基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法

技术领域

本发明涉及生物基因技术领域，具体为基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法。

背景技术

大力发展生物育种是解决我国当前苹果产业对优质新品种迫切需求的有效途径，建立高效遗传转化体系是进行生物育种的必要前提。

目前苹果遗传转化主要依靠根癌农杆菌介导的侵染方法实现。该方法受到明显的基因型限制，目前只在“嘎啦”和“金冠”等少数几个品种中有成功案例的报道，且存在转化效率低、嵌合体频率高的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法。

本发明技术方案如下：

基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，包括如下操作：

步骤1：取苹果叶片作为外植体；

步骤2：将所述外植体使用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染，得侵染叶片；

步骤3：将所述侵染叶片置于共培养培养基和选择培养基中，进行生根培养，得不定根；

步骤4：将所述不定根置于含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，进行生芽培养，得再生芽。

如上所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，所述含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，所述吲哚-3-乙酸的浓度为0.01-0.2mg/mL，所述噻苯隆浓度为1-3mg/mL。

其中，所述含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，所述吲哚-3-乙酸浓度为0.2mg/mL，所述噻苯隆浓度为2mg/mL。

如上所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，所述步骤3的具体操作为：将所述侵染叶片吸干水分后，叶背朝下置于共培养培养基中，24-26℃黑暗培养3天；接着，叶腹朝下置于选择培养基中，24-26℃黑暗培养17-18天；然后，置于选择培养基中，24-26℃黑暗培养40-42天，得所述不定根。

其中，所述共培养培养基中含有以下成分：1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂。

其中，获得所述选择培养基的具体操作为：将1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后，加入200mg/L特美汀，倒板，得所述选择培养基。

如上所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，所述步骤2的具体操作为：将所述外植体使用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染，加入乙酰丁香酮，混合侵染后，用悬浮液洗，得所述侵染叶片；所述悬浮液包括以下浓度的物质：1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖。

其中，获得所述含有转基因质粒的发根农杆菌菌液的具体操作为：

取农杆菌菌株置于液体培养基中，28℃摇菌12h，得菌液；

将所述菌液加入液体培养基中，摇菌5h至OD600＝0.6，5000rpm离心5min，得菌块；

将所述菌块用悬浮液重悬，得发根农杆菌菌液；

将所述转基因质粒加入发根农杆菌菌液中，得所述含有转基因质粒的发根农杆菌菌液。

如上所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，所述步骤4的具体操作为：

将所述不定根置于根生芽培养基中，控制温度为24-26℃，光周期为8h或16h，光照强度为2000lux，期间需每隔10天继代一次，继代4次后，得所述再生芽。

如上所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，所述苹果叶片为苹果无菌组培苗顶端的叶片。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，以苹果叶片为起始材料，经含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染后，再经共培养培养基和选择培养基培养，得到便于观察区分的转基因不定根，然后经过根生芽培养基诱导不定根转变为再生芽。该方法具有高遗传转化率，低嵌合体频率的优点，为苹果基础研究和生物育种提供新的方法。

具体实施方式

下面详细地描述本公开的示例性实施方式。

实施例

本实施例提供了基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，包括如下操作：

步骤1：取苹果叶片作为外植体；

步骤2：将所述外植体使用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染，得侵染叶片；

步骤3：将所述侵染叶片置于共培养培养基和选择培养基中，进行生根培养，得不定根；

步骤4：将所述不定根置于含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，进行生芽培养，得再生芽。

具体为：

选取“嘎啦”苹果无菌组培苗顶端长势良好的1-2片叶片，作为外植体，用干净无菌的刀片垂直于外植体(叶片)主叶脉切2-3刀，将切完后的外植体，放到灭菌后的皿中，皿中倒入20ml悬浮液，悬浮液由1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖制成。

将转基因质粒转入发根农杆菌菌液中，制得含有转基因质粒的发根农杆菌菌液。

然后，将含有转基因质粒的发根农杆菌菌液倒入皿中，并加入10ul乙酰丁香酮，混合摇晃侵染8min，用移液枪将皿中的菌液吸出来，重新倒入悬浮液洗2min，得到侵染叶片。

制备侵染所用发根农杆菌菌液的方法包括：

第一种方法：将-80℃保存的甘油菌划线涂板，农杆菌菌株在spe抗性与链霉素抗性的YEP固体培养基中活化2天；将农杆菌菌株用无菌牙签划下一些在20mlspe抗性与链霉素抗性的YEP液体培养基中，置于28℃摇床摇菌12h，得菌液；然后取1ml摇好的菌液置于50mlspe抗性与链霉素抗性的YEP液体培养基中，继续摇菌5h至OD600＝0.6，5000rpm常温离心5min，得菌块；将菌块用1ml悬浮液液重悬，得到发根农杆菌菌液。

第二种方法：将新鲜转化筛选出的农杆菌菌株用无菌牙签重新划至20mlspe抗性与链霉素抗性的YEP液体培养基中，置于28℃摇床摇菌12h，得菌液；取1ml摇好的菌液置于50mlspe抗性与链霉素抗性的液体YEP培养基中，继续摇菌5h至OD600＝0.6，5000rpm常温离心5min，得菌块；将菌块用1ml悬浮液液重悬，得到发根农杆菌菌液。

将1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后倒板，得共培养培养基。

将1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后，加入200mg/L特美汀，然后倒板得选择培养基。

将侵染叶片放在无菌滤纸上吸干水分，叶背朝下铺到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，在24-26℃条件下完全黑暗培养3天；

3天后，叶腹朝下将叶片转移到选择培养基中，在24-26℃条件下完全黑暗培养17-18天；

然后，置于新的选择培养基中，在24-26℃条件下继续暗培养40-42天，得外植体。

将MS培养基、0.2mg/mL吲哚-3-乙酸(IAA)、1mg/mL噻苯隆(TDZ)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后，加入200mg/L特美汀，然后倒板，得含有IAA和TDZ的根生芽培养基。

将外植体置于含有IAA和TDZ的根生芽培养基中，控制温度为24-26℃，光周期为8h或16h，光照强度为2000lux，期间需每隔10天继代一次，确保根生芽培养基效果，继代4次后，得到再生芽。

实施例1

选取“嘎啦”苹果无菌组培苗顶端长势良好的1-2片叶片，作为外植体，用干净无菌的刀片垂直于外植体(叶片)主叶脉切2-3刀，将切完后的外植体，放到灭菌后的皿中，皿中倒入20ml悬浮液，悬浮液由1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖制成。

任何转基因质粒都可以使用在此体系中，因为RUBY质粒转入后，能够使转基因植株自身发红，便于实验观察及区分。所以，在本实施例当中，选用RUBY质粒转入发根农杆菌菌液中，制得含有RUBY质粒的发根农杆菌菌液。

然后，将含有RUBY质粒的发根农杆菌菌液倒入皿中，并加入10ul乙酰丁香酮，混合摇晃侵染8min，用移液枪将皿中的菌液吸出来，重新倒入悬浮液洗2min，得到侵染叶片。

制备侵染所用发根农杆菌菌液的方法为：

将-80℃保存的甘油菌划线涂板，农杆菌菌株在spe抗性与链霉素抗性的YEP固体培养基中活化2天；将农杆菌菌株用无菌牙签划下一些在20mlspe抗性与链霉素抗性的YEP液体培养基中，置于28℃摇床摇菌12h，得菌液；然后取1ml摇好的菌液置于50mlspe抗性与链霉素抗性的YEP液体培养基中，继续摇菌5h至OD600＝0.6，5000rpm常温离心5min，得菌块；将菌块用1ml悬浮液液重悬，得到发根农杆菌菌液。

将1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后倒板，得共培养培养基。

将1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后，加入200mg/L特美汀，然后倒板得选择培养基。

将侵染叶片放在无菌滤纸上吸干水分，叶背朝下铺到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，在24-26℃条件下完全黑暗培养3天；

3天后，叶腹朝下将叶片转移到选择培养基中，在24-26℃条件下完全黑暗培养17天，这时可以看到切口处有密密麻麻的黄色和红色愈伤组织长出；

然后，置于新的选择培养基中，在24-26℃条件下继续暗培养40天，此时可见带有RUBY标记基因的红色阳性根长出，将长出的红色阳性根在灭过菌的滤纸上切下做为外植体。

将MS培养基、0.2mg/mL IAA、2mg/mLTDZ、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后，加入200mg/L特美汀，然后倒板，得含有IAA和TDZ的根生芽培养基。

将外植体置于含有IAA和TDZ的根生芽培养基中，控制温度为24-26℃，光周期为16h，光照强度为2000lux，期间需每隔10天继代一次，确保根生芽培养基效果，继代4次后，得到再生芽。

在本实施例中，选取0.2mg/mL IAA和2mg/mLTDZ作为生根培养的物质，发现该浓度组合的IAA和TDZ对再生芽的愈伤再生率、芽再生率和芽再生密度有着最好的促进作用。相关实验结果可参见表1的萘乙酸(NAA)和TDZ的浓度(mg/L)对再生芽生长的影响数据，表2的不同浓度NAA和TDZ组合对再生芽生长的影响数据，以及表3的不同浓度IAA和TDZ组合对再生芽生长的影响数据。结果显示，当浓度为0.2mg/L的IAA和浓度为2mg/L的TDZ组合使用时，其对再生芽的愈伤再生率、芽再生率和芽再生密度有最好的促进作用。

表1不同NAA和TDZ浓度对再生芽的影响汇总表

表2不同浓度NAA和TDZ组合对再生芽的影响汇总表

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表3不同浓度IAA和TDZ组合对再生芽的影响汇总表

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本实施例提供的方法，以“嘎啦”苹果组培苗叶片为起始材料，经含有RUBY质粒的发根农杆菌菌液侵染后，得到便于观察区分的转基因不定根，然后经含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基培养，诱导转基因不定根的侧根原基转变为再生芽。本实施例建立了一套新的苹果转基因体系，提高了转化效率、降低了嵌合体频率，为开展基础研究和生物育种奠定了基础。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。