与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用。

背景技术

番鸭有瘤头鸭、洋鸭、西洋鸭、香鸭雁、麝香鸭等别称。番鸭是鸭科栖鸭属，疣鼻栖鸭种，与家鸭同科不同属。目前在我国的番鸭羽色主要有黑白两种。此外，有少量黑白夹杂的花羽。我国引进番鸭已有200多年的历史，目前在国内许多地方都有养殖。在繁殖季节，雄性番鸭会散发出麝香气味，所以又名麝香鸭。雌性番鸭具有就巢性，种母鸭一般利用年限为两年，种公鸭利用年限一般为1～1.5年。番鸭是优良的瘦肉型鸭品种之一，具有皮薄肉嫩、生长速度快、耐粗饲和产肝性能好等特点。产蛋合格数和300日龄产蛋量等性状是鉴定番鸭的繁殖性能的关键指标。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是指基因组DNA序列由于插入、缺失、颠换和转换等单个碱基变化而引起的基因组DNA多态性，具有稳定遗传，易于检测等特性。SNP可用于分子标记辅助选择(Molecular Mark-assistSelection,MAS)，提高选种准确性和选育效果。

酪氨酸转氨酶(tyrosine aminotransferase，TAT)是酪氨酸降解过程第一阶段的限速酶，能使酪氨酸转氨转化成羟基苯丙酮。之前的研究结果表明TAT是肝脏中特异表达的酶，活性最高。但近些年有结果显示，TAT在输卵管、睾丸和卵巢等生殖器官中也有表达。还有研究称TAT是雏鸡在输卵管发育和分化过程中由雌激素诱导的基因。TAT基因的多个SNP位点与番鸭繁殖性能显著相关。因此，可以结合番鸭的繁殖性能指标提供一种新的SNP分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种与番鸭繁殖性状相关的分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记可以准确的鉴定白番鸭不同周龄的繁殖性状，以为番鸭的选育提供科学数据。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与番鸭繁殖性状相关的分子标记，所述分子标记包括SNP3和SNP4，其中，所述SNP3位于如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的g.254G>A位点，碱基突变为G或A；所述SNP4位于如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的g.270C>T位点，碱基突变为C或T。

本发明还提供一种上述的分子标记的检测试剂在鉴别番鸭繁殖性状中的应用。

本发明还提供一种检测上述的分子标记的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：2-3所示。

本发明还提供一种上述引物组在鉴别番鸭繁殖性状或制备鉴别番鸭繁殖性状产品中的应用。

本发明还提供一种用于鉴别番鸭繁殖性状的试剂盒，包含上述引物组。

本发明还提供一种鉴别番鸭繁殖性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测番鸭基因组DNA，利用上述引物组扩增，获得扩增产物；

(2)对所述扩增产物测序，检测上述分子标记的基因型；

(3)根据基因分型结果，判断所述待测番鸭的繁殖性状。

进一步地，在步骤(3)中，若SNP3分子标记的基因型为AA和/或SNP4分子标记的基因型为CT时繁殖性状最佳。

进一步地，在步骤(1)中，所述扩增的扩增体系为：模板DNA 2μL、Mix 26μL和上下游引物各2μL。

进一步地，在步骤(1)中，所述扩增的反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s，15个循环，每个循环退火温度减1℃；98℃变性10s，50℃退火10s，72℃延伸15s，25个循环；72℃最终延伸3min。

本发明还提供一种上述的分子标记或上述引物组或上述试剂盒在番鸭繁殖性状选育中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过分析TAT基因，发现该基因外显子区有多个与番鸭繁殖性能显著相关的SNP位点，为MAS提供新的SNP分子标记，并且通过试验验证，SNP3(g.254G>A位点)与28、29、30、34、35、36、37、38、39、40周龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)，与31、32、33周龄产蛋量存在极显著相关(p<0.01)；SNP4(g.270C>T位点)与35、36、37、38、39、40周龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)。其他SNP位点与繁殖性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。可见，本申请提供的分子标记可以准确的鉴定白番鸭不同周龄的繁殖性状，以为番鸭的选育提供科学数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为TAT基因5’UTR区SNP1-SNP6不同基因型测序峰图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例

1、材料与方法

1.1动物样品

选取652只60周龄的雌性白番鸭(广东温氏南方家禽育种有限公司仁马种鸭场)。采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。记录选择群体的家系信息和开产日龄(AFE)、每日产蛋量、总产蛋数以及产蛋合格数等繁殖性状。

1.2主要试剂

血样DNA提取试剂盒(品牌：OMEGA；货号：D3392；广州飞扬生物工程有限公司)、金牌Mix(green)(品牌：擎科；货号：TSE101；北京擎科生物科技有限公司)、DNA marker(品牌：诺维赞；货号：MD101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：TSJ001；北京擎科生物科技有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1引物设计

根据Ensemble公布的绿头野鸭(Mallard)TAT基因的序列(ENSAPLG00000009051)，使用NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)的Primer-BLAST工具设计引物，由广州擎科生物科技有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示。

表1 PCR扩增引物序列

1.3.2血样DNA提取

参照血样DNA提取试剂盒操作手册提取血样DNA。

1.3.3 TAT基因外显子序列的PCR扩增

以上述652只半同胞白番鸭(同父本)的血样基因组DNA作为模板，遵循以下反应体系进行：模板DNA 2μL、金牌Mix 26μL、上游引物2μL、下游引物2μL。

反应程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s(进行15个循环，每个循环退火温度减1℃)，98℃变性10s，50℃退火10s，72℃延伸15s(进行25个循环)，72℃最终延伸3min，4℃保存。PCR产物交由广州擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。

1.3.4 SNPs确定与基因分型

利用Snapgene软件对PCR产物的Sanger测序结果进行序列峰图的分析以确定潜在SNP位点。通过DNAstar 11软件的SeqMan工具比对每个样本的测序数据，进行基因分型。

1.3.5基因型与繁殖性状关联分析

利用Haploview 4.2软件分析TAT基因的多个SNP位点得到单倍型块内位点，再经PHASE 2.1软件分析单倍型块内位点在652个白番鸭个体中的分布，得到单倍型数据。

SNPs位点与基因型对应个体的繁殖性状数据，采用SAS 9.4GLM程序包进行关联分析。

2、结果

2.1 TAT基因外显子序列PCR扩增及SNP筛选

选取652只白番鸭个体，以每个个体的血样DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)进行Sanger测序，将测序后的峰图进行比对分析，共检测到6个SNP位点，分别为：g.120G>T(SNP1)，g.122G>A(SNP2)，g.254G>A(SNP3)，g.270C>T(SNP4)，g.312G>A(SNP5)和g.341C>A(SNP6)，如图1所示。

SEQ ID NO：1：

TGGCTAGATCTTGTGTGAGGCAGCAGGCAGAGCTGTGTCCAGCCAGCCCCACAACCCCCTGCCTGTAGGCAGCTGCTGTCCTGCTGCTTCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCACAGACCCCCTAAGCTCATGGAAAGAAGCAGACACTTCTCTCTTTTCCACTGCAGCTCCCACACTCTCTGGTATCTGGTGTCTGTGGTCTCCATATACTCAGTATCTTCACCCCACAGTGGTCTGTGCTGCCCATGAACAAGCTGCAGGCAGGGGCACATGGCTGATTCTGCACCAGGACCCGCAGCCTACGGCCCTGTGTGGCCAGTAGCTCCCGTGCTGCCTGCACTCCCCCTCTGGGGCAGGAGATGGTCGTGGTCTCAGAGGACAAGAGACACTCACCCACCTCTCACCTGTCTTAACTTAGGAGGTCAGAGCTCTTTATACCAAGCCCTTTGTGCAACAAAGGGAGTAAGTTATTGTGAC。

2.2TAT基因外显子序列SNP位点与繁殖性状的关联分析

对上述6个SNP位点与繁殖性状(总产蛋数、产蛋合格数、300日龄产蛋量、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57周龄产蛋量、AFE和开产50日产蛋量)进行关联分析。

如表2所示，结果显示，g.254G>A位点与28、29、30、34、35、36、37、38、39、40周龄和AFE存在显著相关(p<0.05)，与31、32、33周龄产蛋量存在极显著相关(p<0.01)，且AA基因型的大多数性状优于AG/GG基因型；g.270C>T位点与35、36、37、38、39、40周龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)，且CT基因型的各性状均优于CC/TT基因型。其他SNP位点与繁殖性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。

表2 SNP位点与繁殖现状关联

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以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。