球的应用

取5mL正己烷，加入5mg香榧油，得到1mg/mL香榧油正己烷溶液，再加入20mg步骤(4)制备的MIPs或步骤(5)制备的NIPs，在水浴温度为30℃下振荡24h，磁吸附后，将MIPs/NIPs收集，用正己烷/冰醋酸(9:1，v/v)洗脱24h，将洗脱液微滤(滤膜孔径0.45μm)，滤饼在60℃干燥12h，回收MIPs；滤液浓缩蒸干除去全部有机溶剂，得到纯化后的富含金松酸组分，采用Agilent 7890A气相色谱仪(配备HP88毛细管柱)分析脂肪酸组成，根据金松酸峰面积定量，计算纯度和回收率。经检测MIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为11.39％，回收率为4.36％；NIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为10.89％，回收率为4.17％，结果见表2。

气相分析条件：安捷伦Agilent 7890A气相色谱仪(Agilent Technologies,SantaClara,CA,USA)配HP88毛细管色谱柱(60m×0.25mm i.d.)；进样量为1μL，进样器和火焰离子化检测器的温度分别设定为250℃和260℃。烘箱温度在120℃下保持1分钟，然后以10℃/min的速度升温至175℃，保持10分钟；以5℃/min升温至210℃，保持5min；以5℃/min升温至230℃，最后保持8.5分钟。

实施例2、磁性分子印迹聚合物微球制备及其应用-功能单体为丙烯酸，溶剂为甲苯

将实施例1步骤1中(3)的乙腈用甲苯替换，其他操作相同，制备得到MIPs和NIPs；经检测MIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为11.52％，回收率为4.41％；NIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为11.29％，回收率为4.33％，结果见表2。

实施例3、磁性分子印迹聚合物微球制备及其应用-功能单体为丙烯酸，溶剂为乙腈/甲苯

将实施例1步骤1中(3)的乙腈用乙腈/甲苯(4:1,v/v)替换，其他操作与实施例1完全相同，制备得到MIPs和NIPs。经检测MIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为11.38％，回收率为4.41％；NIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为10.77％，回收率为4.12％，结果见表2。

实施例4、磁性分子印迹聚合物微球制备及其应用-功能单体为甲基丙烯酸，溶剂为乙腈/甲苯

将实施例1步骤1中(3)的乙腈用乙腈/甲苯(4:1,v/v)替换，功能性单体由丙烯酸替换为甲基丙烯酸外，其他操作与实施例1完全相同，制备得到MIPs和NIPs。经检测MIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为35.81％，回收率为13.72％；NIPs吸附后洗脱金松酸纯度为11.37％，回收率为4.36％，结果见表2。

实施例5、磁性银化分子印迹聚合物微球的制备及应用--功能单体为甲基丙烯酸，溶剂为乙腈，聚合后添加银离子

1、磁性银化分子印迹聚合物微球的制备

(1)溶胶凝胶法制备包覆二氧化硅的磁性纳米微球Fe

制备方法同实施例1。

(2)Fe

制备方法同实施例1。

(3)金松酸/功能单体预聚体的制备：

功能单体改为甲基丙烯酸，其他操作同实施例1。

(4)磁性银化分子印迹聚合物微球的制备：

在室温下，将100mg步骤(2)制备的Fe

(5)空白分子印迹微球(记为银化NIPs)的制备方法除无需添加模板外与银化MIPs相同。

2、应用

同实施例1，经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为61.19％，回收率为23.44％；银化NIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为21.60％，回收率为8.28％，结果见表2。

实施例6、磁性银化分子印迹聚合物微球及应用--功能单体为甲基丙烯酸，溶剂为乙腈，聚合前添加银离子

1、复合银离子的磁性分子印迹聚合物微球的制备

(1)溶胶凝胶法制备包覆二氧化硅的磁性纳米微球Fe

制备方法同实施例1。

(2)Fe

制备方法同实施例1。

(3)金松酸/功能单体预聚体的制备：

将0.1mmol的金松酸标品加入到50mL乙腈中，室温搅拌溶解完全，加入0.6mmol功能单体甲基丙烯酸，在4℃下自组装12h，使金松酸标品与功能单体在乙腈中以弱相互作用形成金松酸/功能单体预聚体，再加入0.3mmol硝酸银(金松酸：硝酸银摩尔比为1：3)，获得含银离子的预聚体混合溶液。

(4)磁性银化分子印迹聚合物微球的制备：

在室温下，将100mg步骤(2)制备的Fe

(5)空白分子印迹微球(记为银化NIPs)的制备方法除无需添加模板外与银化MIPs相同。

2、应用

同实施例1，经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为79.99％，回收率为35.65％；银化NIPs吸附后洗脱金松酸纯度为23.67％，回收率为9.07％，结果见表2。

实施例7、磁性银化分子印迹聚合物微球--金松酸：银离子摩尔比为1：1

将实施例6步骤1中(4)硝酸银用量改为0.1mmol(金松酸：硝酸银摩尔比为1：1)，其他操作相同，经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为68.05％，回收率为26.07％；银化NIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为21.26％，回收率为8.15％，结果见表2。

实施例8、磁性银化分子印迹聚合物微球--金松酸：银离子摩尔比为1：2

将实施例6步骤1中(4)硝酸银用量改为0.2mmol(金松酸：硝酸银摩尔比为1：2)，其他操作相同，经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为72.22％，回收率为27.67％；银化NIPs吸附后洗脱的金松酸纯度为22.58％，回收率为8.65％，结果见表2。

实施例9、磁性银化分子印迹聚合物微球--金松酸：银离子摩尔比为1：4

将实施例6步骤1中(4)硝酸银用量改为0.4mmol(金松酸：硝酸银摩尔比为1：4)，其他操作相同，经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为78.88％，回收率为30.22％；银化NIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为21.45％，回收率为8.22％，结果见表2。

实施例10、磁性银化分子印迹聚合物微球--金松酸：银离子摩尔比为1：5

将实施例6步骤1中(4)硝酸银用量改为0.5mmol(金松酸：硝酸银摩尔比为1：5)，其他操作相同，经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为77.80％，回收率为29.80％；银化NIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为20.80％，回收率为7.97％，结果见表2。

实施例11、磁性银化分子印迹聚合物微球--反应温度25℃

将实施例6步骤2反应温度30℃改为25℃，其他操作相同，经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为47.33％，回收率为18.13％；银化NIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为13.93％，回收率为5.34％，结果见表2。

实施例12、磁性银化分子印迹聚合物微球-反应温度35℃

将实施例6步骤2反应温度30℃改为35℃，其他操作相同，经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为72.89％，回收率为27.93％；银化NIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为27.57％，回收率为10.56％，结果见表2。

实施例13、磁性银化分子印迹聚合物微球--刻蚀

将实施例6步骤1中(5)70℃搅拌反应24h，过滤，收集滤饼后的操作改为滤饼用pH5.1的醋酸缓冲液室温刻蚀30min，再次过滤，再次过滤的滤饼用纯水清洗，60℃真空干燥24h，获得银化MIPs；同样方法制备银化NIPs，储于真空干燥器中备用。

经检测银化MIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为87.61％，回收率为33.56％；银化NIPs吸附后洗脱的金松酸的纯度为23.40％，回收率为8.97％，结果见表2。

实施例14、磁性银化分子印迹聚合物微球重复利用性

实施例1步骤2中MIPs改为实施例13回收的银化MIPs，采用实施例1步骤2方法反应，继续回收并重复利用5次。采用实施例1气相色谱法对金松酸定量，计算5次回收的金松酸纯度和回收率，结果见表1。

表1MIP的可重复利用性

实施例15、磁性银化分子印迹聚合物微球分离DHA和EPA

将实施例6步骤1中(3)的金松酸改为鱼油乙酯(EPA质量含量为70％、DHA质量含量为28％)，其他与实施例6完全相同，经检测银化MIPs吸附后洗脱的EPA的纯度为61.67％，DHA的纯度为33.91％，总回收率为54.61％；银化NIPs吸附后洗脱的EPA的纯度为51.22％，DHA的纯度为20.06％，总回收率为40.73％，结果见表2。

实施例16、磁性银化分子印迹聚合物微球分离α-亚麻酸

将实施例6步骤1中(3)的金松酸改为α-亚麻酸，其他与实施例6完全相同，经检测，银化MIPs吸附后洗脱的α-亚麻酸的纯度为93.34％，回收率为74.67；银化NIPs吸附后洗脱的α-亚麻酸的纯度为47.25％，回收率为37.80，结果见表2。

对照例1、磁性分子印迹聚合物微球及其应用--4-乙烯基吡啶和环糊精双功能单体

将实施例1步骤1中(3)的功能单体改为0.6mmol的4-乙烯基吡啶和0.4mmol的环糊精，乙腈改为乙醇；其他操作同实施例1，获得磁性分子印迹聚合物微球和空白磁性分子印迹聚合物微球。同实施例1步骤2方法，采用该磁性分子印迹聚合物微球进行香榧油中金松酸的富集实验，结果见表2，发现MIP和NIP组基本无差别，对香榧油中金松酸无富集作用。

对照例2、磁性分子印迹聚合物微球及其应用--丙烯酰胺为模板

将实施例1步骤1中(3)的功能单体改为丙烯酰胺，乙腈改为正己烷；其他操作同实施例1，获得磁性分子印迹聚合物微球和空白磁性分子印迹聚合物微球。

同实施例1步骤2方法，对该磁性分子印迹聚合物微球进行香榧油中金松酸的富集实验，结果见表2，发现MIP和NIP组基本无差别，对混合脂肪酸中金松酸无富集作用。

表2实施例对比

注：MAA为甲基丙烯酸，AA为丙烯酸；乙腈/甲苯比例为4:1，v/v；金松酸：硝酸银为摩尔比。

表2数据表明不同单体(β-环糊精、丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸)形成的分子印迹聚合物在不同溶剂中富集分离多不饱和脂肪酸的效果差异显著，这可能与形成的聚合物柔韧性有关，聚甲基丙烯酸形成的印迹可能与模板脂肪酸(金松酸)的结构更接近，因此富集的选择性和产品回收率均高于其他聚合物。值得注意的是丙烯酸和甲基丙烯酸是同系物，单体分子结构相近，然而其相应聚合物对模板脂肪酸的分离效果差异显著，尤其乙腈/甲苯溶液中聚甲基丙烯酸富集效果显著优于聚丙烯酸及甲苯、乙腈单独溶剂。因此推断，可能聚甲基丙烯酸印迹体在乙腈/甲苯混合溶液中呈现特殊的空间，甲基空间取向朝外溶于乙腈/甲苯溶液，而羧基在形成的印迹空腔内部，尤其聚合前羧基与加入Ag