一种L-薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株

技术领域

本发明涉及一种L-薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株，属于代谢工程技术领域。

背景技术

L-薄荷醇(L-Menthol)是一种环状单萜烯醇，无色或白色针状结晶，分子式为C

申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌WMT4，首次实现了发酵法生产L-薄荷醇，利用廉价的发酵培养基培养4d左右，L-薄荷醇的发酵产量达到5.03mg/L。随后利用诱导型启动子表达法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过在tLimS和IDI、tLimS和L3H的C端添加RIDD-RIAD短肽进行酶组装，拉近两个酶之间的距离，提高薄荷醇的产量。

本发明的第一个目的是提供一种L-薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株，所述的酿酒酵母菌株是在柠檬烯合成酶tLimS和异戊二烯二磷酸异构酶IDI的C端分别添加RIDD和RIAD短肽，或在柠檬烯合成酶tLimS和柠檬烯羟基化酶L3H的C端分别添加RIDD和RIAD短肽。

进一步地，所述的柠檬烯合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中的柠檬烯合成酶tLimS为柠檬烯合成酶LimS去除前56个氨基酸序列形成。

SEQ ID NO.1所示的序列：

MERRSGNYNPSRWDVNFIQSLLSDYKEDKHVIRASELVTLVKMELEKETDQIRQLELIDDLQRMGLSDHFQNEFKEILSSIYLDHHYYKNPFPKEERDLYSTSLAFRLLREHGFQVAQEVFDSFKNEEGEFKESLSDDTRGLLQLYEASFLLTEGETTLESAREFATKFLEEKVNEGGVDGDLLTRIAYSLDIPLHWRIKRPNAPVWIEWYRKRPDMNPVVLELAILDLNIVQAQFQEELKESFRWWRNTGFVEKLPFARDRLVECYFWNTGIIEPRQHASARIMMGKVNALITVIDDIYDVYGTLEELEQFTDLIRRWDINSIDQLPDYMQLCFLALNNFVDDTSYDVMKEKGVNVIPYLRQSWVDLADKYMVEARWFYGGHKPSLEEYLENSWQSISGPCMLTHIFFRVTDSFTKETVDSLYKYHDLVRWSSFVLRLADDLGTSVEEVSRGDVPKSLQCYMSDYNASEAEARKHVKWLIAEVWKKMNAERVSKDSPFGKDFIGCAVDLGRMAQLMYHNGDGHGTQHPIIHQQMTRTLFEPFA。

进一步地，所述的异戊二烯二磷酸异构酶IDI的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2所示的序列：

MTADNNSMPHGAVSSYAKLVQNQTPEDILEEFPEIIPLQQRPNTRSSETSNDESGETCFSGHDEEQIKLMNENCIVLDWDDNAIGAGTKKVCHLMENIEKGLLHRAFSVFIFNEQGELLLQQRATEKITFPDLWTNTCCSHPLCIDDELGLKGKLDDKIKGAITAAVRKLDHELGIPEDETKTRGKFHFLNRIHYMAPSNEPWGEHEIDYILFYKINAKENLTVNPNVNEVRDFKWVSPNDLKTMFADPSYKFTPWFKIICENYLFNWWEQLDDLSEVENDRQIHRML。

进一步地，所述的柠檬烯羟基化酶L3H的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3所示的序列：

MELQISSAIIILVVTYTISLLIIKQWRKPKPQENLPPGPPKLPLIGHLHLLWGKLPQHALASVAKQYGPVAHVQLGEVFSVVLSSREATKEAMKLVDPACADRFESIGTKIMWYDNDDIIFSPYSVHWRQMRKICVSELLSARNVRSFGFIRQDEVSRLLGHLRSSAAAGEAVDLTERIATLTCSIICRAAFGSVIRDHEELVELVKDALSMASGFELADMFPSSKLLNLLCWNKSKLWRMRRRVDAILEAIVEEHKLKKSGEFGGEDIIDVLFRMQKDSQIKVPITTNAIKAFIFDTFSAGTETSSTTTLWVMAELMRNPEVMAKAQAEVRAALKGKTDWDVDDVQELKYMKSVVKETMRMHPPIPLIPRSCREECEVNGYTIPNKARIMINVWSMGRNPLYWEKPETFWPERFDQVSRDFMGNDFEFIPFGAGRRICPGLNFGLANVEVPLAQLLYHFDWKLAEGMNPSDMDMSEAEGLTGIRKNNLLLVPTPYDPSS。

进一步地，所述的RIDD的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4所示的序列：

LRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK。

进一步地，所述的RIAD的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5所示的序列：

LEQYANQLADQIIKEATEGC。

进一步地，所述的酿酒酵母菌株在柠檬烯合成酶tLimS的C端添加RIDD，在异戊二烯二磷酸异构酶IDI的C端添加RIAD，或在柠檬烯合成酶tLimS的C端添加RIAD，在异戊二烯二磷酸异构酶IDI的C端添加RIDD。

进一步地，所述的酿酒酵母菌株在柠檬烯合成酶tLimS的C端添加RIDD，在柠檬烯羟基化酶L3H的C端添加RIAD，或在柠檬烯合成酶tLimS的C端添加RIAD，在柠檬烯羟基化酶L3H的C端添加RIDD。

进一步地，所述的酿酒酵母的宿主为酿酒酵母工程菌WMT9。宿主的构建方法参见中国专利CN202011060996.7，一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌。具体是以酵母菌为宿主，过表达内源MVA合成途径中的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1，并异源表达截短的柠檬烯合成酶基因LIS、柠檬烯羟基化酶基因L3H、细胞色素P450还原酶基因CPR、反式异胡椒醇脱氢酶基因IPDH、异薄荷二烯酮还原酶基因IPR、类固醇异构酶基因KSI、长叶薄荷酮还原酶基因PGR和薄荷醇还原酶基因MMR，并表达了法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20WW和橙花二磷酸合酶基因NPPS，并利用诱导启动子过表达融合蛋白tLIS-L3H基因。

RIDD是cAMP依赖性蛋白激酶(PKAs)调节(R)亚基的对接和二聚(D/D)结构域的前44个N-末端残基，RIAD是起源于A激酶锚定蛋白(AKAPs)结构域的两亲螺旋，该结构域特异性结合RIDD二聚体。

本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母菌株在发酵生产L-薄荷醇中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明tLimS-IDI系列菌株中，单独添加RIDD短肽至酶C端的实验组相比于不添加短肽的对照组，薄荷醇产量变化不明显。在添加RIAD短肽后，菌株薄荷醇产量提高了11.62％，添加完整RIDD-RIAD互作短肽后，菌株yLDIA产量相比菌株yLI提高了32.73％，达40.01mg/L；tLimS-L3H系列菌株中，添加RIDD短肽后薄荷醇产量无明显变化，在添加RIAD短肽后，菌株薄荷醇产量提高了8.21％，同时添加RIDD-RIAD互作短肽后，菌株薄荷醇产量提高了46.84％，达到44.26mg/L。

附图说明

图1为酿酒酵母工程菌发酵结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

酿酒酵母工程菌WMT9：构建方法参见中国专利CN202011060996.7，一种L-薄荷醇产量提高的重组酵母菌。具体是以酵母菌为宿主，过表达内源MVA合成途径中的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1，并异源表达截短的柠檬烯合成酶基因LIS、柠檬烯羟基化酶基因L3H、细胞色素P450还原酶基因CPR、反式异胡椒醇脱氢酶基因IPDH、异薄荷二烯酮还原酶基因IPR、类固醇异构酶基因KSI、长叶薄荷酮还原酶基因PGR和薄荷醇还原酶基因MMR，并表达了法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20WW和橙花二磷酸合酶基因NPPS，并利用诱导启动子过表达融合蛋白tLIS-L3H基因。

涉及的检测方法：

L-薄荷醇GC-MS检测：

使用带有FID检测器和色谱柱(Thermo；25m，0.32mm，0.25μm)的ThermofisherScientific TSQ8000仪器进行检测。进样器温度为180℃，载气为氦气，流速为1mL/min，压力为5.8psi。程序从70℃开始，以20℃/min的速率将温度升至150℃，保持3分钟，然后以2℃/min的速度将温度升至190℃，保持3分钟。

实施例1：RIDD-RIAD系列菌株的构建

(1)tLimS-IDI系列质粒构建：采用引物ADH1-tLimS-F和tLimS-TEF1-R以pESC质粒为模板，扩增双启动子PTEF1-PGPD表达框，采用引物tLimS-LK-F和ADH1-RIDD-LK-R以基因片段PGAL1-tLimS-TADH1为模板扩增PTEF1-tLimS-RIDD-TADH1片段，采用引物LK-RIAD-CYC1-F和IDI-LK-R以质粒pY13-TADH1-tHMG1-PGAL1-10-IDI-TCYC1为模板扩增PGPD-IDI-RIAD-TCYC1片段，采用碧云天无缝克隆得到重组质粒pLDIA；以质粒pLDIA为模板，分别采用引物TEF1-tLimS-F/ADH1-tLimS-R和ADH1-tLimS-F/tLimS-TEF1-R扩增获得线性化片段和PTEF1-tLimS-TADH1片段，再按照碧云天无缝克隆完成小片段的替换，获得重组质粒pLIA；以质粒pLDIA为模板，分别采用引物GPD-IDI-F/IDI-CYC1-R和IDI-CYC1-F/GPD-IDI-R扩增获得线性化片段和PGPD-IDI-TCYC1片段，再按照碧云天无缝克隆完成小片段的替换，获得重组质粒pLDI；以质粒pLIA为模板，分别采用引物GPD-IDI-F/IDI-CYC1-R和IDI-CYC1-F/GPD-IDI-R扩增获得线性化片段和PGPD-IDI-TCYC1片段，再碧云天无缝克隆完成小片段的替换，获得重组质粒pLI。

(2)tLimS-L3H系列质粒构建：采用引物ADH1-tLimS-F和tLimS-TEF1-R以pESC质粒为模板，扩增双启动子PTEF1-PGPD表达框，采用引物tLimS-LK-F和ADH1-RIDD-LK-R以基因片段PGAL1-tLimS-TADH1为模板扩增PTEF1-tLimS-RIDD-TADH1片段，采用引物LK-RIAD-CYC1-F和L3H-LK-R以质粒pY13-TADH1-L3H-PGAL1-10-CPR-TCYC1为模板扩增PGPD-IDI-RIAD-TCYC1片段，采用碧云天无缝克隆得到重组质粒pLDLA；以质粒pLDLA为模板，分别采用引物TEF1-tLimS-F/ADH1-tLimS-R和ADH1-tLimS-F/tLimS-TEF1-R扩增获得线性化片段和PTEF1-tLimS-TADH1片段，再按照碧云天无缝克隆完成小片段的替换，获得重组质粒pLLA；以质粒pLDLA为模板，分别采用引物GPD-L3H-F/L3H-CYC1-R和L3H-CYC1-F/GPD-L3H-R扩增获得线性化片段和PGPD-L3H-TCYC1片段，再按照碧云天无缝克隆完成小片段的替换，获得重组质粒pLDL；以质粒pLLA为模板，分别采用引物GPD-L3H-F/L3H-CYC1-R和L3H-CYC1-F/GPD-L3H-R扩增获得线性化片段和PGPD-L3H-TCYC1片段，再碧云天无缝克隆完成小片段的替换，获得重组质粒pLL。

(3)制备酿酒酵母yMJ05(WMT9)感受态，将tLimS-IDI系列质粒pLDIA、pLIA、pLDI和pLI以及tLimS-L3H系列质粒分别转入酿酒酵母yMJ05感受态中，待YPD固体平板(200ng/LG418抗性)上长出单菌落后采用两对引物分别是YZ-tLimS-TEF1-GPD-IDI-F、YZ-tLimS-TEF1-GPD-IDI-R与YZ-CPR-TEF1-GPD-L3H-F、YZ-tLimS-TEF1-GPD-L3H-R进行菌落PCR验证。验证条带大小正确的菌送测序，测序无误的单菌落即为正确的基因工程菌，得到tLimS-IDI系列菌株：yLDIA(转入了pLDIA质粒)、yLIA(转入了pLIA质粒)、yLDI(转入了pLDI质粒)和yLI(转入了pLI质粒)以及tLimS-L3H系列菌株：yLDLA(转入了pLDLA质粒)、yLLA(转入了pLLA质粒)、yLDL(转入了pLDL质粒)和yLL(转入了pLL质粒)；

引物序列：

TEF1-tLimS-F：CTTTCCATTAGTTCTAGAAAACTTAGATTAGATTGCTATGCT

tLimS-TEF1-R：TTTTCTAGAACTAATGGAAAGAAGATCTGGTAACTACAACC

GPD-L3H-F：TAGTTTCGAATGGAATTACAAATTTCTTCAGCTATTATTATTTTGG

GPD-L3H-R：TGTAATTCCATTCGAAACTAAGTTCTGGTGTTTTAAAACT

ADH1-tLimS-F：GGCGAAGAATTGTTAAGCAAATGGTTCGAACAATGTTC

ADH1-tLimS-R：ATTTGCTTAACAATTCTTCGCCAGAGGTTTG

L3H-CYC1-F：ATCTTCATAATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTC

L3H-CYC1-R：AATTACATGATTATGAAGATGGATCGTATGGAGTTGG

GPD-IDI-F：AGAACTTAGTTTCGAATGACTGCCGACAACAATAGTATG

GPD-IDI-R：TCGGCAGTCATTCGAAACTAAGTTCTGGTGTTTTAAAACT

IDI-CYC1-F：ATAGAATGCTATAATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTC

IDI-CYC1-R：TAATTACATGATTATAGCATTCTATGAATTTGCCTGTCATTTT

YZ-tLimS-TEF1-GPD-IDI-F：TCCAGAAGTAACATTCAACCAATCTATCT

YZ-tLimS-TEF1-GPD-IDI-R：TTTCAGTGGCTCTTTGTTGTAAAAGT

YZ-tLimS-TEF1-GPD-L3H-R：CACAACTTAGACTTATTCCAACACAACAAA

YZ-CPR-TEF1-GPD-L3H-F：GTAACAGATGTATCATCTTCATCTCTCAAC。

实施例2：酿酒酵母工程菌的双相发酵

将实施例1中的酿酒酵母工程菌分别进行发酵：挑取固体YPD平板上的酿酒酵母工程菌单菌落，接种到在2ml YPD液体培养基中，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量2％接入含有25mL发酵培养基的250mL平底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵结束后，取600μL菌液加入0.5mm玻璃珠与等体积乙酸乙酯破碎，高速离心后取上层有机相进行气相质谱联用检测。发酵结束后离心取有机相用于气相质谱联用检测。

结果如图1所示，tLimS-IDI系列菌株中，单独添加RIDD短肽至酶C端的实验组相比于不添加短肽的对照组，薄荷醇产量变化不明显。在添加RIAD短肽后，菌株薄荷醇产量提高了11.62％，添加完整RIDD-RIAD互作短肽后，菌株yLDIA产量相比菌株yLI提高了32.73％，达40.01mg/L；

tLimS-L3H系列菌株中，添加RIDD短肽后薄荷醇产量无明显变化，在添加RIAD短肽后，菌株薄荷醇产量提高了8.21％，同时添加RIDD-RIAD互作短肽后，菌株薄荷醇产量提高了46.84％，达到44.26mg/L。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。