一种铜半胱胺纳米复合材料的制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铜半胱胺纳米复合材料(Cu-Cy@Au)的制备方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)，作为一种不可治愈的慢性神经退行性疾病，并以大脑中出现纤维状淀粉样蛋白(一般由40-42个氨基酸组成的蛋白)的斑块沉积作为该疾病的临床病理标志。针对AD治疗已批准的方法主要包括胆碱酯酶抑制剂

Cu-Cy@Au是一种具有良好的物理稳定性和生物安全性的多功能金属螯合物，该材料可以水解出低剂量的铜离子Cu(Ⅱ)，而Cu(Ⅱ)的存在会抑制淀粉样多肽(Aβ)错误折叠成β-sheet结构并调控淀粉样多肽聚集体，同时Cu-Cy@Au作为一种新型的光敏剂可以在紫外光(UV)、X射线、微波(MV)激发下产生活性氧自由基(ROS)，并且Cu-Cy@Au中含有大量的Cu(Ⅰ)，而Cu(Ⅰ)的水解过程也会产生ROS，这在破坏淀粉样多肽二级结构和降解Aβ聚集体方面起到关键性作用。所以从理论上讲，Cu-Cy@Au可以有效地预防淀粉样蛋白变性，并减少脑内现有的淀粉样多肽纤维状沉积，并且该治疗策略具有成本低、创伤小、毒性小、选择性好、可重复治疗等优点，可作为AD治疗的一个重要方法和策略。

光动力治疗(Photodynamic therapy，简称PDT)是一种利用光照治疗疾病的方法，其原理是利用无毒性的光敏物质暴露在特定波长的光下，让该物质对特定的癌细胞或其他疾病细胞产生光毒性从而达到治疗效果。在光动力治疗过程中，光敏剂Cu-Cy@Au因其良好的生物安全性和高ROS产能在生物医学方面得到了广泛的应用。MV的高频电磁波特性可以轻易穿透人体组织，可用于治疗消化道疾病、泌尿道疾病、妇科腔内疾病、皮肤病、肿瘤、组织修复等。在本研究当中，以MV作为激发Cu-Cy@Au产生ROS的光源，可实现对淀粉样多肽纤维状聚集体的高效降解从而实现对AD治疗的作用。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种铜半胱胺纳米复合材料(Cu-Cy@Au)的制备方法，和微波(MV)下降解淀粉样多肽Aβ(1-40)聚集体的应用。本发明通过热溶剂法合成了光敏剂Cu-Cy@Au纳米复合材料并利用其在MV活化下产生的ROS实现了对淀粉样多肽Aβ(1-40)聚集体的高效降解，进而用于治疗AD。所述治疗策略具有成本低、创伤小、毒性小、选择性好、可重复治疗等优点。

本发明中提供了铜半胱胺纳米复合材料Cu-Cy@Au的制备方法，包括如下步骤：

将二水氯化铜溶于去离子水中，充分搅拌溶解后，加入半胱胺盐酸盐、柠檬酸钠、四水合氯金酸溶液、随后加入的聚乙二醇-4000，此时溶液的颜色由淡蓝变浅黄色，并通入氮气继续搅拌，充分搅拌溶解后滴加氢氧化钠水溶液调节pH到8～9，停止通氮气，常温下进行聚合反应1h，溶液由浅黄色逐渐加深最终为蓝黑色，反应结束后再将溶液温度加热到85～100℃，并保温15min后，使其自然冷却至室温，然后将混合液离心，并将所得的产物用水和乙醇的混合液重复洗涤以去样品中的除杂质，真空干燥后，得到Cu-Cy@Au纳米复合材料。

进一步的，所述二水氯化铜、半胱胺盐酸盐、柠檬酸钠、四水合氯金酸溶液、聚乙二醇-4000和的用量比为277mg：522mg：72.3mg：272μL：50mg，其中，四水合氯金酸溶液的浓度为0.1g/mL。

进一步的，所述氢氧化钠水溶液的浓度为1M。

进一步的，离心的速度为12000rpm/min，离心时间为10min。

进一步的，所述水和乙醇的混合液中，水和乙醇的体积比为5:4。

进一步的，所述真空干燥的温度为40℃，时间为12h。

本发明中还提供了上述Cu-Cy@Au纳米复合材料微波下降解淀粉样多肽纤维状聚集体的应用，步骤为：

(1)将淀粉样多肽孵育培养成淀粉样多肽纤维状聚集体；

(2)将Cu-Cy@Au纳米复合材料与淀粉样多肽纤维状聚集体溶液混合得混合液体系，随后混合液体系在微波MV活化一段时间后，吸取一定混合液进行相应的淀粉样多肽二级结构及聚集状态分析。

步骤(1)中，所述淀粉样多肽为Aβ(1-40)、Aβ(1-42)、Aβ(33-42)、或HIAPP中的一种。

步骤(2)中，所述混合液体系中，Cu-Cy@Au纳米复合材料的浓度为25μg/ml，淀粉样多肽纤维状聚集体溶液的浓度为50μM。

步骤(2)中，所述微波MV活化的功率为25～60W，时间为15～30min。

将本发明制备的Cu-Cy@Au纳米复合材料用于制备治疗阿尔兹海默症的制剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

Cu-Cy@Au纳米复合材料与原始的Cu-Cy纳米材料相比表现出较高的生物相容性和亲水性。并且在低功率的MV照射下仍具有较高的ROS产率，可实现对AD中典型的淀粉样多肽聚集体的高效降解。在该降解过程当中，成功制备了一种可被MV激活作用的铜半胱胺纳米复合材料，该纳米材料与传统淀粉样多肽抑制剂相比，具有较高的生物安全性和生物可降解性，并且通过MV激活Cu-Cy@Au进行AD治疗的手段具有成本低、创伤小、选择性高、可重复治疗等优点。

附图说明

图1为Cu-Cy@Au纳米复合材料的表面形貌TEM图。

图2为Cu-Cy@Au纳米复合材料的XRD图。

图3为不同浓度的Cu-Cy@Au纳米复合材料在MV活化下产生ROS的光谱图。

图4为Cu-Cy@Au纳米复合材料经聚乙二醇-4000修饰前后对PC12细胞的细胞毒性

图5为Cu-Cy@Au(25μg/ml)在MV(25W、15min)条件下降解淀粉样多肽Aβ1-40(50μM)纤维状聚集体的圆二色谱图。

图6为Cu-Cy@Au(25μg/ml)在MV(25W、15min)条件下降解淀粉样多肽Aβ1-40(50μM)纤维状聚集体的AFM/TEM图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

(1)Cu-Cy@Au纳米复合材料的制备：

称量277mg二水氯化铜(CuCl

图1为Cu-Cy@Au纳米复合材料的表面形貌SEM图。从图中可以看出合成的Cu-Cy@Au具有规则的层片状二维纳米结构。

图2为Cu-Cy@Au纳米复合材料的XRD图。从图中可以看出光敏剂Cu-Cy@Au纳米复合材料是单一、纯净的。

图3为不同浓度的Cu-Cy@Au纳米复合材料在MV活化下产生ROS的光谱图。从图中可以看出不同浓度的Cu-Cy@Au纳米复合材料在MV条件激活下的ROS产率。

图4为本发明Cu-Cy@Au纳米复合材料与已经报道过的未经PEG-4000和Au纳米材料复合修饰的Cu-Cy材料分别对PC12细胞的细胞毒性。从图中可以看出Cu-Cy@Au纳米复合材料与已经报道过的未经PEG-4000和Au纳米材料复合修饰的Cu-Cy相比即使在高浓度也表现出较高的生物活性。

(2)淀粉样多肽Aβ(1-40)纤维状聚集体的制备：

取1mg人工合成淀粉样蛋白Aβ(1-40)多肽干粉，经过离心后，加入1ml六氟异丙醇(HFIP)，封口膜封紧，超声5s，振荡5s，重复3次；然后将其放在恒温振荡器上25℃下孵育12h，直至溶液澄清，多肽浓度最终是1mg/ml(234.2μM)用作储存液，并进行分装。随后吸取85.3μL上述溶解好的多肽溶液于四管1.5mL离心管中，用封口膜密封，用针管扎5个小孔(每次对照实验保证小孔个数一样)，将离心管放入真空干燥箱中在25℃下干燥1-2h，直至HFIP完全挥发，管壁上形成了一层薄薄的多肽。接下来向管内加入400μL的Milli-Q水，并以350rpm/min的速度在恒温摇床中孵育10h以上，便可以得到淀粉样多肽Aβ(1-40)纤维状聚集体溶液。

(3)Cu-Cy@Au纳米复合材料在MV条件下降解淀粉样多肽Aβ(1-40)纤维状聚集体

将25μg/ml Cu-Cy@Au纳米复合材料与上述淀粉样多肽Aβ(1-40)纤维状聚集体溶液混合在1.5mL离心管中，随后在MV条件下(25W)照射15min后，吸取一定混合液进行相应的淀粉样多肽二级结构及聚集状态分析。

图5为Cu-Cy@Au(25μg/ml)在MV(25W、15min)条件下对淀粉样多肽Aβ1-40(50μM)纤维状聚集体降解的圆二色谱图。从图中可以看出随着MV活化后时间的延长，混合液中淀粉样多肽聚集体的二级结构含量明显降低。

图6为Cu-Cy@Au(25μg/ml)在MV(25W、15min)条件下对淀粉样多肽Aβ1-40(50μM)纤维状聚集体降解的AFM/TEM图。从图中可以看出淀粉样多肽Aβ(1-40)纤维状聚集体会随着降解时间的延长而逐渐减少并且其纤维覆盖率也明显降低。

综上所述，将低浓度的Cu-Cy@Au(25μg/ml)与淀粉样多肽Aβ(1-40)(50μM)纤维状聚集体混合后，即使在低功率、短时间的MV活化下(其照射功率为25w，照射时间为15min，)也表现出对淀粉样多肽纤维状聚集体明显的降解效果。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。