一种血浆外泌体生物标志物在乳腺癌诊断中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要是涉及一种血浆外泌体生物标志物在乳腺癌诊断中的应用。

背景技术

乳腺癌是在乳房细胞中形成的癌症，男性和女性均可发生，但在女性中更为常见，占全球癌症发病率的11.6％和癌症死亡率的6.6％，已成为威胁女性健康的主要病因。2020年最新数据显示，全球乳腺癌新增人数达226万，超第二名肺癌6万例。乳腺癌的发病率在40岁以后上升，50岁以上的女性发病率最高。它是一种异质性恶性肿瘤，根据激素受体(HR)和人表皮生长因子受体2(HER2)分为不同的亚型，不同的亚型又分为不同的治疗方法，包括手术、化疗、内分泌治疗、生物治疗、基因导向治疗。乳腺癌在全球范围内的高发生率也引起了人们的高度重视，推动了相关领域的诊疗创新。目前诊断方面已由早期的物理诊断技术，发展到现在的分子诊断技术；药物治疗方面包括了抗体药物、小分子靶向药以及细胞免疫治疗等。由于乳腺癌病因尚不明确，早期诊断和综合治疗是防治乳腺癌发生的最有效手段。对乳腺癌早期诊断的技术主要有临床体格检查、摄影学诊断法、生物靶标早期检测、穿刺活检。但是这些技术仍然存在耗资大、漏检率高、易受外在因素的影响等不足，因此迫切需要建立新的检测技术，尽早客观准确的诊断乳腺癌，以便有针对性的对患者进行治疗，提高患者的生存率，降低医疗成本。

外泌体(Exosome)是具有脂质双层膜结构，直径大约在30-150nm，密度在1.13-1.21g/ml的细胞外囊泡。外泌体大多数细胞均能分泌，广泛存在于体液中，如血液、尿液、唾液、泪液和母乳。外泌体是重要的细胞间信使，它可以携带蛋白质，运送RNA。外泌体内含蛋白质、脂质以及miRNA等成分，会携带源细胞独特或关键的功能分子，使不同来源的外泌体具有不同的生物学功能。早期外泌体就作为一个新型研究热点，成为了疾病诊断治疗的潜在有效方式。近几年，陆续有研究报道了外泌体可以参与调控机体的基因表达、免疫平衡、存活和增殖、受体-配体信号、繁殖和发育以及凋亡等。但是大多研究主要集中于外泌体miRNA对癌症的调节机制，关于外泌体mRNA的相关报道仍然较少，尤其是外泌体mRNA于乳腺癌的相关性研究。

FAXDC2基因是脂肪酸羟化酶家族中的成员，脂肪合成在巨核分化中发挥重要功能，它是巨核细胞分化的过程中的正调控因子。研究表明，FAXDC2的表达量随巨核细胞分化的过程而显著上升，而在急性髓系白血病和急性巨核细胞白血病中的表达量显下降。另外，血液中FAXDC2 mRNA表达水平是认知障碍的有用标志之一，可以有效的将进行性核上性麻痹患者与健康受试者区分开来。但是目前对于FAXDC2 mRNA的研究较少采用人乳腺癌组织或乳头吸引液，在外泌体中的表达情况以及与乳腺癌相关的更鲜有报道。

GGT3P基因是GGT的一种附加形式，存在众多组织的细胞膜中，在胆管上皮细胞、胰腺腺泡细胞、肾小管上皮细胞以及乳腺细胞中的活性最强。GGT催化γ-谷氨酰基转换的一种酶，主要参与体内谷胱甘肽的代谢。它常用于诊断肝胆疾病，是测定胆道梗阻和肝炎活动的指标。在患者发生原发性或转移性肝癌时，血液中GGT表达量升高。目前仍然缺乏外泌体GGT3P mRNA表达水平与乳腺癌的相关性研究。

专利文献US20170298443A1公开了FAXDC2与肾癌的相关性；

专利文献US20170298443A1公开了FAXDC2作为血液紊乱标志物的应用；

专利文献WO2014022594A1公开了GGT3P与前列腺癌相关；

以上文献均未公开FAXDC2或GGT3P作为乳腺癌标志物的应用，尤其是外泌体中FAXDC2 mRNA和GGT3P mRNA用于诊断乳腺癌。

因此，提供一种通过检测外泌体中FAXDC2 mRNA和GGT3P mRNA的表达水平诊断患者是否患有乳腺癌的方法，并且观察药物对乳腺癌的治疗效果，是建立乳腺癌早筛技术的重要基础。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种检测乳腺癌的生物标志物，所述的生物标志物包括FAXDC2和/或GGT3P。

本发明所述的各生物标志物均可单独或组合作为诊断或评估乳腺癌的依据。

优选的，乳腺癌诊断的依据为FAXDC2和/或GGT3P的mRNA的表达量的多少。

优选的，所述的生物标志物来源于血液、尿液、唾液、泪液和母乳中，进一步优选的，所述的生物标志物来源于血液，更优选的，所述的生物标志物来源于血液中的血浆外泌体。

本发明的第二方面，提供了一种生物标志物或检测生物标志物的试剂在制备乳腺癌诊断、预防、预后和/或药效评估的产品中的应用，或者，在诊断乳腺癌、解释乳腺癌病因、筛选治疗或预防乳腺癌的药物及为临床治疗提供决策支持的产品中的应用。

优选的，所述的试剂选自探针组、引物组、试剂盒、蛋白芯片或基因芯片。

优选的，所述的引物组包含SEQ ID NO：1-2或SEQ ID NO：3-4所示序列。

优选的，所述的生物标志物为FAXDC2和/或GGT3P。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测生物标志物的试剂为检测FAXDC2和/或GGT3P的mRNA的表达量的试剂。

优选的，所述的生物标志物来源于血液、尿液、唾液、泪液和母乳中，进一步优选的，所述的生物标志物来源于血液，更优选的，所述的生物标志物来源于血液中的血浆外泌体。

本发明的第三方面，提供了一种筛选用于治疗或预防乳腺癌的药物的方法，包括如下步骤：

a)将患乳腺癌的生物样品置于存在候选药物的条件下培养；

b)将患乳腺癌的生物样品置于不存在候选药物的条件下培养；

c)检测步骤a)和步骤b)的生物样品中的编码生物样品中的乳腺癌的生物标志物的mRNA的表达水平；

或者c)确定生物样品在步骤a)和步骤b)两种情况下的乳腺癌的生物标志物的mRNA的表达水平以及动物死亡率变化，以此结果指示候选药物是否可以用于治疗或预防乳腺癌。

优选的，所述的生物样品为动物模型，进一步优选的，所述的动物模型选自大鼠、小鼠、兔或猴。

本发明的第四方面，提供了生物标志物在制备诊断乳腺癌的产品中的应用，所述的生物标志物为FAXDC2和/或GGT3P。

优选的，所述的生物标志物来源于血液、尿液、唾液、泪液和母乳中，进一步优选的，所述的生物标志物来源于血液，更优选的，所述的生物标志物来源于血液中的血浆外泌体。

优选的，所述的生物标志物为来源于血浆外泌体的FAXDC2和/或GGT3P的mRNA。

本发明的第五方面，提供了一种检测乳腺癌的生物标志物的试剂，所述的生物标志物为FAXDC2和/或GGT3P；或者，所述的试剂选自探针组、引物组、蛋白芯片、基因芯片或试剂盒。

优选的，所述的引物组包含SEQ ID NO：1-2或SEQ ID NO：3-4所示序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测生物标志物的试剂为检测FAXDC2和/或GGT3P的mRNA的表达量的试剂。

优选的，所述的生物标志物来源于血液、尿液、唾液、泪液和母乳中，进一步优选的，所述的生物标志物来源于血液，更优选的，所述的生物标志物来源于血液中的血浆外泌体。

本发明的第六方面，提供了一种治疗或预防乳腺癌的药物，所述的药物以上述生物标志物作为靶点。

本发明的第七方面，提供了一种探针组，所述探针组检测FAXDC2和/或GGT3P的mRNA。

优选的，根据上述FAXDC2和/或GGT3P的mRNA通过公知、通用的方法设计合成或选择合适的探针分子，对目的蛋白进行特异性捕获或对目的片段进行特异性捕获、扩增、测序，以达到检测样本的目的。

优选的，所述的检测FAXDC2和/或GGT3P的探针选自与乳腺癌的生物标志物特异性结合的抗原、抗体、酶、吸水或疏水物质、结合阳离子或阴离子的化学集团、受体或免疫复合物。

本发明所述的FAXDC2和/或GGT3P的mRNA可以用于治疗或预防乳腺癌的药物的筛选。

本发明的第八方面，提供了一种含有本发明所述的探针组的芯片，所述的芯片为基因芯片或蛋白芯片。

优选的，所述的芯片还包括固相载体。进一步优选的，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片或聚丙烯膜中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述探针固定在固相载体上的方法选自原位合成法、点样法或其他固定方法。

其中，将芯片中的探针固定在所述的固相载体上。优选的，将探针序列密集有序地排列固定在固相载体预先设置的区域内，形成微型检测器件。

本发明的第九方面，提供了一种乳腺癌诊断或预后评估的试剂盒，所述的试剂盒中包含检测生物标志物的表达量的试剂，所述生物标志物为FAXDC2和/或GGT3P。

优选的，所述的试剂选自探针组、引物组、蛋白芯片、基因芯片或药物。

优选的，所述的引物组包含SEQ ID NO：1-2或SEQ ID NO：3-4所示序列。

优选的，所述的生物标志物来源于血液、尿液、唾液、泪液和母乳中，进一步优选的，所述的生物标志物来源于血液，更优选的，所述的生物标志物来源于血液中的血浆外泌体。

优选的，所述的生物标志物的表达量为生物标志物的mRNA的表达量。

优选的，所述的试剂盒包含上述的试剂。

本发明的第十方面，提供了一种乳腺癌的生物标志物的检测方法，所述的检测方法包括检测乳腺癌的生物标志物的mRNA表达量，优选的，所述的生物标志物为FAXDC2和/或GGT3P。

优选的，所述的生物标志物来源于血液、尿液、唾液、泪液和母乳中，进一步优选的，所述的生物标志物来源于血液，更优选的，所述的生物标志物来源于血液中的血浆外泌体。

优选的，所述的检测方法包括：

(1)提取血浆外泌体中总RNA；

(2)以步骤(1)获得的总RNA为模板进行cDNA逆转录，并扩增获得目的基因；

(3)对步骤(2)获得的cDNA进行荧光定量RT-PCR，对编码乳腺癌的生物标志物的mRNA进行定量分析。

优选的，逆转录所使用的引物包含SEQ ID NO：1-2或SEQ ID NO：3-4所示序列。

本发明的第十一方面，提供了一种本发明所述的生物标志物、本发明所述的探针组、本发明所述的试剂、本发明所述的芯片，或本发明所述的试剂盒在制备乳腺癌诊断、预防、预后和/或药效评估的产品中的应用，或者，在解释乳腺癌病因、筛选治疗或预防乳腺癌的药物及为临床治疗提供决策支持的产品中的应用。

本发明所述的产品包括所有与乳腺癌检测、诊断、预防、预后、药效评估、病因解释、筛选治疗或预防乳腺癌的药物及为临床治疗提供决策支持的产品，优选的，所述的产品包括但不限于探针组、引物组、试剂盒、蛋白芯片或基因芯片。

本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。

本发明所述的“预防”包括病因预防，即针对致病因素的预防措施，分针对环境的措施和针对机体的措施；临床前期预防(或症候前期)，即在疾病的临床前期作好早期发现、早期诊断、早期治疗的"三早"预防措施；临床预防，即借助各种临床治疗方法，对患某些病者，及时治疗，防止恶化使疾病早日康复，减少疾病的不良作用，预防并发症和伤残。

本发明所述的“预后”是指对创伤或疾病可能造成的后果的预测。预后与伤病的种类、患者的身体状况、有无适当的治疗措施及措施采取是否及时有关。

本发明所述的“药效评估”是指针对某一药物在用药后对机体产生一定强度的药理效应的评估。

有益效果：

1.首次提出的外泌体FAXDC2 mRNA和GGT3P mRNA标志物可以完成乳腺癌鉴别、病程监控以及乳腺癌辅助诊断；

2.利用本发明可以对早期乳腺癌患者或疑似患者进行筛查加以鉴别；

3.本发明采用两个外泌体mRNA指标进行检测，结果准确可靠。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：荧光定量PCR检测结果，***为显著性差异，疾病对照组即为乳腺结节对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：与乳腺癌相关的mRNA的筛选

1.1样本的收集和样本资料的整理

本实施例于2020.10-2021.1时间在深圳市安幼保健院收集了10例健康成年人和10例乳腺癌患者。每例样本采血2ml，乳腺癌患者在入院后采血，采血时间不超过半小时。2小时内离心，2000rpm离心5分钟，取上清(血浆)。

1.2按照外泌体提取试剂盒(System Biosciences Inc,Mouontain View,CA)说明，提取血浆中外泌体。

1.3用Trizol试剂(Life Tech Inc,USA)提取外泌体里的RNA，并对其浓度和纯度测定。

1.4核酸标志物初筛：通过上述分析方法，对10个健康人和10个乳腺癌患者的外泌体进行mRNA高通量测序分析，按照差异倍数|log2(FoldChange)|>1且false discoveryrate<0.01的标准，进行了mRNA的初筛，结果发现355个差异表达的基因。接下来通过生物信息学分析分别筛选出表达显著下调的FAXDC2(log2(FoldChange)＝-3.7，且falsediscovery rate<0.01)mRNA和GGT3P(log2(FoldChange)＝-5.1，且false discovery rate<0.01)mRNA与肿瘤的发生发展相关，该2种mRNA的核酸序列表如下所示：

表1 FAXDC2 mRNA和GGT3P mRNA序列

实施例2：外泌体mRNA对乳腺癌诊断特异性与敏感性分析

收集宝安妇幼保健院50例乳腺癌患者，20例乳腺结节患者，和10例健康人血浆，每例2ml，提取外泌体，并对筛选出来的FAXDC2 mRNA和GGT3P mRNA进行荧光定量PCR，具体操作步骤如下：

2.1RNA提取

(1)取500μL全血于15mL离心管中，加入10倍体积红细胞裂解液，混匀，室温避光静置10min，离心10min，弃上清。

(2)PBS重悬细胞沉淀，离心10min弃上清，100μL PBS重悬细胞，加入1mL TRIpure，静置5min，加入250μL三氯甲烷，冰上静置5min。

(4)混合液4℃，10000g，10min离心。取上清500μL于1.5mL EP管中，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置15min。

(5)溶液4℃，10000g，10min离心，小心倒掉液体，加入1mL 4℃预冷的75％乙醇，颠倒数次，清洗RNA沉淀，4℃，10000g，5min离心，倒掉液体，于超净工作台中干燥数分钟，将乙醇充分挥发干净，加入100μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。

2.2反转录获得cDNA：

1)提取上述样品的外泌体中的RNA，作为模板，在去RNase的PCR管中加入模板(50-150ng)、RT引物(15-20pmol)和RNA free H

2)将上述溶液混匀，65℃孵育5min，以打开RNA二级结构，随后立即置于冰上，防止RNA复性恢复二级结构。

2.3应用荧光定量PCR方法，对从血浆外泌体里面提取的RNA进行逆转录，定量检测FAXDC2 mRNA和GGT3P mRNA的表达量，获得其Ct值。同时，我们检测健康人血浆外泌体中FAXDC2 mRNA和GGT3P mRNA的Ct值。以此为参照，判断否患有乳腺癌；上述所述的引物包括基因FAXDC2和GGT3P的引物。所述的基因FAXDC2和GGT3P包括特异性上游引物和特异性下游引物。基因FAXDC2的特异性上游引物为ATGAAAGGAGAAGCTGGAC(SEQ ID NO：1)，特异性下游引物为TCACTCCATCCTCTTTGG(SEQ ID NO：2)。GGT3P的特异性上游引物为CCGGAGGGAAAGAAAGAGCG(SEQ ID NO：3)，特异性下游引物为GACAGGCCAGGGAGGCCA(SEQ IDNO：4)。检测结果如图1所示，乳腺癌组的FAXDC2和GGT3P mRNA的表达量显著低于正常组和乳腺结节对照组。AUC分析结果表明FAXDC2和GGT3P mRNA的表达对乳腺癌诊断具有较高的敏感性和特异性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

  序列表

<110> 深圳市宝安区妇幼保健院

<120> 一种血浆外泌体生物标志物在乳腺癌诊断中的应用

<130> 1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaggag aagctggac 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcactccatc ctctttgg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggagggaa agaaagagcg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacaggccag ggaggcca 18