一种检测作物早衰基因的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及作物育种技术领域，尤其涉及一种检测作物早衰基因的分子标记及其应用。

背景技术

早衰在农业生产过程中是一种常见的现象，给农作物生产造成重大损失。例如在水稻中表现为叶片黄化、叶枯，甚至整株青枯而倒伏等，显著减少籽粒中干物质的积累，导致籽粒充实度低、空秕率高，最终阻碍产量潜力的发挥，并导致品质的下降。

现有技术中已经发现了一些早衰相关分子标记，但对于作物分子辅助标记育种来说，还远远不够。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测作物早衰基因的分子标记及其应用，用以填补现有技术的空缺。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测作物早衰基因的分子标记，所述分子标记的上游5’端到3’端的正向序列如SEQ ID NO.1所示，下游3’端到5’端的反向序列如SEQ ID NO.2所示

本发明还提供上述检测作物早衰基因的分子标记在作物早衰相关研究中的应用。

优选的，用于检测作物早衰基因。

优选的，用于预测作物是否早衰。

优选的，检测方法包括如下步骤：

采用权利要求1所述的作物早衰基因的分子标记对样品基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；

将PCR产物进行测序，当测序结果如SEQ ID NO.3所示，说明所述样品为苗期早衰型。

优选的，用于抗衰老作物的分子辅助育种。

优选的，所述作物为禾本科作物。

优选的，所述禾本科作物为水稻、二穗短柄草、小麦和/或山羊草。

本发明的技术效果和优点：

本发明提供的检测作物早衰基因的分子标记能够检测到基因LOC_Os03g31550编码区的第11个外显子出现的4个碱基AACA缺失，导致移码突变形成的早衰相关基因。含有该早衰相关基因会使水稻植株尿酸含量降低、有害物质增加、酶活性降低；叶绿体超微结构异常，光合性能降低。经研究得知，含有上述早衰相关基因的水稻会出现稳定的早衰表型，大田环境下播种后第10d出现第2叶和第3叶的叶尖干枯早衰表型，衰老持续到成熟期。分蘖期叶肉细胞光合色素含量明显降低，叶绿体结构异常、光损伤严重、光合性能减弱，尿酸含量降低。本发明为进一步深入研究基因调控衰老提供了分子基础，也为利用早衰基因培育出抗早衰新品种提供参考。

附图说明

图1为突变体es33和日本晴、浙粳99的碱基序列；

图2为突变体es33和浙粳99的氨基酸序列；

图3为突变体es33和浙粳99分蘖盛期尿酸含量；

图4为突变体es33和浙粳99苗期表型；

图5为突变体es33和浙粳99分蘖期、抽穗期表型；

图6为突变体es33和浙粳99成熟期主穗表型；

图7为突变体es33和浙粳99不同时期光合色素含量；

图8为突变体es33和浙粳99分蘖盛期叶绿素荧光动力学参数；

图9为突变体es33和浙粳99分蘖盛期叶绿体超微结构；

图10为突变体es33和浙粳99分蘖盛期生理指标；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1扩增与测序验证

通过甲基磺酸乙酯化学诱变浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所和浙江勿忘农种业股份有限公司选育的常规单季晚粳稻浙粳99，在浙江省农业科学院杭州试验田和海南陵水南繁基地经过多代自交得到了稳定遗传的早衰表型差异明显的6个突变体，从中选取一个突变体t46，命名为es33(earlysenescence 33)。

用日本晴和浙粳99作为对照，对突变体es33、日本晴(Nipponbare)和浙粳99(WT)中基因LOC_Os03g31550(Gene ID:4333171)进行扩增和测序。设计含有SpeI酶切位点的上游引物，序列为：AGCCCAGATCACTAGTATGGGGTCGCTCACCAGGGCGGA，如SEQ ID NO.1所示，和含有BamHI酶切位点的下游引物，序列为：TGCTCACCATGGATCCTACACTAAGCTTGGGACGGTAATAT，如SEQ ID NO.2所示。

采取测序验证突变体es33中ES33基因是否有突变，在野生型浙粳99和突变体es33极端单株之间进行PCR扩增和测序验证。

PCR扩增在PCR仪中进行。PCR扩增体系包含2μLToYoBo dNTPs、5μL 2×PCRBufferforKOD FX、0.2μLKOD FX、0.2μL DNA、0.3μL前引物和0.3μL后引物、2μL ddH

引物合成和测序工作由杭州擎科生物技术有限公司完成，结果显示突变体es33中LOC_Os03g31550编码区的第11个外显子出现4个碱基AACA缺失，造成移码突变，突变体es33的扩增产物序列为：ATGGGGTCGCTCACCAGGGCGGAGGAGGAGGAGACGGCGGCGGCCGAGGAGTGGTCGGGCGAGGCGGTCGTCTACGTCAACGGCGTCCGCCGCGTGCTCCCCGACGGCCTCGCTCACCTCACCCTGCTCCAATACCTCAGAGACATTGGTCTTCCTGGAACAAAGCTTGGATGTGGTGAAGGTGGCTGTGGAGCCTGCACTGTGATGGTCTCATGCTATGATCAAACTACAAAGAAGACACAGCATTTTGCAATCAACGCATGCTTGGCTCCGCTTTATTCTGTGGAAGGAATGCACATAATCACAGTAGAGGGAATTGGGAATCGTCAGCGAGGTTTGCACCCAATCCAGGAACGTTTAGCCATGGCCCACGGTTCACAATGTGGATTTTGCACCCCTGGTTTTGTGATGTCGATGTATGCATTGCTGAGATCAAGTGAACAGCCTCCTACTGAAGAGCAGATTGAAGATAGCCTTGCAGGAAATTTATGTCGCTGTACTGGCTACAGACCAATAATAGACGCCTTCCGTGTTTTCTCGAAAAGAGATGATCTTTTGTACAACAATTCATCTCTGAAAAATGCAGATGGCCGACCTATCTGCCCTTCAACAGGAAAACCATGTTCCTGCGGAGATCAGAAAGACATCAATGGTAGTGAATCTTCATTATTGACACCTACGAAAAGCTACTCACCTTGTTCATACAATGAGATTGATGGAAATGCGTACAGTGAGAAAGAACTCATTTTCCCCCCAGAACTTCAGTTGAGAAAAGTTACGTCACTTAAATTGAATGGGTTTAATGGGATTCGGTGGTATAGACCTCTTAAACTAAAGCAAGTATTGCATTTGAAAGCATGCTACCCAAATGCAAAACTAATCATTGGTAACTCTGAAGTAGGAGTTGAAACAAAGTTCAAGAATGCCCAGTATAAGGTCTTGATCTCAGTTACTCATGTTCCAGAGCTTCATACCCTTAAAGTGAAAGAGGATGGTATACATATTGGTTCTTCTGTAAGACTTGCACAGCTCCAAAATTTCCTCAGAAAGGTTATTTTAGAGCGTGATTCACATGAAATTTCATCCTGTGAGGCAATACTGCGGCAATTAAAATGGTTTGCTGGGACACAAATCAGGAATGTTGCTTCTGTTGGAGGTAACATTTGTACTGCTAGTCCAATATCAGATCTAAATCCACTTTGGATGGCTACAGGTGCAACGTTTGAGATAATTGATGTGAACAATAATATTAGGACCATTCCTGCAAAAGATTTTTTTCTGGGTTATCGTAAAGTTGACTTAAAACCTGATGAGATATTGCTCTCTGTTATACTGCCATGGACAAGGCCATTTGAATTTGTCAAAGAATTCAAGCAGGCACATAGAAGGGAGGATGACATTGCGTTGGTGAATGCTGGAATGCGTGTCTATATAAGAAAAGTTGAAGGTGATTGGATAATTTCGGATGTTTCAATTATCTATGGAGGGGTAGCTGCAGTTTCACACCGTGCTTCAAAAACTGAAACCTTTCTCACTGGAAAAAAATGGGACTATGGATTGTTGGATAAGACTTTTGATCTGTTGAAAGAAGACGTAGTTCTGGCTGAAAATGCACCTGGTGGAATGGTTGAATTTCGCAGTTCACTTACTTTGAGTTTCTTTTTCAAATTTTTCCTTCATGTTACTCATGAAATGAATATAAAAGGATTTTGGAAGGATGGATTACATGCAACCAATCTTTCAGCCATACAGTCTTTCACTAGACCTGTCGGTGTTGGAACTCAATGTTATGAATTGGTTAGACAAGGAACTGCAGTTGGCCAACCTGTGGTTCACACATCAGCTATGCTTCAGGTTACTGGTGAAGCGGAATATACTGATGACACACCGACACCCCCCAATACCTTGCATGCTGCTCTGGTGCTGAGTACGAAAGCTCACGCACGCATATTATCTATTGATGCTTCACTTGCCAAATCTTCCCCTGGGTTTGCGGGTCTCTTCCTTTCAAAAGACGTGCCTGGCGCTAACCATACTGGGCCTGTTATCCATGACGAGGAGGTTTTTGCATCTGATGTTGTTACATGTGTTGGCCAGATTGTTGGACTTGTTGTGGCAGATACCCGTGATAATGCAAAAGCTGCTGCAAATAAAGTCAATATTGAGTATTCTGAACTTCCAGCAATTTTATCCATAGAGGAAGCTGTGAAAGCTGGTAGCTTTCATCCAAATAGCAAGAGATGCCTAGTAAAAGGTAATGTTGAACAATGTTTTCTGTCGGGTGCATGCGATAGAATTATAGAAGGAAAAGTACAAGTTGGAGGTCAAGAGCACTTCTACATGGAGCCTCAGAGCACTCTTGTATGGCCAGTTGATTCTGGAAATGAAATTCATATGATTTCATCTACCCAGGCTCCCCAGAAGCACCAAAAGTATGTTGCTAATGTTCTTGGTCTTCCACAATCAAGAGTTGTTTGCAAGACTAAGCGTATTGGTGGTGGATTTGGTGGAAAAGAAACCAGATCAGCAATATTTGCTGCAGCAGCATCTGTAGCTGCTTATTGTTTAAGGCAGCCTGTAAAGCTTGTTTTGGACAGGGATATTGACATGATGACAACTGGACAGAGGCACAGTTTCCTAGGGAAGTACAAGGTGGGATTTACCGATGATGGGAAGATATTGGCCTTAGACCTTGATGTTTATAACAATGGTGGTCATTCACATGATTTGTCCCTTCCAGTCCTGGAGCGTGCTATGTTTCATTCAGACAATGTCTATGATATACCAAATGTCAGAGTCAATGGGCAAGTATGTTTCACAAATTTCCCAAGCAATACTGCTTTCAGAGGTTTTGGTGGTCCACAAGCTATGCTGATTGCAGAGAATTGGATTCAGCACATGGCTACAGAACTCAAGCGAAGTCCTGAGGAGATAAAAGAACTTAATTTTCAAAGTGAGGGATCTGTGCTTCATTATGGCCAGTTGCTTCAAAATTGTACAATACATTCAGTATGGGATGAACTAAAGGTTTCTTGTAATTTTATGGAAGCTCGCAAAGCTGTAATTGATTTTAACAATAATAACCGTTGGAGAAAGCGTGGCATTGCTATGGTTCCCACCAAGTTTGGGATATCCTTCACTACAAAATTCATGAATCAGGCTGGTGCTTTAGTGCAAGTTTACACTGATGGAACTGTCCTTGTAACGCATGGTGGGGTTGAAATGGGGCAGGGTTTACACACAAAGGTAGCCCAAGTTGCGGCTTCATCATTCAATATCCCTCTTAGCTCTATATTTATCTCAGAAACAAGCACTGATAAGGTACCAAATGCCCAACAGCAGCCTCTGCTAGTTCAGATTTATATGGTGCTGCAGTTTTGGATGCTTGTCAGCAAATTATGGCTCGGATGGAACCTGTTGCTTCAAGAGGAAACCACAAGTCCTTTGCTGAGTTGGTTCTAGCATGCTACCTGGAAAGGATAGATCTCTCTGCTCATGGATTTTATATCACTCCTGATGTTGGGTTTGACTGGGTGTCTGGCAAGGGAACTCCATTCTACTATTTCACATACGGAGCAGCATTTGCAGAAGTTGAAATTGATACCCTAACTGGGGATTTCCACACAAGGACAGTAGATATTGTTATGGATCTTGGCTGTTCAATTAATCCGGCTATTGATATTGGCCAGATTGAAGGAGGTTTTATCCAAGGATTAGGTTGGGCGGCCCTGGAAGAACTAAAATGGGGGGATGATAACCACAAGTGGATTCGACCTGGACATCTTTTCACTTGTGGGCCTGGCTCTTACAAAATACCCTCTGTAAATGATATACCTCTAAACTTCAAGGTCTCACTTTTGAAGGGCGTTTTGAATCCAAAGGTCATTCACTCATCCAAGGCTGTAGGAGAGCCACCGTTTTTCCTCGGTTCAGCCGTCTTGTTTGCCATAAAGGATGCGATATCTGCCGCAAGAGCTGAGGAGGGTCACTTCGACTGGTTCCCACTCGACAGCCCAGCAACACCGGAAAGAATAAGAATGGCATGCGTGGATTCCATCACAAAGAAATTTGCTAGCGTATATTACCGTCCCAAGCTTAGTGTATAG，如SEQ ID NO.3所示，序列对比结果如图1所示。

用DNAMAN软件比对突变体es33与野生型浙粳99的氨基酸序列，结果显示4个碱基缺失造成的移码突变导致翻译提前终止，如图2所示。

实施例2基因功能差异分析

分蘖盛期，分别取3株突变体es33和野生型浙粳99相同部位的叶片，冻于液氮中，用Grace尿酸含量生物检测试剂盒测定鲜重0.1g叶片中尿酸含量，三次重复。结果：与野生型浙粳99相比，突变体es33分蘖盛期叶片中尿酸含量降低43％，如图3所示，图3中*：显著差异，0.01

检测结果说明突变体中XDH催化生成尿酸的酶促反应被阻滞，推测基因ES33突变导致蛋白XDH结构的改变，造成酶活性的降低，酶促反应受阻。这一结果为确定基因ES33突变导致XDH酶活性降低进一步造成突变体es33植株尿酸含量降低的研究奠定基础。

实施例3表型特征及农艺性状分析

将野生型浙粳99和突变体es33自然环境下生长在有正常管理模式的同一块大田中，对不同的生长阶段表型进行记录，结果发现突变体es33与野生型浙粳99有着明显的表型差异，苗期表型如图4所示，图4中A、B、C、D分别是播种后第10、14、21和28d野生型浙粳99和突变体es33的表型，标尺为1cm；分蘖期、抽穗期表型如图5所示，图5中A、B分别是分蘖期和抽穗期野生型浙粳99和突变体es33的表型，标尺为10cm。

结果显示：相比于浙粳99的正常表型，突变体es33在播种后第10d出现早衰现象，第2叶和第3叶的叶尖退绿变黄干枯，叶尖枯黄现象随着生长逐渐明显，第28d除了新叶之外，其他叶片叶尖均出现枯黄衰老现象；突变体es33在分蘖期衰老表型明显，几乎所有叶片叶尖干枯衰老，整株分蘖少，植株存在一定程度变矮现象；抽穗期突变体es33植株矮化明显，抽穗延迟，分蘖数明显变少，整株所有叶片出现叶尖干枯表型；成熟后突变体es33矮小枯黄，衰老严重。

大田环境生长到成熟期，对突变体es33和野生型浙粳99进行农艺性状调查统计，结果如表1所示：

表1突变体es33和浙粳99的农艺性状

注：数值为平均值±标准差；*：显著差异，0.01

突变体es33和浙粳99成熟期主穗表型如图6所示。

结果显示，与野生型浙粳99相比，突变体es33的株高降低约32％、单株分蘖减少约50％、穗长缩短约22％、每穗粒数减少约49％、每穗实粒数减少约79％、结实率降低约60％、千粒重降低约28％，差异都达到了极显著的水平；粒宽变窄约12％，达到差异显著水平，而粒长相比较于野生型浙粳99无明显变化。

综合对突变体es33和野生型浙粳99早衰表型对比以及成熟期农艺性状调查数据显示，突变体es33在苗期就出现早衰表型，并且各个时期都要比野生型表现出明显的早衰，每穗实粒数和结实率严重下降，千粒重明显降低，稻谷产量和品质受到较大影响。

实施例4光合色素含量变化和叶绿素动力学参数分析

为了确定突变体es33叶尖干枯表型是否由光合色素含量变化导致，测定了大田环境下生长的野生型浙粳99和突变体es33在苗期、分蘖初期和分蘖盛期时相同部位叶片光合色素含量。

苗期、分蘖初期和分蘖盛期，上午10：00在大田取长势良好且均匀的突变体es33和浙粳99植株各3株相同部位的叶片0.1g，剪成2×2mm

Chla含量(mg·g

Chlb含量(mg·g

Car含量(mg·g

OD

V：光合色素提取液总体积(mL)W：叶片鲜重(g)

结果如图7所示。

由图7可知，突变体es33在早衰表型出现时期即苗期叶绿素a和叶绿素b的含量分别低于野生型约18％和37％，类胡萝卜素的含量没有明显变化，表明突变体es33的叶尖早衰退绿表型主要是叶绿素a和叶绿素b含量下降所致，而叶尖发黄是类胡萝卜素的含量没有明显下降所致；分蘖初期，突变体es33的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别低于野生型约26％、9％和26％，均达到了差异极显著水平；分蘖盛期，突变体es33的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别低于野生型约43％、48％和34％，均达到了差异极显著水平，数据表明从苗期开始，突变体es33的早衰伴随着光合色素含量的下降，随着生长进程的推进，早衰逐渐严重，光合色素含量下降程度也在加大，推测突变体es33叶尖早衰表型与光合色素含量下降有关。

通过测定突变体es33叶片叶绿素动力学参数，确定随着衰老的进行，其光合能力是否减弱。在分蘖盛期对突变体es33和野生型浙粳99叶尖进行了叶绿素荧光动力学参数的测定，于分蘖盛期从大田取突变体es33和野生型浙粳99植株各3株，黑暗处理20min，使用Imaging(德国Walz，PAM-2500)叶绿素荧光快速成像仪和Imaging win软件处理和分析叶绿素荧光参数并成像，将待测植株相同部位的叶片放在PAM-2500仪器镜头下，测定Fv/Fm和Y(NO)值并成像，三次重复。结果显示，突变体es33的Fv/Fm低于野生型约40％，Y(NO)值高于野生型约2.3倍，如图8所示，图8中：A：分蘖盛期野生型和es33叶片Fv/Fm；B：分蘖盛期野生型和es33叶片Y(NO)；C：分蘖盛期野生型和es33叶片叶绿素荧光动力学参数对比柱状图；*：显著差异，0.01

其中Fv/Fm是最大光化学量子产量，亦称最大PSⅡ的光能转换效率，该值越小表示光转换效率越低，Y(NO)是光损伤的重要标志，Y(NO)值越大，表明入射光超过了植物能接受的程度，植物已经受到损伤或者继续照光的植物将要受到损伤。由图8可知，与野生型浙粳99相比，突变体es33光转换效率较低，且受到严重损伤。由此说明随着衰老的进行，突变体es33的光合能力减弱。

实施例5叶绿体超微结构的变化和光合指标分析

在苗期突变体es33刚刚出现早衰表型时，透射电镜观察到野生型和突变体叶尖叶绿体的超微结构，大田环境下突变体es33叶片出现早衰表型时，分别取相同环境下突变体es33和野生型浙粳99相同部位的叶片，避开主脉位置用手术刀切成2mm×2mm的小片，浸入2.5％戊二醛溶液，抽真空固定，4℃过夜；用0.1M的磷酸缓冲液(pH＝7)漂洗样品3次，每次15min；用1％锇酸溶液固定1～2h后；经过0.1mol·L

由图9可知，野生型浙粳99叶绿体形状规则，基粒数量较多，基粒堆积致密，类囊体片层结构排列紧密有序，叶绿体结构完整；而突变体es33叶绿体发育畸形、形状不规则，基粒数明显减少，类囊体疏松紊乱，嗜锇颗粒变大、数量大约增多5倍，表明突变体es33的早衰伴随着叶绿体结构发育不正常。

在分蘖盛期，选择天气晴朗，光合作用稳定的上午10：00，田间用Li-COR(美国，LI-6400XT)便携式光合作用测量系统分别测定突变体es33和野生型浙粳99植株相同部位叶片的净光合速率(μmol CO

表2突变体es33和野生型浙粳99的光合性能

注：数值为平均值±标准差；*：显著差异，0.01

由表2可知，突变体es33净光合速率低于野生型57％、气孔导度小于野生型63％、蒸腾速率慢于野生型41％，数据进一步证实了突变体的光合能力下降；而胞间CO

实施例6早衰生理指标变化分析

分蘖盛期，大田中分别取3株突变体es33和野生型浙粳99相同部位的叶片，迅速冻于液氮中，用Grace生物检测试剂盒分别测定鲜重0.1g叶片中丙二醛(MDA)含量、过氧化氢(H

丙二醛、过氧化氢和超氧阴离子等有害物质在细胞中大量积累会打破水稻自身平衡，伴随着蛋白质水解、酶活性降低和DNA降解等一系列现象，最终导致细胞衰老或死亡。突变体es33叶片细胞中有害物质的积累和酶活性的降低说明突变体细胞已受到极大的损伤，衰老正在进行。

实施例7遗传分析

2019年7月在浙江省农业科学院海宁基地，以野生型浙粳99为母本，与突变体es33杂交，获得F

结果显示：F

由以上实施例可知，本发明提供的分子标记能够用于检测基因LOC_Os03g31550编码区的第11个外显子出现的4个碱基AACA缺失，导致移码突变形成的早衰相关基因。含有该早衰相关基因会使水稻植株尿酸含量降低、有害物质增加、酶活性降低；叶绿体超微结构异常，光合性能降低。经研究得知，含有上述早衰相关基因的水稻会出现稳定的早衰表型，大田环境下播种后第10d出现第2叶和第3叶的叶尖干枯早衰表型，衰老持续到成熟期。分蘖期叶肉细胞光合色素含量明显降低，叶绿体结构发生变化、光损伤严重、光合作用减弱，尿酸含量降低。本发明为进一步深入研究基因调控衰老提供了分子基础，也为利用早衰基因培育出抗早衰新品种提供参考。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。