一种血浆检测前处理方法

技术领域

本发明血液检测技术，具体涉及一种高表达CD47抗原的吸附细胞在血液检测中的应用。

背景技术

CD47靶向治疗是近年来肿瘤免疫疗法的一大热点。研究发现无论在血液系统肿瘤还是实体瘤中，肿瘤细胞上CD47都呈现过表达状态，肿瘤细胞通过CD47这个“自我”信号抑制巨噬细胞的吞噬作用，产生免疫逃逸。抗-CD47单抗药物可以阻断这个信号，促使巨噬细胞发挥吞噬作用，诱导肿瘤细胞的清除。因CD47在红细胞膜上也有大量表达，抗-CD47单抗会结合红细胞(Red blood cells，RBCs)上的CD47分子，严重干扰血浆检测，如输血前次侧配血等检测(Coomb’s试验)，给临床输血安全带来重大隐患。

现有排除单抗药物干扰的方法有：

(1)红细胞、血小板吸收法，但需要多次吸附，费时费力还会造成血液资源的浪费；

(2)缺乏IgG4的抗球蛋白试剂Gamma-clone和Immucor Capture-R固相凝集法，只适用于IgG4型的单抗药物，如患者使用的不是IgG4型的单抗药物则难以排除；

(3)用药前检测方法，但需要患者在用药前留取血液样本，而血液样本保存有效期只有3天，因此该方法并不适合多次用药的患者；

(4)基因配血方法，该方法花费较高，而且耗时较长，耽误血液的及时发放。

因此，需要提供一种操作简单、可广泛普及的方法，来排除药物抗体的干扰，以保证临床输血安全。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一种血浆检测前处理方法。

为此，本发明所提供的处理方法包括在待检测血浆中加入细胞对血浆中的抗-CD47单抗(本文也称抗体)进行吸附之后分离去除吸附抗体的细胞；所述细胞为表面高表达CD47抗原的细胞。

有些方案中，所述表面高表达CD47抗原的细胞经甲醛固定。

可选的方案是，通过离心分离去除吸附抗体的细胞。

本发明还提供了一种血浆检测方法。所提供的血浆检测方法包括，采用上述方法对含抗-CD47单抗的血浆进行前处理；之后对血浆进行检测。具体的，所述血浆检测为输血前的次侧配血检测。

本发明同时提供了上述处理方法用吸附细胞，所述细胞为表面高表达CD47抗原的细胞，且表面高表达CD47抗原的细胞经甲醛固定。进一步方案中，所述细胞经在4℃条件下保存。

与现有的方法相比，本发明通过在吸附细胞表面特异性高度表达CD47，有效吸附待检血浆中相应抗体，所得血浆用于后续检测，从而避免对血浆检测的影响。并且用甲醛固定吸附细胞，保存方便。

附图说明

图1为本发明实施例中慢病毒转染293T细胞的效果分析；A为绿色荧光细胞代表成功转染细胞(也称吸附细胞)，B为流式分析结果，表明慢病毒转染293T细胞高CD47表达占98％以上。

图2为本发明实施例构建抗-CD47单抗对输血前检测存在严重干扰模型；将抗-CD47单抗经过不同的稀释倍数达到血浆中不同药物浓度(2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、200ng/ml)，ctrl为志愿者的洗涤红细胞，Coomb’s试验检测凝集，其中，2+、3+、4+分别表示凝集等级，数值越高凝集强度越大；0表示无凝集。

图3为本发明实施例中293T细胞高表达CD47前后吸附效果对比；从左至右依次为46ng/ml的CD47抗体模拟患者血浆、293T细胞+46ng/ml的CD47抗体模拟患者血浆处理后、实施例1制备的细胞+46ng/ml的CD47抗体模拟患者血浆处理后的Coomb’s试验检测凝集结果，其中，4+、3+、+分别表示凝集等级，数值越高凝集强度越大；0表示无凝集。

图4为本发明实施例中吸附细胞固定后对受试者血浆中抗CD47单抗药的吸附效果图；从左至右依次为实施例1制备的细胞+2ng/ml的CD47抗体模拟患者血浆处理后、实施例2制备细胞+4ng/ml的CD47抗体模拟患者血浆处理后、2ng/ml的CD47抗体模拟患者血浆、4ng/ml的CD47抗体模拟患者血浆的Coomb’s试验检测凝集结果；其中，2+、3+、4+、0分别表示凝集等级，数值越高凝集强度越大，0表示无凝集。

图5为本发明实施例中吸附细胞对不同抗体的吸附效果图；从左至右依次为抗A抗体阳性的血浆anti-A抗A抗体阳性的血浆+实施例1制备的细胞处理后、抗D抗体阳性的血浆、抗D抗体阳性的血浆+实施例1制备的细胞处理后、抗E抗体阳性的血浆和抗E抗体阳性的血浆+实施例1制备的细胞处理后的Coomb’s试验检测凝集结果。

图6为本法实施例中吸附细胞对Duffy血型系统、JK血型系统和K血型系统的吸附效果图；从左至右依次为抗-Fyb抗体阳性血浆、抗-Fyb抗体阳性血浆+实施例1制备的细胞处理后、抗JKa抗体阳性血浆、抗JKa抗体阳性血浆+实施例1制备的细胞处理后、抗K抗体阳性血浆、抗K抗体阳性血浆+实施例1制备的细胞处理后的Coomb’s试验检测凝集结果。

具体的实施方式

除非有特殊说明，本文中的科学与技术术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。

需要说明的是，适用于本发明的细胞不限来源，天然或基因修饰的细胞表面高表达CD47的细胞；例如适合于基因修饰、易得、且成本低的细胞。所述基因修饰指的是通过基因工程手段在细胞表面过表达CD47，例如但不限于慢病毒转染法。以下实施例以293T细胞为例对本发明进行解释说明。以下实施例的受试血浆来自志愿者。

实施例1：

该实施例为用慢病毒法在细胞表面高表达CD47

(1)CD47过表达慢病毒(购自海星生物，产品号221021LVG23)的设计与包装：构建含有CD47基因(基因序列为：NM_001777.4)的慢病毒载体，商品化293T细胞内进行慢病毒载体的大量包装，浓缩和纯化慢病毒，使用Q-PCR进行慢病毒滴度测定,得到滴度为1.33×10

(2)慢病毒感染细胞：293T细胞复苏后培养至对数期，根据实验所需细胞数量进行细胞铺板；采用步骤(1)构建的CD47过表达慢病毒感染细胞，使293T细胞表面高表达CD47，得到该实施例制备的细胞；

(3)结果鉴定：由于CD47过表达慢病毒带有绿色标签，使用荧光显微镜拍摄显示293T细胞绿色荧光较强(图1A)，说明慢病毒已成功导入293T细胞；进一步通过流式细胞仪检测293T细胞表面是否过表达CD47抗原，图1B结果显示证实转染后细胞表面高表达CD47抗原。

实施例2：

该实施例为对实施例1制备的CD47过表的293T细胞进行固定：

(1)实施例1制备的表面高表达CD47的293T细胞用4％多聚甲醛溶液在4℃条件下固定，固定20min后，1000g离心5min收集细胞，PBS重复洗涤细胞2次去除4％多聚甲醛溶液；

(2)得到的细胞PBS重悬后在4℃条件下保存，细胞浓度为10

实施例3：

该实施例利用实施例1和2制备的细胞吸附血浆中的CD47抗体：

(1)将抗-CD47单抗(Biolegend，323106#)经过不同的稀释倍数(×1000，×10000，×20000，×50000，×100000)达到血浆中不同药物浓度，制备成模拟CD47抗体使用者血浆；

(2)Coomb’s试验：将该实施例步骤(1)制备的40uL模拟CD47抗体使用者血浆与10ul志愿者的洗涤红细胞加入微柱凝胶卡(购自奥森多公司)中，37℃孵育30min后，800rpm离心2min，200rpm离心3min后观察，显示凝集明显(图2所示)，表明成功构建抗-CD47单抗对输血前检测存在严重干扰的模型；

(3)将实施例1制备的细胞、实施例2保存一周后的细胞及原293T细胞(均为10

实施例4：

该实施例检测实施例1制备的细胞(也称吸附细胞)对其他抗体的干扰：

(1)采用B型血浆，在经过吸附细胞吸附后，血浆中抗-A抗体的强度没有改变(图5)，说明吸附细胞并不吸附抗-A抗体。

(2)采用含有IgG型抗D的血浆，在经过吸附细胞吸收后，抗-D抗体强度没有改变(图5)，说明吸附细胞不吸附抗-D抗体。

(3)采用含有IgG型抗E的血浆，在经过吸附细胞吸收后，抗-E抗体强度没有改变(图5所示)，说明吸附细胞不吸附抗-E抗体。

(4)模拟抗-Fyb,-JKa,-K三个的抗体的血浆，均出现凝集，分别使用吸附细胞吸收抗-Fyb,抗-JKa和抗-K抗体(图6所示)，结果显示抗-Fyb,抗-JKa和抗-K抗体均未受到影响。