一种中国樱桃再生体系的建立方法

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，具体而言，涉及一种中国樱桃再生体系的建立方法。

背景技术

中国樱桃俗称小樱桃，是蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)的多年生木本果树，在我国已有3000年的栽培历史，其果实风味浓郁，外观鲜艳，具有极高营养、保健和经济价值。当前，中国樱桃生产中存在果实偏小、酸度偏高、不耐储运等缺点，亟需进行种质创新及遗传改良，培育综合性状优良的中国樱桃新品种。

植物离体再生技术是种质创新、遗传改良等研究的基础。目前，用于建立植物离体再生体系常用的外植体包括叶片、子叶、胚轴及茎段等器官。近年来，有研究者以‘Summit’、‘SL64’、‘CAB-6P’、‘Gisela 5’和‘Gisela 6’等的离体叶片为外植体获得欧洲甜樱桃再生植株的报道。目前中国樱桃再生体系的建立还鲜见报道，仅有以中国樱桃叶片为外植体进行不定芽诱导的研究，且诱导效果不理想。

中国樱桃再生体系建立难度大，存在愈伤组织易褐化、再生困难、再生频率低等许多问题，但高效、稳定的再生体系是遗传转化体系的关键步骤。因此，建立一种高效稳定的中国樱桃再生体系是亟待解决的问题，也将为中国樱桃种质创新及遗传改良提供技术支撑。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

现有技术的问题在于中国樱桃再生体系建立难度大，存在愈伤组织易褐化、再生困难、再生频率低等许多问题，本发明目的在于提供一种中国樱桃再生体系的建立方法，以中国樱桃子叶为外植体，诱导分化出芽和根，构建中国樱桃子叶再生体系的方法，解决了中国樱桃再生困难等问题。

本发明通过下述技术方案实现：

一种中国樱桃再生体系的建立方法，包括以下步骤：

(1)材料预处理：将中国樱桃的果核破除种壳，取出完整种胚；

(2)灭菌：将种胚依次用75％酒精和0.1％升汞浸泡灭菌；

(3)无菌苗培养：将灭菌处理过的种胚接种于培养基上，暗培养使其萌发幼苗；

(4)不定芽诱导：当中幼苗生长至两叶一心状态，切下子叶，接种于不定芽诱导培养基，暗培养后转光下培养；

(5)生根培养：当培养材料长至2-3cm时，转到生根培养基，光下培养得到组培苗；

(6)移栽：将组培苗移栽到灭菌后的基质中培养，获得根系发达的中国樱桃完整植株。

本发明以中国樱桃花后30-36d的子叶作为外植体，诱导分化出芽和根，能够高效完成离体再生，完整保留中国樱桃的遗传性状，构建了高效稳定的中国樱桃子叶再生体系，解决了中国樱桃再生困难的问题。

本发明一种中国樱桃再生体系的建立方法，其具体步骤如下：

(1)材料预处理：将放于4℃条件下冷藏30d后的中国樱桃果核用尖嘴钳破除种壳，取出完整种胚；

(2)灭菌：将经步骤(1)处理过的所述中国樱桃种胚用酒精浸泡30-35s后用无菌水冲洗2-3次，再用升汞浸泡6-8min，最后用无菌水冲洗2-3次；

(3)无菌苗培养：将经步骤(2)处理过的所述中国樱桃种胚接种于培养基上，暗培养萌发幼苗；

(4)不定芽诱导：当步骤(3)中幼苗生长至两叶一心状态，切下子叶，切掉近轴端和远轴端的部分子叶后，接种于不定芽诱导培养基，暗培养14d后转至光下培养；

(5)生根培养：当步骤(4)培养材料长至2-3cm时，转到生根培养基，光下培养30-40d；

(6)移栽：将步骤(5)中的所述组培苗移栽到灭过菌的基质中，置于25℃室内环境中培养，获得根系发达的中国樱桃完整植株。

进一步的，步骤(1)中所述的中国樱桃为花后30-36d的中国樱桃。

进一步的，步骤(3)中培养基的组分为：MS+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8-6.0。

进一步的，步骤(3)的培养条件为：温度25±1℃、暗培养的条件下进行幼苗的萌发。

进一步的，步骤(4)中不定芽诱导培养基的组分为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5-0.8mg/LIBA+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8-6.0；培养条件为：温度25±1℃、暗培养14d后转至光照强度为2500Lx，光照时间12h/d的条件下进行不定芽诱导。

进一步的，步骤(5)中生根培养基的组分为：1/2MS+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.8-6.0；培养条件为：温度25±1℃、光照强度为2500Lx，光照时间12h/d的条件下进行再生芽的诱导生根。

进一步的，步骤(6)中基质的成分为：有机质、蛭石、珍珠岩的混合物，三者的比例为3：1：1，培养条件为：温度25±1℃、光照强度为2500Lx，光照时间12h/d的条件下进行培养。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明实施例提供的一种中国樱桃再生体系的建立方法，用中国樱桃种胚进行培养得到无菌苗，采用无菌苗子叶作为外植体进行不定芽诱导及生根培养，进行炼苗驯化移栽，获得根系发达的中国樱桃完整植株，建立了一个高效稳定的再生体系，为中国樱桃的工厂化育苗及后续基因功能验证实施奠定基础。

2、本发明实施例提供的一种中国樱桃再生体系的建立方法，以中国樱桃花后30-36d的子叶作为外植体，诱导分化出芽和根，能够高效完成离体再生，完整保留中国樱桃的遗传特性，构建了高效稳定的中国樱桃子叶再生体系，解决了中国樱桃再生困难的问题。

3、本发明实施例提供的一种中国樱桃再生体系的建立方法，使用花后30-36d的中国樱桃种胚，诱导培养基组分为MS+2.0mg/L 6-BA+0.5-0.8mg/L IBA+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，使得中国樱桃子叶再生芽诱导率能够达到33.75％；同时生根培养基的组分为1/2MS+0.5mg/LIBA+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，培养30-40d，生根率达到95％，平均生根数为12根，且根系较粗，有利于移栽成活，能够实现中国樱桃的高效离体再生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的中国樱桃‘红妃’胚培养及子叶再生体系流程图；

A为中国樱桃‘红妃’种胚培养；B为中国樱桃‘红妃’种胚萌发出无菌苗；

C为中国樱桃‘红妃’子叶剥离；D为中国樱桃‘红妃’子叶诱导出不定芽；

E为中国樱桃‘红妃’不定芽增殖；F为中国樱桃‘红妃’不定芽生根。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本本发明，未具体描述公知的材料或方法。

在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。

在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1

如图1所示，本发明实施例提供一种中国樱桃再生体系的建立方法，以中国樱桃‘红妃’子叶为外植体，完成离体再生，包括以下步骤：

(1)材料预处理：采集花后30d的中国樱桃‘红妃’果实，去除果肉，洗净果核，置于4℃下冷藏30d后，用尖嘴钳破除种壳，取出完整种胚；

(2)灭菌：将经步骤(1)处理过的所述种胚用75％酒精浸泡30-35s，用无菌水冲洗2-3次，再用0.1％升汞浸泡6-8min，用无菌水冲洗2-3次；

(3)无菌苗培养：将经步骤(2)处理过的所述种胚接种于培养基上，暗培养萌发幼苗；幼胚萌发的培养基组分为：MS+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂；

(4)不定芽诱导：当步骤(3)中幼苗生长至两叶一心状态，切下子叶，切掉近轴端和远轴端的部分子叶后，接种于不定芽诱导培养基，暗培养14d后转光下培养；不定芽诱导培养基的组分为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂；

(5)生根培养：当步骤(4)培养材料长至2-3cm时，转到生根培养基，光下培养30-40d；生根培养基的组分为：1/2MS+0.5mg/L IBA+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂；

(6)移栽：将步骤(5)中的所述组培苗移栽到灭过菌的基质中，置于25℃室内环境中培养，获得根系发达的中国樱桃完整植株。

实施例2

本发明实施例提供一种中国樱桃再生体系的建立方法，以中国樱桃‘红妃’子叶为外植体，完成离体再生，包括以下步骤：

(1)材料预处理：采集花后33d的中国樱桃‘红妃’果实，去除果肉，洗净果核，置于4℃下冷藏30d后，用尖嘴钳破除种壳，取出完整种胚；

(2)灭菌：将经步骤(1)处理过的所述种胚用酒精浸泡30-35s，用无菌水冲洗2-3次，再用0.1％升汞浸泡6-8min，用无菌水冲洗2-3次；

(3)无菌苗培养：将经步骤(2)处理过的所述种胚接种于培养基上，暗培养萌发幼苗；幼胚萌发的培养基组分为：MS+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂；

(4)不定芽诱导：当步骤(3)中幼苗生长至两叶一心状态，切下子叶，切掉近轴端和远轴端的部分子叶后，接种于不定芽诱导培养基，暗培养14d后转光下培养；不定芽诱导培养基的组分为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.8mg/L IBA+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂；

(5)生根培养：当步骤(4)培养材料长至2-3cm时，转到生根培养基，光下培养30-40d；生根培养基的组分为：1/2MS+0.5mg/L IBA+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂；

(6)移栽：将步骤(5)中的所述组培苗移栽到灭过菌的基质中，置于25℃室内环境中培养，获得根系发达的中国樱桃完整植株。

实施例3

本发明实施例提供一种中国樱桃再生体系的建立方法，以中国樱桃‘红妃’子叶为外植体，完成离体再生，包括以下步骤：

(1)材料预处理：采集花后36d的中国樱桃‘红妃’果实，去除果肉，洗净果核，置于4℃下冷藏30d后，用尖嘴钳破除种壳，取出完整种胚；

(2)灭菌：将经步骤(1)处理过的所述胚用75％酒精浸泡30-35s，用无菌水冲洗2-3次，再用0.1％升汞浸泡6-8min，用无菌水冲洗2-3次；

(3)无菌苗培养：将经步骤(2)处理过的所述接种于培养基上，暗培养萌发幼苗；幼胚萌发的培养基组分为：MS+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂；

(4)不定芽诱导：当步骤(3)中幼苗生长至两叶一心状态，切下子叶，切掉近轴端和远轴端的部分子叶后，接种于不定芽诱导培养基，暗培养14d后转光下培养；不定芽诱导培养基的组分为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.8mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂；

(5)生根培养：当步骤(4)培养材料长至2-3cm时，转到生根培养基，光下培养30-40d；生根培养基的组分为：1/2MS+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂；

(6)移栽：将步骤(5)中的所述组培苗移栽到灭菌后的基质中，置于25℃室内环境中培养，获得根系发达的中国樱桃完整植株。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，步骤1)中采用花后18d的中国樱桃‘红妃’果核。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中采用花后21d的中国樱桃‘红妃’果核。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中采用花后24d的中国樱桃‘红妃’果核。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中采用花后27d的中国樱桃‘红妃’果核。

对比例5

本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中采用花后39d的中国樱桃‘红妃’果核。

对比例6

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(4)中不定芽诱导培养基组分为：MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂。

对比例7

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(4)中不定芽诱导培养基组分为：MS+1.0mg/L6-BA+0.8mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂。

对比例8

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(4)中不定芽诱导培养基组分为：MS+1.0mg/L6-BA+1.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂。

对比例9

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(4)中不定芽诱导培养基组分为：MS+2.0mg/L6-BA+1.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂。

对比例10

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(4)中不定芽诱导培养基组分为：MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂。

对比例11

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(4)中不定芽诱导培养基组分为：MS+3.0mg/L6-BA+0.8mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂。

对比例12

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(4)中不定芽诱导培养基组分为：MS+3.0mg/L6-BA+1.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+7mg/L琼脂。

对比例13

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(5)中生根培养基组分为：1/2MS+0.1mg/LIBA+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂。

对比例14

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(5)中生根培养基组分为：1/2MS+0.2mg/LIBA+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂。

对比例15

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(5)中生根培养基组分为：1/2MS+0.8mg/LIBA+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂。

对比例16

本对比例与实施例2的区别在于，步骤(5)中生根培养基组分为：1/2MS+1.0mg/LIBA+30.0g/L蔗糖+7.0mg/L琼脂。

由表1可知，中国樱桃种胚的败育率、污染率、萌发率随着花后天数的增加而增大，而不定芽的产生则集中在花后30-36d，其中花后33d不定芽诱导率最高，达到32.22％，这说明本发明采用花后30-36d的中国樱桃种胚能够成功高效地实现不定芽诱导。

表1采用不同成熟度中国樱桃种胚进行离体再生的败育率、污染率、萌发率及对不定芽诱导的影响

由表2可知，当6-BA浓度为2.0mg/L，IBA浓度为0.8mg/L时，中国樱桃‘红妃’的不定芽诱导率最高，达到33.75％。

表2采用不同组分不定芽诱培养基对花后33d中国樱桃‘红妃’子叶不定芽诱导的影响

由表3可知，当生根培养基中IBA浓度为0.5mg/L时，再生苗生根率最高，为95％。

表3生根培养基采用不同IBA浓度的培养基中中国樱桃‘红妃’的生根情况

综上，本发明使用的中国樱桃种胚为花后30-36d，诱导培养基组分为MS+2.0mg/L6-BA+0.5-0.8mg/L IBA+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，中国樱桃子叶再生芽诱导率达到33.75％；生根培养基的组分为1/2MS+0.5mg/L IBA+30.0g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，培养30-40d，生根率为95％，平均生根数为12根，且根系较粗，有利于移栽成活。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。