同时检测4种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用
文献发布时间:2023-06-19 19:30:30
技术领域
本发明属于植物病毒检测技术领域,尤其涉及一种同时检测4种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用。
背景技术
柑橘衰退病是由柑橘衰退病毒(citrus tristezavirus,CTV)引起的对柑橘具有极大危害的一种经济性病害,其在世界各地广泛发生。CTV属于长线形病毒属(Closterovirus),病毒粒子呈11×2000nm的长线形,基因组由约19300个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA),是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。柑橘衰退病根据指示植物表现的表型可分为3种症状类型:茎陷点型、速衰型和苗黄型。CTV存在复杂的株系分化现象,目前已检测11种CTV基因型:VT、T30、T36、T3、A18、T68(B165)、RB、HA16-5、S1、L1、M1;另外,在野生柑橘种检测到一种新的CTV基因型:JY。并且,同一柑橘植株常常混合侵染多种CTV基因型,使得明确基因型与表型的关系变得困难。
目前,最常用的CTV基因型检测体系主要有三种。第一种是利用限制性内切酶HinfⅠ对CTV的外壳蛋白基因扩增产物在37℃下进行消化,根据消化后不同片段长度的图谱分为7个组群,结合CTV在指示植物上表现的不同生物学症状,将7个组群划分为潜在的弱毒株系和强毒株系;但该方法无法将7个RFLP组群与CTV基因型对应,且逐渐发现越来越多无法归类的组群出现,导致该方法的应用越来越少。第二种是通过比较CTV 5′端基因组5′URT、K17及POL区域的序列差异,设计了10对引物用于检测VT、T30、T3和T36基因型;该方法较为繁琐,且同样存在无法归类的CTV分离物。第三种Roy等设计的检测B165、VT、T30、T3和T36基因型的特异性检测引物,是目前较为常用的CTV基因型检测体系。另外,RB、HA16-5、S1、L1、M1基因型的发现者均设计了检测各自新基因型的特异性引物。由于CTV基因型众多、检测引物繁多、基因型检测体系多样,导致CTV基因型检测程序复杂、耗时,而且常常不同体系间的检测结果不一致,给CTV基因型检测和CTV致病机理研究带来困扰。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种同时检测4种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用,本发明的引物组和试剂盒能够快速同时检测T30、T68、JY、HA4种柑橘衰退病毒基因型,不但能快速、准确的确定待测样品是否侵染柑橘衰退病毒,还能确定侵染柑橘衰退病毒基因型是T30、T68、JY、HA中的一种还是多种,对完善CTV基因型的检测和防控有积极作用。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组,所述4种柑橘衰退病毒基因型为T30、T68、JY、HA;所述多重RT-PCR引物组是由用于检测T30的引物、用于检测T68的引物、用于检测JY的引物和用于检测HA的引物组成;
T30上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,T30下游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示;
T68上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,T68下游引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示;
JY上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,JY下游引物的核苷酸序列如SEQID No.6所示;
HA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,HA下游引物的核苷酸序列如SEQID No.8所示。
本发明还提供了上述的多重RT-PCR引物组在制备同时检测T30、T68、JY、HA柑橘衰退病毒基因型的试剂中的应用。
本发明还提供了同时检测T30、T68、JY、HA柑橘衰退病毒基因型的试剂盒,包括上述的多重RT-PCR引物组。
优选的,所述试剂盒包括PCR反应体系、RT反应体系、阳性质控品和阴性质控品。
优选的,所述RT反应体系包括解链液5μL、5×RT-buffer 4μL、30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL、100U/μL的反转录酶RTase 1μL、无RNase超纯水4.5μL,10μmol/L反转录引物1μL。
优选的,所述解链液由10μmol/L随机引物1.0μL、2.5mM/L dNTPs 1.0μL、RNA模板3.0μL组成。
优选的,所述PCR反应体系包括无RNase超纯水13.1μL、10×PCR-buffer4.5μL、2.5mM/L的dNTPs 2μL,10μmol/L上述的多重RT-PCR引物组的上下游引物0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的方法,包括以下步骤:利用所述多重RT-PCR引物组进行PCR扩增,得到PCR扩增产物,将PCR扩增产物进行片段分析,得到待测样品是否受T30、T68、JY、HA中的一种或多种CTV基因型侵染。
优选的,所述PCR扩增程序为:95℃预变性3分钟,95℃变性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸50秒,35个循环。
优选的,所述片段分析是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,根据电泳结果确定待测样品中是否受T30、T68、JY和HA中的一种或多种CTV基因型侵染。
相对于现有技术,本发明具有如下有益效果:
本发明提供了一种同时检测4种CTV基因型的多重RT-PCR引物组、试剂盒与应用,本发明针对目前常见的CTV基因型全基因序列的差异设计了多对特异性引物,本发明的多重RT-PCR引物组或试剂盒具有特异性强、灵敏度高的特点,当T30、T68、JY和HA CTV基因型同时存在时,该多重RT-PCR引物组能够特异性检测T30、T68、JY和HA这4种CTV基因型,且DNA扩增片段大小适宜,多重PCR结果容易辨认。在cDNA模板稀释到10
附图说明
图1为CTV基因型多重RT-PCR引物组的特异性检测结果,其中,+:对应基因型的阳性样品;-:健康植株作为阴性对照;1:T30和T68混合侵染;2:T30和JY混合侵染;3:T30和HA混合侵染;4:T68和JY混合侵染;5:T68和HA混合侵染;6:JY和HA混合侵染;7:T30、T68和JY混合侵染;8:T30、T68和HA混合侵染;9:T68、JY和HA混合侵染;10:T30、JY和HA混合侵染;11:T30、T68、JY和HA混合侵染;
图2为CTV基因型多重RT-PCR引物组灵敏性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组,所述4种柑橘衰退病毒基因型为T30、T68、JY、HA;所述多重RT-PCR引物组是由用于检测T30的引物、用于检测T68的引物、用于检测JY的引物和用于检测HA的引物组成;
T30上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,T30下游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示;
T68上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,T68下游引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示;
JY上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,JY下游引物的核苷酸序列如SEQID No.6所示;
HA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,HA下游引物的核苷酸序列如SEQID No.8所示。
本发明针对目前常见的CTV基因型全基因序列的差异设计了多对特异性引物,上述多重RT-PCR引物组可以快速、准确的同时区分T30、T68、JY、HA这4种CTV基因型,极大的提高CTV基因型检测的速率和效率。
本发明还提供了上述的多重RT-PCR引物组在制备同时检测T30、T68、JY、HA柑橘衰退病毒基因型的试剂中的应用。
本发明还提供了同时检测T30、T68、JY、HA柑橘衰退病毒基因型的试剂盒,包括上述的多重RT-PCR引物组。
在本发明中,所述试剂盒优选的包括PCR反应体系、RT反应体系、阳性质控品和阴性质控品。所述RT反应体系优选的包括5μL解链液、5×RT-buffer4μL、30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL、100U/μL的反转录酶RTase 1μL、无RNase超纯水4.5μL,10μmol/L反转录引物1μL。所述解链液优选的由10μmol/L随机引物(6N)1.0μL、2.5mM/L dNTPs 1.0μL、RNA模板3.0μL组成。所述PCR反应体系优选的包括无RNase超纯水13.1μL、10×PCR-buffer4.5μL、2.5mM/L的dNTPs 2μL,10μmol/L上述的多重RT-PCR引物组的上下游引物0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL。在本发明中,所述阳性质控品为含有T30基因型的柑橘衰退病毒样品、含有T68基因型的柑橘衰退病毒样品、含有JY基因型的柑橘衰退病毒样品和含有HA基因型的柑橘衰退病毒样品。所述阴性质控品为健康植株的样品。本发明对RT-buffer、RNA酶抑制剂RNasin、反转录酶RTase、无RNase超纯水、PCR-buffer、dNTPs、r-Taq酶的来源没有特殊限定,采用本领域公知的产品即可。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的方法,包括以下步骤:利用所述多重RT-PCR引物组进行PCR扩增,得到PCR扩增产物,将PCR扩增产物进行片段分析,得到待测样品是否受T30、T68、JY和HA中的一种或多种CTV基因型侵染。
在本发明中,用上述试剂盒同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的方法,优选的包括以下步骤:
1)提取待检测样品的RNA;
2)将步骤1)中RNA进行反转录,合成得到cDNA;
3)以步骤2)中所述cDNA为模板,利用上述多重RT-PCR引物组进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;
4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析,得到待测样品是否受T30、T68、JY和HA中的一种或多种CTV基因型侵染。
在本发明中,所述发转录的反应程序优选为:30℃反应10分钟,42℃反转录50分钟,70℃加热15分钟。所述PCR扩增程序优选为:95℃预变性3分钟,95℃变性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸50秒,35个循环。所述片段分析优选的是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,根据电泳结果确定待测样品中是否受T30、T68、JY和HA中的一种或多种CTV基因型侵染。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种同时检测4种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组,所述4种柑橘衰退病毒基因型为T30、T68、JY、HA;所述多重RT-PCR引物组是由用于检测T30的引物、用于检测T68的引物、用于检测JY的引物和用于检测HA的引物组成,具体引物信息如表1所示。
表1 4种柑橘衰退病毒基因型的多重RT-PCR引物组
实施例2
一种基于RT-PCR技术同时检测上述4种柑橘衰退病毒基因型的方法,步骤如下:
(1)提取待检测样品的RNA:
S1、取0.1g柑橘叶片,液氮充分研磨后加入预先放置1mL Trizol溶液(Invitrogen,美国)的1.5mL的离心管中,剧烈振荡混匀后室温放置10分钟,将离心管在12900rpm,4℃下离心10分钟。
S2、取上清液1mL置于新的1.5mL的离心管中,加入200μL氯仿:异戊醇(24:1),震荡混匀,4℃放置5分钟后12900rpm,4℃下离心5分钟。
S3、取步骤S2离心后的上清液(只取最上一层)置于新的1.5mL的离心管中,加入等体积的异丙醇,轻轻颠倒混匀后放置-20℃沉降2小时以上。
S4、将步骤S3中离心管在12000rpm,4℃离心10分钟,弃上清液后加入1mL 75%乙醇颠倒混匀,在8000rpm,4℃下离心3min,弃上清液;再离心15s用枪头吸弃上清液,重复2次。
S5、将步骤S4中含有RNA沉淀的离心管置于通风橱中室温干燥2~3min,加入30μLDEPC水溶解RNA。
(2)以步骤(1)所提取的RNA为模板,利用随机引物进行反转录反应,得到反转录产物cDNA。
反转录反应进行前需要解链反应:由3μLRNA反应模板、1μL浓度为2.5mM/L的dNTPs和1μL浓度为10μmol/L的随机引物(6N)组成5μL解链液,在65℃解链5分钟后加入反转录体系混合液进行反转录反应。反应体系为15μL,其中,解链液5μL、5×RT-buffer4μL、浓度为30U/L的RNA酶抑制剂RNasin 0.5μL、浓度为100U/μL的反转录酶RTase 1μL和4.5μL无RNase超纯水;反应程序为:30℃反应10分钟,42℃反转录50分钟,70℃加热15分钟。
(3)以步骤(2)得到的反转录产物cDNA为模板,用上述各基因型引物进行RT-PCR反应,反应体系为25μL,其中反应体系包括无RNase超纯水13.1μL、10×PCR-buffer4.5μL、浓度为2.5mM/L的dNTPs 2μL、反应体系中5对浓度为10μmol/L的实施例1所述各基因型上、下游引物各0.5μL、r-Taq酶0.4μL、反转录产物cDNA模板1μL;PCR扩增程序为:95℃预变性3分钟,95℃变性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸50秒,35个循环。
实施例3
本实施例利用实施例1多重RT-PCR引物组中的一种或多种混合,按照实施例2的检测柑橘衰退病毒基因型的方法进行特异性评估,结果见图1。
结果如图1所示,当只含有T30、T68、JY、HA其中一种基因型时,多重RT-PCR引物组能够特异性扩增该基因型对应的片段;当2种基因型任意组合时,该多重RT-PCR引物组能够特异性扩增出这2种基因型对应的片段;当3种基因型任意组合时,该多重RT-PCR引物组能够特异性扩增出这3种基因型对应的片段;当4种基因型同时存在时,该多重RT-PCR引物组能够特异性扩增出这4种基因型对应的片段。因此上述多重RT-PCR引物组能够特异性检测T30、T68、JY、HA这4种CTV基因型。
实施例4
实施例1的多重RT-PCR引物组的灵敏性评估,按照如下步骤操作:
以实施例1得到的反转录cDNA模板,按10倍梯度稀释共6个梯度(10
由图2可知,在cDNA模板稀释到10
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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