一种用于检测骨肿瘤诊断相关基因的探针库及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，本发明涉及一种用于检测骨肿瘤诊断相关基因的探针库及试剂盒。

背景技术

原发性骨癌是一种极为罕见的肿瘤，约占所有癌症的0.2％。在成年人中，软骨肉瘤是最常见的原发性骨癌，占40％，其次是骨肉瘤(28％)、脊索瘤(10％)、尤因肉瘤(8％)，最后是未分化多形性肉瘤(UPS)/纤维肉瘤(4％)。在儿童和青少年中，骨肉瘤和尤因肉瘤(亦称尤文肉瘤，Ewing’s sarcoma，简称ES)远比软骨肉瘤和脊索瘤常见。骨未分化高级别多形性肉瘤、纤维肉瘤和骨巨细胞瘤(GCTB)是相对罕见的肿瘤，每种肿瘤占原发性骨肿瘤的比例都不到5％。骨巨细胞瘤既有良性肿瘤也有恶性肿瘤，其中良性是最常见的亚型。软骨肉瘤通常发生于中老年人。骨肉瘤和尤因肉瘤主要发生在儿童和年轻人。脊索瘤在男性中更常见，发病率在五至六十岁时达到高峰。

骨肿瘤的病理诊断目前仍基于传统的形态学观察，辅以免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)标记。近年来，广泛开展的荧光原位杂交(fluorescence insitu hybridization，FISH)和基因突变检测(一代测序)为骨肿瘤的病理诊断提供了极大帮助，部分通过细胞和分子遗传学研究发现的基因变异也已成为广泛应用的分子诊断指标，如采用FISH检测尤因肉瘤中的EWSR1基因易位；采用一代测序检测骨巨细胞瘤中的H3F3A基因突变等。

传统基因检测方法因实用性高和单次检测成本较低而广泛应用于临床，但也存在一些技术缺陷和临床应用局限，比如可检测基因有限、不能区分融合伴侣、假阴性率较高等。相比之下，NGS检测在技术和临床诊疗中具有一定优势，具体包括：1)可以同时涵盖多个基因，检测范围更广；2)同时检测所有位点的多种变异类型，避免遗漏某些变异类型，可为初诊患者提供完整的分子分型；3)避免单基因检测带来的样本耗竭和时间延误，可以快速地为后续评估提供依据。因此，若样本传统检测为阴性，可使用NGS复检。

基因融合是骨肿瘤常见的变异形式。基于二代测序(the Next-generationSequence technology，NGS)数据的结构变异检测方法研究经过十多年的发展，已越来越趋于成熟。而仅使用DNA-seq进行融合检测具有一定的局限性，比如：1)基因内含子序列冗长和存在重复序列，DNA探针难以全面覆盖；2)携带融合变异的肿瘤细胞占比低，低于检测DNA的灵敏度；3)复杂的转录或转录后的剪接加工过程可能会影响基因组融合/重排的真实性。因此使用RNA-seq检测融合可以作为DNA-seq的补充，能检测到DNA-seq未检测到的融合。

现有的探针只能检测骨肿瘤的部分分型，且多数仅针对融合检测进行设计，无法覆盖短突变、拷贝数变异等突变类型。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种探针库，所述探针库中的探针捕获的目标区域位于如下基因中的至少一种：H3F3A、H3F3B、IDH1、IDH2、EWSR1、FLI1、USP6、FUS、MDM2、NR4A3、NCOA2、SMAR CB1。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包含第一方面任意一项所述的探针库。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种杂交捕获方法，包括使用第一方面所述的探针库，对预处理的核酸样本进行杂交捕获，获得杂交捕获产物。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种检测方法，包括对第三方面所述的杂交捕获方法获得杂交捕获产物进行测序，获得检测结果。

依据上述实施例的一种用于检测骨肿瘤诊断相关基因的探针库及试剂盒，本发明设计的探针全面覆盖了骨肿瘤相关的全部证据等级较高的基因，并且可同时实现短突变、基因拷贝数变异和基因融合各种突变类型的检测，可诊断的肿瘤类型较多，覆盖的突变类型较为全面。

在一实施例中，本发明针对骨肿瘤各亚型特征性基因设计了一款组合探针，并通过同时检测DNA和RNA实现对各类型突变的准确检测，弥补了传统基因检测方法可检基因有限、无法区分融合伴侣等检测局限性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

术语解释

NGS：the Next-generation Sequence technology，二代测序。

CNV：Copy number variations，基因拷贝数变异。

SNV：Single Nucleotide Variant，单核苷酸位点变异。

SV：Structural Variation，结构变异。

如本文所用，“室温”是指23℃±2℃。

骨肿瘤属于罕见肿瘤，且肉瘤性病变恶性程度高、预后差，给临床诊治带来巨大挑战。随着新的分子检测手段的开展和应用，基于特定基因异常的新病种也在不断涌现，以二代测序(NGS，the Next-generation Seque nce technology)为代表的新型检测技术在骨肿瘤的诊治和预后判断中将会发挥越来越重要的作用。在一实施例中，本发明提出一种基于探针捕获和NGS检测对骨肿瘤进行诊断的方法，能够一次性检测骨肿瘤不同亚型的相关基因，弥补了传统基因检测方法可检基因有限、无法区分融合伴侣等的检测局限性。

根据第一方面，在一实施例中，提供一种探针库，所述探针库中的探针捕获的目标区域位于如下基因中的至少一种：H3F3A、H3F3B、IDH1、IDH2、EWSR1、FLI1、USP6、FUS、MDM2、NR4A3、NCOA2、SMAR CB1。

在一实施例中，所述探针库用于检测如下突变类型中的至少一种：短突变、基因拷贝数变异、基因融合。

在一实施例中，短突变包括SNV和Indel。SNV：Single Nucleotide Variants，单核苷酸位点变异。Indel：Insertion-deletion，核苷酸的插入或缺失。

在一实施例中，所述探针库中的探针捕获的目标区域所在的基因以及突变类型包括如下基因及其突变类型中的至少一种：

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在一实施例中，所述探针库包含SEQ ID No.1～753所示核苷酸序列中的至少一种。

在一实施例中，所述探针库包含SEQ ID No.1～753所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种。

在一实施例中，所述探针库包含SEQ ID No.1～753所示核苷酸序列所构成的组中的全部。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包含第一方面任意一项所述的探针库。

在一实施例中，所述试剂盒还包含构建测序文库所需的其他试剂，包括DNA样本建库、RNA样本建库所需的试剂。DNA样本建库所需的试剂包括但不限于末端修复及加“A”反应、接头连接反应、连接后纯化、PCR反应、产物纯化、杂交捕获等步骤所需的酶、引物、缓冲液、磁珠等试剂。

在一实施例中，所述试剂盒还包含使用说明书，用于指导用户使用。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种杂交捕获方法，包括使用第一方面所述的探针库，对预处理的核酸样本进行杂交捕获，获得杂交捕获产物。

在一实施例中，所述核酸样本包括由DNA建库得到的样本或由RNA建库的得到的样本。

在一实施例中，所述核酸样本为由DNA建库得到的样本时，预处理包括末端修复及加“A”反应、接头连接反应、连接后纯化、PCR反应、产物纯化等步骤。

在一实施例中，所述核酸样本为由RNA建库得到的样本时，预处理包括使用RNA建库试剂盒对RNA进行建库，得到可用于杂交捕获的文库。

在一实施例中，所述杂交捕获产物可直接用于上机测序。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种检测方法，包括对第三方面所述的杂交捕获方法获得杂交捕获产物进行测序，获得检测结果。

在一实施例中，检测结果可以是目标基因或其位点的突变类型。

在一实施例中，提供一种用于检测骨肿瘤诊断相关基因的探针库，可分别从DNA和RNA方面同时检测基因突变、拷贝数变异和基因融合。

为了弥补采用传统基因检测方法对骨肿瘤进行诊断的局限性，在一实施例中，本发明针对骨肿瘤各亚型特征性基因设计了一款组合探针，并通过同时检测DNA和RNA实现对各类型突变的准确检测。

在一实施例中，本发明提供了一种用于骨肿瘤诊断的组合探针。

在一实施例中，本发明全面覆盖NCCN指南、中国专家共识、ESMO临床实践指南等骨肿瘤诊断指南中推荐检测的基因，准确检测包括H3F3A基因(G34R、G34W、G34L以及K36M)突变、H3F3B基因(G34R和K36M)突变、IDH1和IDH2基因突变，EWSR1、FLI1、USP6、FUS、ERG、NR4A3和NCOA2融合，MDM2扩增以及SMARCB1缺失在内的所有具有临床诊断价值的基因变异。目标检测范围及诊断意义如表1所示。可检测的突变类型包括短突变、基因拷贝数变异和基因融合。

表1探针目标检测范围

明确探针检测范围后，针对突变及拷贝数变异相关基因的目标区域进行1×平铺覆盖设计，对融合相关基因进行3×平铺覆盖设计，同时针对热点融合形式进行特异性的探针设计，以提高融合的检出灵敏度。每条探针120bp，共753条探针，由供应商进行探针合成。设计的具体探针如表10所示。

在一实施例中，本发明的探针库中，一部分探针是RNA探针。

在一实施例中，本发明通过DNA和RNA共提取的方式同时获得DNA和总RNA，两种样本类型分别进行建库杂交和上机，再经过信息分析获得突变检测结果。

在一实施例中，本发明针对骨肿瘤各亚型特征性基因设计了一款组合探针，并通过同时检测DNA和RNA实现对各类型突变的准确检测，弥补了传统基因检测方法可检基因有限、无法区分融合伴侣等检测局限性。

实施例1

本实施例进行骨肿瘤样本检测。

1、DNA与RNA共提取

FFPE(Formalin-fixed paraffin-embedding，福尔马林固定石蜡包埋)样本按照QIAGEN AllPrep DNA/RNA FFPE Kit提取试剂说明书进行DNA和RNA共提取。DNA采用Qubit3.0定量，DNA总量大于100ng。RNA采用Qubit 3.0定量并采用Agilent 2100进行DV200测定，RNA总量大于100ng，DV200≥30％。

2、DNA样本检测

2.1文库构建

将FFPE基因组DNA打断到200～250bp，然后使用NEBNext Ultra II文库构建试剂盒构建样本文库。引物和接头来自于生工生物工程(上海)股份有限公司。

2.1.1末端修复及加“A”

按照下表2配制末端修复及加“A”反应Premix(Mix 1)，振荡混匀并离心。Premix是指预混液。

表2EP Mix反应体系

Premix(Mix 1)分装，每个反应10μL，加入到打断纯化后的50μL DNA样本中，振荡混匀并离心。按照下表3所示反应条件在恒温混匀仪或PCR仪上孵育。孵育完成后，短暂离心，将蒸发起的液滴收集入管内。

表3EP反应条件

2.1.2接头连接

将溶解后的NEBNextΜltra II Ligation Master Mix、NEBNext LigationEnhancer及接头振荡混匀并离心。按照下表4配制接头连接反应Premix(Mix 2)，充分振荡混匀并离心。

表4连接Mix反应体系

接头(Adapter)加入量对应关系参照下表5。

表5Adapter加入量对照表

本实施例的建库起始量为400ng。

本实施例的接头加入量为4μL。

Premix(Mix 2)分装。按照每个反应用量，依次向反应管中加入Premix(Mix 2)及对应体积的接头，振荡混匀并离心。将反应管置于恒温混匀仪上孵育，20℃，15min。孵育时，按照任务单分装分子标签(亦称ind ex，样本的分子标签，用于区分不同的样本)。孵育完成后，短暂离心，将管壁上的液体离心至管底。

2.1.3接头连接后纯化

向每个反应管中加入87μL Axygen磁珠，吹打或轻微振荡混匀后，室温下孵育10min，使磁珠与DNA片段充分结合，孵育期间配制80％乙醇。轻微离心后，将离心管置于磁力架上至澄清。弃上清，打开磁力架上全部离心管，依次加入500μL 80％乙醇。

2.1.4捕获前PCR(Non-C-PCR)

提前将Index及KAPA HiFi HotStart ReadyMix置于室温进行溶解，将溶解后试剂振荡混匀并离心。

摆放PCR管，并在管上标记对应序号，分别在PCR管中加入对应的反应组分，如下表6为双端引物NC-PCR Mix配制表。

表6双端引物NC-PCR Mix反应体系

PCR程序见表7，热盖温度105℃，50μL体系。

表7NC-PCR反应程序

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根据打断后样本的浓度和样本类型确定循环数，循环数可以为5、10或12等等，本实施例的循环数具体为10。

2.1.5NC-PCR产物纯化

使用45μL Axygen磁珠对PCR产物进行纯化，最终溶解在31μL TE(pH 8.0)缓冲液中。将纯化产物转移至准备的EP管中。

2.2杂交捕获

采用本发明设计的表10所示的富集探针，参照芯片制造商提供的说明书进行杂交捕获。

3、RNA样本检测

3.1文库构建

3.1.1将纯化后的RNA按照下表8所示的条件进行打断。本实施例的DV200均＞50％。表8片段化条件

3.1.2参照翊圣双模式RNA建库试剂盒进行建库。

3.2杂交捕获

采用本发明设计的表10所示的富集探针，参照芯片制造商提供的说明书进行杂交捕获。

4、测序和信息分析

通过Gene+Seq2000测序仪进行双端(PE100)测序，测序过程经过多重质控检查。

4.1数据管理系统

吉因加的数据管理系统对样本类型、采样部位、样本编号、文库号、index号以及上机信息等进行一一对应，并将这些信息绑定于数据分析的各个环节，并在数据分析结束以后，记录本次数据分析所使用的流程名称及其版本信息，数据库名称及其版本信息，并保存该样本对应的fastq、BAM和VCF文件的关键的文件信息。

4.2FASTQ数据产出

通过软件splitBarcode(版本：0.1.3)，结合样本对应的index序列信息，将每个样本对应的全长reads信息从下机文件中提取，并分别以固定的命名格式将双端测序的reads分别存储为两个fastq文件中。

4.3Index匹配异常检查

在突变检测阶段，通过识别肿瘤样本和对照样本中纯合位点的异常和匹配情况，对index匹配异常或者样本间交叉污染的情况进行检测。

4.4数据比对和bam文件生成

在数据比对之前，首先通过fastp(版本：0.20.0)软件对于输入fastq文件中的低质量reads进行过滤。过滤之后的高质量reads通过BWA(版本：0.7.15-r1140)软件将其比对到人类基因组中(版本：hs37d5)，生成初始比对结果的bam文件。

4.5SNV、CNV和SV calling

肿瘤待测样本及其配对血细胞样本数据经过比对获得的bam文件，作为SNV突变分析软件Mutect2的输入，利用Mutect2软件对肿瘤待测样本进行SNV分析，获得体系SNV的突变集合，包含突变频率、突变位点深度等信息，并对获得的体系SNV进行注释，将该步骤得到的突变进行过滤，保留满足如下条件的突变：(1)位于热点集的突变且支持突变的reads数(AD)≥4且突变频率(AF)≥0.01；(2)突变位于热点区域且突变类型不为snv且AD≥4且A≥0.01；(3)突变不位于热点区域和热点集且AF≥0.012且AD≥8且突变标签为PASS。满足前述三种条件中的任意一种的突变均被保留。

利用cnvkit软件，将肿瘤待测样本及配对样本的bam文件作为输入，分析获得样本发生CNV突变的segm ent区段，并输出区段的大小、区段包含的探针数、区段的BAF值等信息。

对于DNA样本SV的分析，首先获得该样本的排序后的BAM文件，再输入比对信息，另外需要该样本的测序芯片的热点区域信息hotregion文件，输入软件ncsv2，则可获得该样本的所有结构变异信息。而RNA样本则采用arriba软件进行分析并输出最终的SV结果。

5、检测结果

该实施例测试了5例骨肿瘤患者，具体突变检测结果如下表9所示。

表9骨肿瘤患者突变检测结果

从表9可见，通过对标现有方法，证实本探针可以准确检测骨肿瘤相关基因的各类突变类型，从而实现对骨肿瘤的诊断。

本实施例使用的具体探针如下表所示。

表10探针序列

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在一实施例中，本发明设计的探针全面覆盖了骨肿瘤相关的全部证据等级较高的基因，并且可同时实现短突变、基因拷贝数变异和基因融合等各种突变类型的检测，可诊断的肿瘤类型较多，覆盖的突变类型较为全面。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。