芹菜素8位羟化酶蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地涉及芹菜素8位羟化酶蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

异野黄芩素(Isosculletarein)化学名为5,7,8-三羟基-2-(4-羟基苯基)色烯-4-酮(5,7,8-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chromen-4-one)。分子式为C15H10O6，溶于氯仿、乙酸乙酯、DMSO等。异野黄芩素是从黄芩中分离得到的一类5,7,8-三羟基黄酮类化合物，是黄芩属的主要有效成分之一，来源广泛。同时，异野黄芩素也是许多植物体内合成主要黄酮药效成分的重要中间产物，通过修饰可获得稀有的天然化合物，如能诱导人白血病细胞死亡的栀子黄素B、人羧基酯酶1(hCE1)的选择性抑制剂并且临床用于结核辅助治疗的石吊兰素等。药理实验研究表明，异野黄芩素具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、提升免疫的作用。Takayuki等人通过体内和体外研究报道异野黄芩素具有很强的流感病毒抑制活性。异野黄芩素虽然来源广泛，但在天然植物种表达水平较低。因此，为了充分研究和开发异野黄芩素用于药物设计和生成天然或非天然新化合物的潜力，获得异野黄芩素的合成方式并扩大其应用范围是一项重要的研究工作。

目前，国内外通过生物或化学修饰合成异野黄芩素的报道较为缺乏，Halbwirth等人首次从菊花花瓣微粒体中检测到黄酮8-羟基酶(F8H)活性。在NADPH和FAD存在下检测到这种活性，该酶可以对黄酮醇和黄酮类进行8-羟基化。Berim团队从罗勒中分离出一种8-羟基酶，它存在于叶绿体中，属于Rieske型加氧酶蛋白家族，可以将丹参素或洋葱黄素转化为8-羟基丹参素或8-羟基洋葱黄素，并在罗勒叶片毛状体中高度表达。Zhao等人从黄芩中分离出对底物白杨素特异性高的8-羟基化酶，该酶同时有较弱的6-羟基化(F6H)功能。随后，Gao等对唇形科黄芩和灯盏花中CYP82D家族和菊科CYP706X家族进行趋同进化研究，报道了5种黄芩特有的可以催化芹菜素生成异野黄芩素的F8H功能酶。Hu等报道了一种简化的总收率高于50％的异野黄芩素化学合成方法。

发明内容

虽然现在有异野黄芩素生物或化学合成的报道，但存在化学合成方法成本高、生物合成方法报道少的问题。本发明主要是基于吊石苣苔三代全长转录组，获得芹菜素8位羟基转移酶序列，并通过真核表达重组蛋白，确认LpCYP82D-1可以催化异野黄芩素的产生。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有芹菜素8位羟化酶活性的由a)衍生的蛋白质。

所述芹菜素8位羟化酶活性是催化芹菜素A环8位的羟基化生成异野黄芩素。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

将该基因命名为LpCYP82D-1，将其编码的蛋白命名为LpCYP82D-1。具体信息如下：LpCYP82D-1基因序列如序列表中序列1所示，其含有1569个核苷酸，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由522个氨基酸组成。

含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述蛋白在作为芹菜素8位羟化酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述芹菜素8位羟化酶是催化芹菜素A环8位的羟基化生成异野黄芩素的酶。

所述蛋白、所述编码基因在催化芹菜素转化生成异野黄芩素中应用也属于本发明的保护范围。

本发明基于吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)三代和二代转录组数据，用反向遗传学的方法找到并鉴定异野黄芩素合成的特异羟基化修饰酶LpCYP82D-1，为生物合成异野黄芩素提供了芹菜素8位羟化酶蛋白及其编码序列和实验基础。

附图说明

为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：

图1为吊石苣苔各组织中LpCYP82D-1表达水平。

图2为pESC-His-LpCYPs载体转化WAT11的验证结果。

图3为LpCYP82D-1对芹菜素催化活性鉴定UPLC图。

图4为LpCYP82D-1对芹菜素催化产物MS鉴定图。

图5为芹菜素(左)和异野黄芩素(右)分子结构式。

图6为LpCYP82D-1芹菜素转化率图。

具体实施方式

实施例1、芹菜素8位羟化酶蛋白及其编码基因与应用

一、基因获得的方法和步骤

吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)(记载过吊石苣苔(Lysionotuspauciflorus)的非专利文献是：黄梅,李美君,黄红,等.贵州省野生苦苣苔科物种多样性与地理分布[J].广西植物,2022,42(2):210-219.DOI:10.11931/guihaia.gxzw202008055.)样品植株采自中国贵州省安龙县仙鹤坪镇，根、茎、叶、花4个组织样品快速存于-80℃用于多组学等实验。基于吊石苣苔三代全长转录组，结合CYP450保守结构域和Nelson分类原则，获得175个278aa-570aa A类型的LpCYP450s序列，通过二代+三代转录组和广靶代谢组联合分析，着重关注LpCYP82D-1。

合成LpCYP82D-1基因，并连接在酵母表达载体pESC-His载体(记载过酵母表达载体pESC-His载体的非专利文献是：Gao R,Lou Q,Hao L,Qi G,Tian Y,Pu X,He C,Wang Y,Xu W,Xu Z,Song J.Comparative genomics reveal the convergent evolution ofCYP82D and CYP706X members related to flavone biosynthesis in Lamiaceae andAsteraceae.Plant J.2022Mar；109(5):1305-1318.doi:10.1111/tpj.15634.Epub2021Dec 27.PMID:34907610.)上，连接位点为BamHI-F和SalI-R。连接体系直接转化TransT1感受态(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB101-01)，挑选阳性克隆测序(菌落PCR体系总体积为20μL：13μL Mix Buffer，1μL模板，1μL引物和5μL水，程序如表1，引物如表2)，与transcript序列比对，核苷酸序列与转录组原数据100％相似度。

表1菌落PCR反应程序

表2菌落PCR所用引物序列

利用qRT-PCR检测LpCYP82D-1在组织中真实表达水平，设计120bp左右的LpCYP82D-1特异条带的引物，如表3，以Lp-Actin为看家基因，qPCR程序如表4。在贵州省安龙县仙鹤坪收集吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus)的根、茎、叶和花，提取RNA，将浓度调整一致后反转录为cDNA，用于qPCR模板。最终获得LpCYP82D-1在吊石苣苔四个组织中的表达水平，如图1。LpCYP82D-1在花中表达量显著高于根、茎、叶，转录组表达量趋势与qPCR表达量趋势一致。

表3qRT-PCR所用引物序列

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表4qRT-PCR反应程序

二、获得基因序列以及其编码的蛋白序列

获得的LpCYP82D-1基因含有1569个核苷酸，如序列表中序列1所示；其编码522个氨基酸的蛋白，如序列表中序列2所示，将其编码的蛋白命名为LpCYP82D-1。

三、基因功能验证

我们借助真核系统对基因功能进行验证，前文已构建pESC-His-LpCYPs载体，测序确认序列正确后，将载体成功转入真核表达菌株WAT11(由Gao提供，记载过真核表达菌株WAT11的非专利文献是：Gao R,Lou Q,Hao L,Qi G,Tian Y,Pu X,He C,Wang Y,Xu W,Xu Z,Song J.Comparative genomics reveal the convergent evolution of CYP82D andCYP706X members related to flavone biosynthesis in Lamiaceae andAsteraceae.Plant J.2022Mar；109(5):1305-1318.doi:10.1111/tpj.15634.Epub2021Dec 27.PMID:34907610.)进行酵母体内验证。

LiCl法酵母转化操作步骤如下：

1.取数个YPAD培养基上生长状态良好的酵母菌落于5mL YPAD液体培养基中，30℃振荡过夜培养；

2.取1mL酵母菌液加入50mL YPAD培养基中，继续培养直到其OD600至1.0；

3.3000g离心5分钟收集酵母细胞；

4.加入无菌蒸馏水20mL清洗，室温3000g再次离心5分钟，弃上清；

5.加入1mL无菌的浓度为0.1mol/L LiCl溶液重悬细胞，转入1.5mL离心管，12000rpm，离心15秒，去上清；

6.用0.5-1mL 0.1mol/L LiCl重悬细胞，30℃，200rpm振荡摇菌30分钟；

7.每个转化样品取5μL鲑鱼精DNA(1μg/μL)，94℃热变性5分钟，然后迅速放于冰上冷却2分钟；

8.分装酵母感受态细胞100μL/管，加入5μL(约1μg)质粒和5μL热变性的鲑鱼精DNA，混匀。然后加入600μL的PEG和LiCl混合溶液(终浓度为40％PEG和0.1mol/L的LiCl)，涡旋混匀；

9.30℃水浴热激30分钟，每隔5分钟轻弹混匀；42℃水浴15分钟；

10.12000rpm，离心15秒，吸去上清。加入1mL无菌蒸馏水，涡旋混匀，12000rpm，离心15秒，去上清；

11.加入1mL无菌蒸馏水悬浮细胞，均匀涂于酵母营养缺陷(-His)平板上；

12.30℃培养2-3天，挑选单克隆进行PCR验证(如图2)。挑选3个LpCYP82D-1-pESC-His单克隆，在1500bp处均有阳性条带。

重组蛋白的诱导、酶活分析和产物鉴定如下：

1)重组蛋白的诱导

分别挑取LpCYP82D-1-pESC-His与pESC-His单克隆菌落于2mL SD-His液体培养基中30℃中振荡(200rpm)培养2-3天。

取0.1mL培养的菌液加入20mL新鲜的SD-His培养液(含2％葡萄糖)中，30℃摇床(200rpm)培养2-3天后，将菌液转移到50mL无菌离心管中，1000g离心10min，收集菌沉淀，去上清。用20mL无菌去离子水重悬菌沉淀，1000g离心5min，收集菌沉淀，去上清，重复2-3次。

加入50mL SG-His液体培养基(含2％半乳糖)重悬菌体至600nm的OD值为1.0，取1mL菌液到15毫升无菌离心管中，加入终浓度为100μM的芹菜素(如表5)，30℃摇床(200rpm)诱导反应16h。

2)酶活性的测定

取500μL菌液进行酶活检测，用三倍体积乙酸乙酯终止反应，13,000rpm离心5min，取上清，45℃低压浓缩1h，加入200μL甲醇复溶。取2μL上样。

表5重组蛋白酵母体内酶活反应体系

3)酶活产物分析与鉴定

利用真核表达系统，成功表达了LpCYP82D-1的重组蛋白，进一步酶活分析来鉴定了它们的功能。酶活反应的受体为芹菜素。分析酶活产物UPLC图谱(图3)，发现LpCYP82D-1对芹菜素具有活性。

UPLC条件：

UPLC型号：Nexera UHPLC LC-20A system(SHIMADZU,Japan)。

流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：乙腈。

洗脱梯度：0-7min，5％-100％B；7-9min，100％B；9-10.5min，100％-5％B；10.5-11.5min,5％B。

DAD检测波长：335nm。

利用UPLC鉴定酶活产物，发现LpCYP82D-1对于受体为芹菜素的酶活反应产物峰只有一个，其保留时间和紫外光谱图与标准品异野黄芩素基本一致，初步判断产物为异野黄芩素(图3)。利用质谱鉴定酶活产物，发现产物峰I的MS信息与标准品异野黄芩素一致，主要离子碎片均为285，213和117(图4)。综上所述，体外酶活证据显示LpCYP82D-1编码催化8位羟基化芹菜素生成异野黄芩素的羟基转移酶。图5为芹菜素(左，底物)和异野黄芩素(右，产物)分子结构式，异野黄芩素是8-羟基芹菜素，LpCYP82D-1能够将羟基转移到芹菜素A环8位上，生成异野黄芩素。

质谱条件：

质谱前的样品准备同UPLC前的样品准备。

利用UPLC MS/MS对样品进行分离，柱子为InfinityLab Poroshell 120EC-C18column(2.1*50mm 1.9-micron；Agilent)，流动相与UPLC相同，洗脱梯度为0min，5％B；7min，95％B，最后95％B平衡(7-8min)，流速为0.30mL/min，检测波长同上。

UPLC MS/MS质谱条件，电喷雾离子化，全离子扫描，负离子模式negative-ion(EI)质谱分析。负离子模式条件如下：gas temperature：300℃，gas flow：6L/min，nebulizer：30psi，sheath gas temperature：300℃，sheath gas flow：11L/min，capillary voltage：2500V，nozzle voltage：2000V，collision energy：30V。异野黄芩素在负离子模式下的特征离子为285.1，213.1和117.1。

4)LpCYP82D-1的催化活性

为进一步了解LpCYP82D-1重组蛋白的催化特性，我们检测了LpCYP82D-1对于芹菜素的催化活性。酶活反应体系同2)。以底物转化率(％)作为催化活性比较参数，计算公式＝产物峰面积/(产物峰面积+底物峰面积)*100％。实验发现，LpCYP82D-1重组蛋白对于芹菜素转化生成异野黄芩素的效率高于50％(如图6)，表明重组蛋白LpCYP82D-1对于芹菜素的催化效率高。

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。