一种连续生产海蜇胶原蛋白抗氧化肽的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种连续生产海蜇胶原蛋白抗氧化肽的方法。

背景技术

胶原蛋白的护肤功效明确，在化妆品领域应用广泛。胶原蛋白由于其特有的氨基酸组成及独特的天然网络结构，使胶原蛋白形成了有重要功能和高拉伸强度的胶原纤维，从而具有了优良的营养特性、生物活性和功能特性。研究表明，胶原蛋白有美容护肤、延缓衰老、补钙、降血脂等功效，因此胶原蛋白被广泛应用于食品领域及化妆品领域。

海蜇中，尤其是海蜇的伞部富含胶原蛋白，而且保湿、透皮吸湿、抗氧化等活性突出，具有很高的开发利用价值。我国沿海的海蜇主要有4种，即口冠水母科海蜇、根口水母科海蜇、面蜇和黄斑海蜇。海蜇自然繁殖能力强，资源丰富。目前对海蜇的利用方式单一，只有海蜇皮加工一种。由于海蜇含水量大，且存在自溶现象，离岸不易保存，现有的加工方法处理量有限，导致了大量海蜇生物资源被浪费，且市场上的海蜇产品多为盐渍海蜇，含铝量高，对人类健康不利。另一方面，当前市场上很难买到可以直接添加到化妆品中的海蜇胶原蛋白肽类原料。海蜇胶原蛋白肽的开发仍存在提取率低、胶原蛋白肽产品含盐量高、品质不稳定、功能特性优化改性技术滞后、产业化生产滞后等问题，导致其应用受限，加之没有建立海蜇胶原蛋白肽相关标准等问题，这些都严重制约了海蜇胶原肽的应用。因此，实现高活性海蜇胶原蛋白抗氧化肽的连续化生产具有重要的现实意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种连续生产海蜇胶原蛋白抗氧化肽的方法。本发明以新鲜海蜇为原料，利用电渗析方法提取海蜇胶原蛋白，得到较高纯度的胶原蛋白产品，通过定向酶解制备高活性海蜇胶原抗氧化活性肽，大幅度提高海蜇产品的附加值，为海蜇胶原蛋白的抗氧化肽批量生产提供新方法。

本发明提供的技术方案如下：

一种连续生产海蜇胶原蛋白抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

(a)将洗净的海蜇搅碎后加热至全部熔化，然后过滤至溶液澄清；

(b)通过电渗析对步骤(a)获得的所述溶液进行除盐；

(c)将步骤(b)获得的海蜇胶原蛋白溶液进行酶解，获得海蜇胶原蛋白抗氧化肽；

其中，步骤(b)的所述电渗析包括通过装有样品原液、极水和蒸馏水的装置进行电渗析(所述电渗析为在3个缸中同时进行，也即，电渗析开始时将装有原液、极水、蒸馏水缸的3个缸同时开启运行)，其中，所述极水为质量比为2.5％～6wt％的NaCl溶液；

在所述电渗析开始时，设置装有样品原液的装置的流速为0.1～0.6m

当装置的电流大于0.1A且持续大于5min时，更换调节装有蒸馏水装置中的液体后进行重复电渗析；

当装置的电流小于0.1A时，更换装有样品原液装置中的液体，实现连续生产。

在本发明中，本发明以新鲜海蜇为原料，在将其清洗并搅碎至无明显大颗粒后，加热至海蜇全部溶化。之后，将溶化后的海蜇溶液过滤除杂，利用电渗析设备进行除盐。本发明采用特殊改进的电渗析方法，将海蜇溶液样品通过装有样品原液、极水和蒸馏水的装置进行电渗析。

在一个实施方案中，装有样品原液、极水和蒸馏水的装置分别为原水缸(注入过滤后的溶液)、浓水缸(注入极水)和淡水缸(注入蒸馏水)。

在一个实施方案中，所述调节装有样品原液、极水和蒸馏水装置的流速包括：逐渐增大装有样品原液和装有极水的装置的流速，逐渐减小装有蒸馏水装置的流速。

在一个实施方案中，所述调节装有样品原液、装有极水和装有蒸馏水装置的流速依次包括：

i)调节装有样品原液的装置的流速至0.2～0.5m

ii)调节装有样品原液的装置的流速至0.25～0.45m

iii)调节装有样品原液的装置的流速至0.3～0.4m

在一个实施方案中，首先，调节装有样品原液的装置(如原水缸)流速至0.1～0.6m

在电渗析过程中，电渗析设备的电流在固定数值超过5min不变动，且数值大于0.1A时，关闭各装置(如原水缸、浓水缸、淡水缸)电源，更换(如淡水缸)溶液，重复步骤(i)～(iii)。

在电渗析过程中，当电渗析设备的电流低于0.1A时，更换装有样品原液的装置(如原水缸)中的样品溶液，再次重复进行电渗析步骤以实现连续生产。

在本发明中，本发明对于海蜇溶液的电渗析步骤和参数进行了优化和调整，通过逐步控制装有样品原液、装有极水和装有蒸馏水装置的流速，调节电流看，控制电压，以达到持续快速脱盐的效果，使得海蜇溶液脱盐更加充分、胶原蛋白的提取效率更高。

在电渗析之前，所述加热的条件为将搅碎后的海蜇在反应釜中加热至50～80℃，反应2～8h。优选地，在加热反应至海蜇全部溶化后，用双层纱布过滤除杂，至溶液澄清。

在一个实施方案汇总，海蜇原料用清水冲洗几遍后，再用蒸馏水浸泡清洗1～2遍，取出后搅拌机搅碎至无明显大颗粒。本发明的海蜇可来源于口冠水母科海蜇、根口水母科海蜇、面蜇和黄斑海蜇中的任一种或多种。

在一个实施方案中，所述酶解为利用胰酶进行；优选地，所述胰酶为食品级胰酶。

在一个实施方案中，所述酶解的加酶量1.0～2.0wt％。所加酶的酶活为40000-100000U。

在一个实施方案中，所述酶解的时间4.5～7.5h。

在一个实施方案中，酶解结束后，将酶灭活(例如通过高温保温灭酶)，即得到海蜇胶原肽溶液。例如酶解结束后在90℃以上灭酶30min，冷却至室温后离心，获得海蜇胶原蛋白肽溶液。

在一个实施方案中，可将所述海蜇胶原肽溶液冷冻干燥后得到固体海蜇胶原肽粉末。

在另一个方面，本发明提供了所述方法制得的海蜇胶原肽在用于制备化妆品中的应用。通过本发明方法制备的海蜇胶原肽，不仅低盐，而且具有高抗氧化活性。

有益效果：

本发明提供了一种新的制备海蜇胶原肽的方法，该方法操作简单，能够连续生产，效率高，为胶原蛋白的制备提供新途径；

本发明的方法制备的胶原蛋白具有高抗氧化活性，具有优异的羟自由基清除活性和超氧阴离子清除活性，可应用于食品、医药、美容等领域，实现了对海蜇资源的高值化利用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的电渗析设备的工作原理图；

图2为本发明实施例提供的以超氧阴离子清除活性为指标的酶筛结果；

图3为本发明实施例提供的以羟自由基清除活性为指标的酶筛结果；

图4为本发明实施例提供的以胰酶作为目标酶、以超氧阴离子清除活性为指标的酶解条件(加酶量)分析；

图5为本发明实施例提供的以胰酶作为目标酶、以超氧阴离子清除活性为指标的酶解条件(温度)分析；

图6为本发明实施例提供的以胰酶作为目标酶、以超氧阴离子清除活性为指标的酶解条件(酶解时间)分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种连续生产低盐海蜇胶原蛋白抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

1.电渗析方法从海蜇溶液中提取海蜇胶原蛋白：

a)将新鲜海蜇用清水冲洗几遍，再用蒸馏水清洗1～2遍，取出后搅拌机搅碎至无明显的大颗粒；

b)将搅碎后的海蜇倒入反应釜中加热至50～80℃，反应2～8h，至海蜇全部溶化；反应结束后用双层纱布过滤除杂，至溶液澄清；

c)将步骤b)的溶液倒入电渗析设备的原水缸，利用电渗析设备进行除盐；同时将蒸馏水注入淡水缸，极水(2.5％～6％的NaCl溶液)注入浓水缸；

d)调节原水缸流速至0.1～0.6m

e)调节原水缸流速至0.2～0.5m

f)调节原水缸流速至0.25～0.45m

g)调节原水缸流速至0.3～0.4m

h)当设备电流在固定数值超过5min不变动，且数值大于0.1A时，关闭原水缸、浓水缸、淡水缸流速及电源，更换淡水缸溶液，重复步骤e)～g)，直至设备电流小于0.1A；

i)当设备电流低于0.1A时，更换原水缸，重复以上步骤，实现连续生产。

图1为本发明实施例提供的电渗析设备的工作原理图。

2.定向酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽：

2.1筛选合适的酶

以超氧阴离子及强自由基的清除活性为指标进行酶筛，每种酶按照添加量的1wt％，作用条件具体根据每种酶的最适条件进行，超氧阴离子、羟自由基清除活性按照南京建成检测试剂盒操作步骤进行。

结果见图2和图3。酶解条件：加酶量0.5～3.0％，温度35～65℃，时间0.5～10.5h。

结果显示，胰酶对超氧阴离子及强自由基的清除活性最高。因此以胰酶定向酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽。

2.2根据上一步酶筛结果选用胰酶作为目标酶，进行单因素条件分析，结果见图4、图5和图6。

最终确定酶解的条件为：加酶量0.5～3.0％，温度35～65℃，时间0.5～10.5h。以羟自由基清除活性为响应值，进行单因素条件分析，结果如下表1。

表1.以羟自由基清除活性为响应值的酶解条件分析

以超氧阴离子清除活性为响应值，进行单因素条件分析，结果如下表2。

表2.以超氧阴离子清除活性为响应值的酶解条件分析

根据正交实验确定酶解条件：加酶量1.0～2.0％，温度40～60℃，时间4.5～7.5h。

实施例1

一种连续生产低盐海蜇胶原蛋白抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

1.电渗析方法从海蜇溶液中提取海蜇胶原蛋白：

a)将新鲜海蜇用清水冲洗干净，再用蒸馏水清洗2遍，取出后搅拌机搅碎至无明显的大颗粒；

b)将搅碎后的海蜇倒入反应釜中加热至60℃，反应5h，至海蜇全部溶化；反应结束后用双层纱布过滤除杂，至溶液澄清；

c)将步骤b)的溶液倒入电渗析设备的原水缸，利用电渗析设备进行除盐；同时将蒸馏水注入淡水缸，极水(4.5％的NaCl溶液)注入浓水缸；

d)调节原水缸流速至0.2m

e)调节原水缸流速至0.25m

f)调节原水缸流速至0.3m

g)调节原水缸流速至0.35m

h)当设备电流在固定数值超过5min不变动，且数值大于0.1A时，关闭原水缸、浓水缸、淡水缸流速及电源，更换淡水缸溶液，重复步骤e)～g)，直至设备电流小于0.1A；

i)当设备电流低于0.1A时，更换原水缸，重复以上步骤，实现连续生产。

2.定向酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽：

采用食品级胰酶定向酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽。酶解的条件为：加酶量1.5％，温度50℃，时间6h。

实施例2

一种连续生产低盐海蜇胶原蛋白抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

1.电渗析方法从海蜇溶液中提取海蜇胶原蛋白：

a)将新鲜海蜇用清水冲洗干净，再用蒸馏水清洗2遍，取出后搅拌机搅碎至无明显的大颗粒；

b)将搅碎后的海蜇倒入反应釜中加热至50℃，反应8h，至海蜇全部溶化；反应结束后用双层纱布过滤除杂，至溶液澄清；

c)将步骤b)的溶液倒入电渗析设备的原水缸，利用电渗析设备进行除盐；同时将蒸馏水注入淡水缸，极水(2.5％的NaCl溶液)注入浓水缸；

d)调节原水缸流速至0.1m

e)调节原水缸流速至0.2m

f)调节原水缸流速至0.35m

g)调节原水缸流速至0.4m

h)当设备电流在固定数值超过5min不变动，且数值大于0.1A时，关闭原水缸、浓水缸、淡水缸流速及电源，更换淡水缸溶液，重复步骤e)～g)，直至设备电流小于0.1A；

i)当设备电流低于0.1A时，更换原水缸，重复以上步骤，实现连续生产。

2.定向酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽：

采用食品级胰酶定向酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽。酶解的条件为：加酶量2％，温度40℃，时间4.5h。

实施例3

一种连续生产低盐海蜇胶原蛋白抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

1.电渗析方法从海蜇溶液中提取海蜇胶原蛋白：

a)将新鲜海蜇用清水冲洗干净，再用蒸馏水清洗2遍，取出后搅拌机搅碎至无明显的大颗粒；

b)将搅碎后的海蜇倒入反应釜中加热至80℃，反应2h，至海蜇全部溶化；反应结束后用双层纱布过滤除杂，至溶液澄清；

c)将步骤b)的溶液倒入电渗析设备的原水缸，利用电渗析设备进行除盐；同时将蒸馏水注入淡水缸，极水(6％的NaCl溶液)注入浓水缸；

d)调节原水缸流速至0.3m

e)调节原水缸流速至0.35m

f)调节原水缸流速至0.4m

g)调节原水缸流速至0.5m

h)当设备电流在固定数值超过5min不变动，且数值大于0.1A时，关闭原水缸、浓水缸、淡水缸流速及电源，更换淡水缸溶液，重复步骤e)～g)，直至设备电流小于0.1A；

i)当设备电流低于0.1A时，更换原水缸，重复以上步骤，实现连续生产。

2.定向酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽：

采用食品级胰酶定向酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽。酶解的条件为：加酶量1％，温度60℃，时间7.5h。

本发明实施例1-3的方法制备的胶原蛋白具有高抗氧化活性，具有优异的羟自由基清除活性和超氧阴离子清除活性。

对比例

本发明对比了不同的除盐方式对于海蜇胶原蛋白损失的影响，结果如下表所示。

表3.不同除盐方式损失率分析

不同条件下海蜇胶原蛋白损失率如上表所示，其中离子处理、超滤、膜分离损失率较高，回收可降低海蜇胶原蛋白的损失率，但是操作过程复杂，不适合扩大化生产。其中透析除盐方式损失率最低，但其工业生产难以实现，因此最终选择较容易实现扩大化连续生产的电渗析方式除盐。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。