利用RPS基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因

技术领域

本发明涉及一种利用RPS基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因，属于生物医药技术领域。

背景技术

随着生物医药科技的发展，目前已存在大量利用真核细胞进行多肽类产品及蛋白药物的生产活动。为了符合经济效益及药品生产规范，建构高产及稳定的生产细胞系非常重要。除生产工艺的不断优化及提升外，从宿主细胞及表达载体入手则可从根本上实现提升。为实现高产及稳定两个重要目标，在近20年来研究者通过改造及筛选宿主细胞、以及构建合适的表达载体不断对细胞开发平台进行革新。

表达载体主要由启动子（如：CMV、SV40及EF1a）、目标基因阅读窗及终结序列（如：SV40 polyA及hGH poly-A）构成；在筛选稳定细胞株时，会在其中添加合适的筛选压力（如：甲氨蝶呤、L-蛋氨酸亚砜亚胺、嘌呤霉素及杀稻瘟菌素等）的抗性基因（如：DHFR及GS等）。虽然通过标准载体构型来建立稳定表达细胞系是比较容易的，但这样构建获得的细胞系通常难以满足目前工业化生产的产量要求。即便能利用筛选压力来提高产能，却也常伴有细胞系稳定性下降的风险。

基于对目标基因的表达量及稳定性的需求，许多研究人员采用了添加元件或优化目标基因表达区块的方式。由于常用的强启动子CMV及SV40均为病毒来源，所以在稳定细胞系的构建过程中经常观察到它们的不稳定性以及被静默的现象。研究人员进一步添加第一内含子（Intron)可改善它们的表达，但仍然不足以提供高效且稳定的平台。而根据研究显示，外源基因的不稳定及静默与基因组CpG岛的甲基化有相关联，因此，筛选并利用低甲基化基因组以应用于表达载体便成为一项途径。如UCOE（Ubiquitous Chromatin-OpeningElements）及S/MAR（Scaffold/Matrix Attachment Region)两个特殊的区间皆为CpG岛的低甲基化区，将其添加于表达载体能有效提升目标基因的表达量及稳定性，进而使利用该元件的稳定细胞系成为提供工业生产用细胞系的重要突破。目前，添加元件以上述这两项技术为主；另外，内含子的挑选及应用也持续出现研究进展。

发明内容

本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种利用RPS基因促进载体稳定表达的方法，该方法能够提高载体转染的稳定细胞株的单位细胞生产效率。同时提供应用于该方法的功能基因及其用途。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种利用RPS基因促进载体稳定表达的方法，其特征是，包括以下步骤：将功能基因序列构建入预定表达载体；将构建所得表达载体转染入目标细胞株，并进行培养表达；所述功能基因序列来自RPS基因，且其序列与SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列的相似度为85%-100%。

发明人在实践研究中发现，上述功能基因序列应具有维持载体启动子活性的特性，能使目标基因持续表达；将该功能基因序列应用于表达载体，能够提高载体转染的稳定细胞株的单位细胞生产效率。

优选地，所述功能基因序列为SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列。

采用以上优选方案，可进一步优化功能基因的具体序列。

优选地，构建所得表达载体中含有启动子及阅读窗，所述功能基因序列置于启动子及阅读窗的上游即5’端。

更优选地，所述预定表达载体为用于在哺乳类细胞中表达重组蛋白或制备病毒载体的表达载体；构建所得表达载体中还含有用于表达目标蛋白的目标基因，以及转录终结信号；所述目标基因位于启动子的下游、并且位于转录终结信号的上游。

更优选地，所述哺乳类细胞包括但不限于CHO，HEK；所述启动子包括但不限于CMV，EF1a，SV40，PGK；所述功能基因序列来源于人类RPS18基因。

采用以上优选方案，可进一步优化表达载体的具体结构，以及功能基因序列的具体位置。

本发明还提供：

一种促进载体稳定表达的功能基因，其特征是，所述功能基因序列来自RPS基因，且其序列与SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列的相似度为85%-100%。

优选地，所述功能基因序列为SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列。

本发明还提供：

一种含有前文所述功能基因的表达载体。

优选地，所述表达载体采用pSP载体；所述表达载体含有用于表达目标蛋白的目标基因，所述目标蛋白为hIGG1抗体蛋白。

本发明还提供：

前文所述功能基因或前文所述表达载体用于制备药物或用于制药生产的用途。

与现有技术相比，本发明通过利用来自RPS基因的特定功能基因，能使目标基因持续表达；将该功能基因序列应用于表达载体，能够提高载体转染的稳定细胞株的单位细胞生产效率。

附图说明

图1为本发明实施例1提到的UCSC资料库中RPS18 (ribosomal protein S18)基因组信息图。

图2为本发明实施例1所构建表达载体的结构。

图3为本发明实施例1的载体图谱，其中A图为控制组载体，B图为实验组载体。

图4为本发明实施例2中载体转染后稳定细胞株筛选过程的活细胞密度（Viablecell density; VCD）结果图。其中，Ctrl-vector指含控制组载体的细胞，RPS18指含实验组载体的细胞。

图5为本发明实施例2中载体转染后稳定细胞株筛选过程的细胞活率（Viability）结果图。其中，Ctrl-vector指含控制组载体的细胞，RPS18指含实验组载体的细胞。

图6为本发明实施例2中稳定细胞株批培养过程的活细胞密度（Viable celldensity; VCD）结果图。其中，Ctrl-vector指含控制组载体的细胞，RPS18指含实验组载体的细胞。

图7为本发明实施例2中稳定细胞株批培养过程活细胞的活率（Viability）结果图。其中，Ctrl-vector指含控制组载体的细胞，RPS18指含实验组载体的细胞。

图8为本发明实施例2中稳定细胞株批培养细胞株生产能力评价（Productivity）结果图。其中，Ctrl-vector指含控制组载体的细胞，RPS18指含实验组载体的细胞。

图9为本发明实施例2中CHO-K1细胞稳定细胞株筛选操作流程图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例1

根据图1所示UCSC资料库中的RPS18 (ribosomal protein S18)基因组信息，获取其表基因调控的表型数据，本实施例着重于其基因的上游中H3K27Ac及CpG岛富集的区域，从NCBI基因库获取基因序列，即序列1。

序列1：SEQ ID NO.1：

aacacatagtgtttacctgcatgccaggtgcaatcttacacatattcatctaatcctaacgacgatgtatacaataggttctatcttcctcaccttaaaggtgtgagaaatgatggcacagagaagctggttaacttgcccaagggcacacagcgtgtaagtggcagagatagaactcaggcagtctggcttcagaggccatgttcttaacctttacactatactacttcgtgactctaccccaaaatgtggagtgaagttgaaattttgtgccccagaacatgagtttcagccactagggtcccgctcagggtcgggtctgatcacagggaagggtacggggagccaaacaggtaatatcacgggtagcagccaagttcccacccttgtgcctaaacccagctcaggtctttctgaagctaggagcaccggaactacggaggagaaacagctccgcgctctcaccagcgggccctcttcctcctccatatctgaggtcccagcccgcaacaccagttcccgggccgcagccgccatggtcgcagcggcggccattccccgcagcctcacttccggcaactgtcagtcccggcgagtccgttccccggagtggagctacaagtcccaaagggtcttcctcagcgcgaaatcgttcccagatatttgagttaagttgtttgactccagctgtcccctttcagctctaaccacttcacccaactgcaaatggaaatatggaagtctgaaacacaaactagccccggaaccttcgctgttctcttacctatgaaccttacgaactgtaaagaaaggcgcaccggaagttgtggtacccaagccatactctcataaatccagccaggtcg

按图2所示结构来构建表达载体。本实施例采用pSP载体构建表达hIGG1抗体蛋白的载体，载体包括控制组载体（不含序列1）和实验组载体（含序列1），其中，控制组载体图谱如图3的A图所示，即pSP-Ctrl-vector，实验组载体图谱如图3的B图所示（其中的“RPS18”即指序列1），即pSP-RPS18-vector。

实施例2

本实施例采用实施例1构建的控制组载体（pSP-Ctrl-vector）和实验组载体（pSP-RPS18-vector）。

本实施例利用CHO-K1细胞进行稳定细胞株筛选，采用实施例1构建的控制组载体和实验组载体，来评价序列1的功能。具体实验过程见本实施例的“CHO-K1细胞稳定细胞株筛选操作流程”。

实验数据如图4、图5所示，结果表明，在稳定细胞株筛选过程中，含实验组载体的细胞与含控制组载体的细胞相比，恢复时间及复苏曲线均未显示显著差异。

待细胞株完全恢复后利用批培养的方式评价细胞生产能力。具体实验过程见本实施例的“CHO-K1稳定细胞株蛋白表达评价操作流程”。

批培养的生长数据如图6、图7所示，结果表明，一方面，批培养过程中含实验组载体的细胞株与含控制组载体的细胞株的生长曲线及活率曲线并未有显著差异；但是，另一方面，在最终评价生产能力的结果中，含实验组载体的细胞株其产量（Titer）及单个细胞的生产能力（Qp）均优于含控制组载体的细胞株。

综合以上结果可知，含序列1基因元件的表达载体可以提高其所转染稳定细胞株的单位细胞生产效率。

本实施例涉及的具体实验过程如下：

（一）CHO-K1细胞稳定细胞株筛选操作流程

CHO-K1细胞株利用CD CHO Medium with 4 mM L-Glutamine培养扩增。将线性化的各表达载体利用PEI转染试剂分别转染到CHO-K1细胞株。于转染后2天将细胞重悬于含筛选药物（如Puromycin及MSX）的筛选培养基培养。于筛选前期显著观察到细胞活率快速下降，但经过约3周的筛选可获得具筛选药物抗性的稳定细胞株。待细胞状态完全恢复（细胞活率高于90%），将该细胞利用批培养的方式验证其生产能力。

将稳定细胞株接种于不含筛选药物的CD CHO Medium with 4 mM L-Glutamine培养基中进行培养。期间观测其细胞生长及代谢状况，根据残余葡萄糖量适当补充培养基的葡萄糖。并于培养结束后检测细胞上清内目标蛋白的产量。

经过完整的培养流程，可获得表达不同载体的稳定细胞株所显示的细胞生长、代谢及生产数据。进而根据该数据评价含序列1基因元件的表达载体对稳定细胞株的贡献。

具体过程如图9所示。

1.培养基及试剂：

(1) CD CHO Medium (ThermoFisher/ Gibco, Cat. 10743029)

(2) 100mM MSX (Merck/Millipore , Cat. GSS-1015-F)

(3) Puromycin (Beyotime, Cat. ST551-50mg)

(4) Dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich, Cat. D2650)

2. 细胞：转染后2天的CHO-K1细胞

3.细胞筛选培养基：

(1) CD CHO Medium with MSX and Puromycin

4.细胞筛选：

(1)将转染后的细胞进行细胞计数确定活细胞密度及细胞活率。

(2)将所需的活细胞转移至15 mL离心管。

● 起始筛选的活细胞密度为5×10^5 cells/mL，15 mL/ 75T

(3)利用离心的方式去除培养基，200g(or 1000 rpm)，5 min。

(4)将细胞重悬于含细胞筛选培养基的75T培养瓶。

(5)将细胞置于37摄氏度，5% CO

(6)于筛选第5/6天进行细胞计数确定活细胞密度及细胞活率。

(7)利用离心的方式去除细胞筛选培养基，200g(or 1000 rpm)，5 min。

(8)将细胞重悬于含4 mL细胞筛选培养基的25T培养瓶。

(9)将细胞置于37摄氏度，5% CO

(10)于筛选第9/10天进行细胞计数确定活细胞密度及细胞活率。

(11)补充1 mL筛选细胞培养基的25T培养瓶。

(12)将细胞置于37摄氏度，5% CO

(13)于筛选第12/13天后的一周内进行2次细胞处理。

● 如活细胞密度及细胞活率较前一次处理提高。

■ 细胞活率低于25%：利用离心的方式去除细胞筛选培养基，200g(or 1000rpm)，5 min。利用细胞筛选培养基将活细胞密度调整为3×10^5 cells/mL于培养瓶。如活细胞数量不足，将全部细胞重悬于含4 mL细胞筛选培养基的25T培养瓶。将培养瓶置于37摄氏度，5% CO

■ 细胞活率高于25%：利用细胞筛选培养基将活细胞密度调整为3×10^5 cells/mL于摇管或摇瓶中培养。将摇管置于36.5~37摄氏度，5~8% CO

● 如活细胞密度及细胞活率较前一次处理降低。

■ 利用离心的方式去除细胞筛选培养基，200g(or 1000 rpm)，5 min。将细胞重悬于含4 mL细胞筛选培养基的25T培养瓶。将培养瓶置于37摄氏度，5% CO

(14)待细胞活率维持大于90%则进行细胞冻存。

（二）CHO-K1稳定细胞株蛋白表达评价操作流程

1.培养基及试剂：

(1) CD CHO Medium (ThermoFisher/ Gibco, Cat. 10743029)

(2) L-Glutamine

(3) Glucose solution

2. 细胞：细胞活率>90%的稳定细胞株

3.细胞生产培养基：

(1) CD CHO Medium with 4 mM L-Glutamine

4.细胞批培养（Batch culture)：

(1)将稳定细胞株进行细胞计数确定活细胞密度及细胞活率。

(2)将所需的活细胞转移至含细胞生产培养基的摇管或摇瓶。

● 接种的活细胞密度为2~3×10^5 cells/mL：N-1

(3)将摇管置于36.5~37摄氏度，5~8% CO

(4)于培养第2~3天后进行细胞计数确定活细胞密度及细胞活率。

(5)将所需的活细胞转移至含细胞生产培养基的摇管或摇瓶。

● 接种的活细胞密度为5×10^5 cells/mL：N/ Day 0

(6)将摇管置于36.5~37摄氏度，5~8% CO

(7)于培养第2或3天进行细胞计数确定活细胞密度及细胞活率，并补糖1.5 g/L。

(8)于培养第5，7，9，及11天进行细胞计数确定活细胞密度及细胞活率及检测代谢数据（糖及乳酸），并补糖至6 g/L。

(9)细胞活率低于60%或培养第11天检测目标蛋白产量。

注：检测蛋白产量的上清需利用离心12000 g, 5 min的方式去除细胞及杂质。收获的细胞上清（Harvest cell culture fluid/ HCCF)可保存于4摄氏度3天，如需长时间保存需存放于-10~-20摄氏度。

综合以上各实施例，根据NCBI及UCSC基因体资料库比对，人类RPS18 (ribosomalprotein S18)基因属于持家基因、且其上游调控区为CpG岛富集区，发明人据此推测该元件功能近似UCOE，在此基础上，发明人根据其H3K27Ac标记，挑选基因组片段，获取脱氧核糖核酸序列，应用于表达载体，并通过实验测试其功效，结果表明该序列能使外源基因持续表达，推测其原理是因其具备维持载体启动子活性的特性。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。