小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒。

背景技术

由于小鼠的基因序列与人类差不多，小鼠的胚胎组织是试验研究中常用的是动物模型，因此，小鼠可作为研究不同药物介导的免疫缺陷的模型，在科学研究中起着重要的作用。

而通过小鼠染色试剂盒代替对活体小鼠的研究在可以起到对小鼠进行研究的同时，可以避免小鼠在运输中死亡和逃跑的风险。

但现有的小鼠染色试剂盒中仅具有小鼠组织芯片，没有小鼠胚胎芯片，从而限制了对小鼠的研究的范围。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒，旨在解决现有的小鼠染色试剂盒中没有小鼠胚胎芯片的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒，包括五个小鼠胚胎组织芯片和免疫荧光染色试剂耗材，

所述免疫荧光染色试剂耗材包括免疫染色通透液、固定液、免疫染色一抗稀释液、洗涤液、封闭液、免疫荧光染色二抗稀释液、抗荧光淬灭封片液、免疫荧光染色二抗、免疫荧光染色一抗、山羊血清和盖玻片。

其中，所述免疫荧光染色二抗包括免疫荧光染色二抗-抗大鼠Cy3、免疫荧光染色二抗-抗人FITC、免疫荧光染色二抗-抗山羊Cy3、免疫荧光染色二抗-抗兔AlexaFluor350、免疫荧光染色二抗-抗兔AlexaFluor488、免疫荧光染色二抗-抗兔AlexaFluor555、免疫荧光染色二抗-抗兔AlexaFluor647、免疫荧光染色二抗-抗兔Cy3、免疫荧光染色二抗-抗兔FITC、免疫荧光染色二抗-抗小鼠AlexaFluor488、免疫荧光染色二抗-抗小鼠AlexaFluor555、免疫荧光染色二抗-抗小鼠AlexaFluor647、免疫荧光染色二抗-抗小鼠AlexaFluor350、免疫荧光染色二抗-抗小鼠Cy3和免疫荧光染色二抗-抗小鼠FITC中的任意一种或两种。

其中，所述小鼠胚胎组织芯片包括小鼠胚胎组织石蜡芯片和小鼠胚胎组织冰冻芯片中的任意一种。

其中，所述固定液包括免疫染色固定液和4％多聚甲醛固定液中的任意一种；

所述洗涤液包括免疫染色洗涤液和缓冲洗涤液；

所述封闭液包括免疫染色封闭液和缓冲封闭液。

其中，所述缓冲洗涤液的制备方法包括：

称取24.2g的三羟甲基氨基甲烷和80g氯化钠混合，得到混合溶液；

使用盐酸将所述混合溶液的pH至调节至7.6，得到调整溶液；

将1升的所述调整溶液按照1:9的比例用水稀释，得到三乙醇胺缓冲盐水溶液；

使用非离子型去垢剂将所述三乙醇胺缓冲盐水溶液的最终浓度调整为0.1％，得到缓冲洗涤液。

其中，所述缓冲封闭液的制备方法包括：

在100毫升的TBST缓冲液中加入5克山羊血清，溶解并混匀，得到缓冲封闭液。

其中，所述小鼠胚胎组织石蜡芯片的免疫荧光染色方法包括：

对所述小鼠胚胎组织石蜡芯片依次进行脱蜡、水化和抗原修复，得到脱蜡芯片；

用所述固定液固定所述脱蜡芯片固定10分钟；

使用所述洗涤液洗涤所述脱蜡芯片3次，每次3-5分钟，直至将所述脱蜡芯片上的所述固定液去除；

使用所述封闭液将洗涤后的所述脱蜡芯片封闭60分钟；

使用所述免疫染色一抗稀释液将所述免疫荧光染色一抗稀释至预设浓度，得到稀释一抗；

用所述稀释一抗去除所述脱蜡芯片上的所述封闭液60分钟；

用所述洗涤液洗涤所述脱蜡芯片3-5次，每次3-5分钟，去除所述脱蜡芯片上的所述封闭液；

用所述免疫荧光染色二抗稀释液按照1:1000的比例稀释所述免疫荧光染色二抗，得到稀释二抗；

使用所述稀释二抗对所述脱蜡芯片避光孵育60分钟，去除所述脱蜡芯片上的所述洗涤液；

回收所述稀释二抗，用所述洗涤液洗涤孵育后的所述脱蜡芯片3-5次，每次3-5分钟，得到封片芯片；

将所述封片芯片避光储存，使用所述使用抗荧光淬灭封片液滴加在所述封片芯片上，并使用所述盖玻片盖于所述封片芯片上后，在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察所述封片芯片的小鼠胚胎组织染色状况，拍照以获取小鼠胚胎组织染色图像和数据。

本发明的一种小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒，通过五个小鼠胚胎组织芯片和免疫荧光染色试剂耗材，所述免疫荧光染色试剂耗材包括免疫染色通透液、固定液、免疫染色一抗稀释液、洗涤液、封闭液、免疫荧光染色二抗稀释液、抗荧光淬灭封片液、免疫荧光染色二抗、免疫荧光染色一抗、山羊血清和盖玻片，每个所述小鼠胚胎组织芯内的小鼠胚胎组织种类可以相同，也可以不同，小鼠胚胎组织的年龄可以相同，也可以不同，可根据实验需要决定。小鼠胚胎组织芯片上可以设定阴性对照，阳性对照。小鼠胚胎组织染色时，在有适当的一抗检测特定目标蛋白的条件下，可以使用我们的小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒检测出各种小鼠胚胎组织上的红色、绿色或蓝色等荧光，全过程不需要使用活的小鼠，从而规避了运输过程中发生的小鼠死亡和逃跑的风险，解决了现有的小鼠染色试剂盒中没有小鼠胚胎芯片的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是所述缓冲洗涤液的制备方法的流程图。

图2是所述小鼠胚胎组织石蜡芯片的免疫荧光染色方法的流程图。

图3是小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒的产品清单图。

图4是小鼠胚胎组织芯片的结构图。

图5是小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒的内外包装图。

图6是小鼠胚胎组织芯片的免疫荧光染色后的效果图。

图7是小鼠胚胎组织芯片的制备方法的流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

请参阅图1至图7，本发明提供一种小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒，包括五个小鼠胚胎组织芯片和免疫荧光染色试剂耗材，

所述免疫荧光染色试剂耗材包括免疫染色通透液、固定液、免疫染色一抗稀释液、洗涤液、封闭液、免疫荧光染色二抗稀释液、抗荧光淬灭封片液、免疫荧光染色二抗、免疫荧光染色一抗、山羊血清和盖玻片；

图5(A)为试剂盒的结构示意图，(B)为试剂盒的俯视图，(C)为试剂盒的内部结构示意图，(D)为小鼠胚胎组织芯片的结构示意图。

所述小鼠胚胎组织芯片的制备方法包括：

S1选择适龄雌雄小鼠数只，检查小鼠外部生殖器官情况和动情期；

具体的，动情期确定：外阴部充血暗红，肿胀；阴道粘膜干燥，阴道口开放；

阴栓检查：从阴道口观察阴栓，或有白色或黄白粘液。交配后1h阴栓逐渐软化，常于12-24h脱落。

胚龄确定：种鼠妊娠第一天，即为鼠胚日龄0.5d。

饲养条件：环境湿度50％±5；环境温度：25℃±3；照明模拟：150～300Lx；明暗12L/12D。

S2按雌雄比例2:1或者1:1配笼饲养，得到多只孕鼠；

具体的，按雌雄比例2:1或者1:1配笼饲养，可下午3-4点合笼，次日8点左右检查阴栓情况。

S3选取胚龄7.5d-18.5d的孕鼠，脱颈处死，剖开腹腔，分离粘膜，剪断子宫颈，在显微镜辅助下在滤纸上沿子宫侧轴将子宫剪开，剥离蜕膜分离鼠胚，得到12种不同周期的鼠胚；

具体的，选取胚龄7.5d-18.5d的孕鼠，脱颈处死。剖开腹腔，暴露“v”形子宫，管道明显充盈。分离粘膜，剪断子宫颈，在显微镜辅助下在滤纸上沿子宫侧轴将子宫剪开，剥离蜕膜分离鼠胚。采用bouin固定液，经脱水，透明，浸蜡后石蜡包埋，切片染色后显微镜下观察胚胎形态。

图4(A)为7.5d-10.5d的小鼠胚胎组织芯片的结构图，(B)为11.5d-14.5d的小鼠胚胎组织芯片的结构图，(C)为15.5d-18.5的小鼠胚胎组织芯片的结构图。

S4利用方形孔板，固定组织，采集12种不同周期的鼠胚，并按照矢状面、冠状面和横断面排列在受体空白石蜡块中，制成石蜡组织芯片蜡块；

具体的，与传统蜡块不同，本芯片提供7.5D-18.5D的12种不同时期胚胎组织。可同时观察，避免因实验操作造成误差。利用方形孔板，固定组织，采集12种不同周期的鼠胚(也可定制芯片内容)。并将它们按照矢状面、冠状面和横断面的要求整齐排列在受体空白石蜡块(特制蜡块)中，制成石蜡组织芯片蜡块。

S5对所述石蜡组织芯片蜡块进行切片后放置玻片上，得到小鼠胚胎组织芯片。

具体的，对蜡块进行切片，选取合适切片放置玻片上制成组织芯片，预处理后4℃冰箱或者常温干燥保存。。

具体的，所述免疫荧光染色一抗包括抗CDX2单克隆抗体、一抗VASA兔抗鼠中的任意一种。

每个所述小鼠胚胎组织芯内的小鼠胚胎组织种类可以相同，也可以不同，小鼠胚胎组织的年龄可以相同，也可以不同，可根据实验需要决定。小鼠胚胎组织芯片上可以设定阴性对照，阳性对照。小鼠胚胎组织染色时，在有适当的一抗检测特定目标蛋白的条件下，可以使用我们的小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒检测出各种小鼠胚胎组织上的红色、绿色或蓝色等荧光。保存条件，4℃和-20℃条件下保存，一年有效。二抗需避光保存，解决了现有的小鼠染色试剂盒中没有小鼠胚胎芯片的问题，同时具有高通量，检测速度快、成本低、速度快等特点。

进一步，所述免疫荧光染色二抗包括免疫荧光染色二抗-抗大鼠Cy3、免疫荧光染色二抗-抗人FITC、免疫荧光染色二抗-抗山羊Cy3、免疫荧光染色二抗-抗兔AlexaFluor350、免疫荧光染色二抗-抗兔AlexaFluor488、免疫荧光染色二抗-抗兔AlexaFluor555、免疫荧光染色二抗-抗兔AlexaFluor647、免疫荧光染色二抗-抗兔Cy3、免疫荧光染色二抗-抗兔FITC、免疫荧光染色二抗-抗小鼠AlexaFluor488、免疫荧光染色二抗-抗小鼠AlexaFluor555、免疫荧光染色二抗-抗小鼠AlexaFluor647、免疫荧光染色二抗-抗小鼠AlexaFluor350、免疫荧光染色二抗-抗小鼠Cy3和免疫荧光染色二抗-抗小鼠FITC中的任意一种或两种。

所述小鼠胚胎组织芯片包括小鼠胚胎组织石蜡芯片和小鼠胚胎组织冰冻芯片中的任意一种。

所述固定液包括免疫染色固定液和4％多聚甲醛固定液中的任意一种；

所述洗涤液包括免疫染色洗涤液和缓冲洗涤液；

所述封闭液包括免疫染色封闭液和缓冲封闭液。

具体的，(1)固定液的准备：

推荐使用贝拓生物生产的免疫染色固定液，也可以用4％多聚甲醛作为固定液，或根据特定的一抗或样品采用有效成分为乙醇、甲醇或其它类型的固定液。

(2)洗涤液的准备：

推荐使用贝拓生物生产的免疫染色洗涤液，也可以按照如下方法配制TBST作为洗涤液：

10XTBS的配制：称取24.2gTris(Tris碱),80gNaCl；用盐酸调节pH值至7.6，定容至一升。

TBS配制：把10XTBS按照1:9的比例用水稀释至1X即为TBS。

TBST的配制：在TBS中加入TritonX-100使最终浓度为0.1％，混匀，即为TBST。

(3)封闭液的准备：

推荐使用贝拓生物生产的免疫染色封闭液，也可以按照如下方法配制含5％BSA的TBST作为封闭液：

含5％BSA的TBST的配制：在100毫升TBST中加入5克BSA(山羊血清)，溶解并混匀，即为含5％BSA的TBST。

(4)一抗稀释液的准备：

推荐使用贝拓生物生产的免疫染色一抗稀释液，也可以使用上述封闭液，即含5％BSA的TBST，作为一抗稀释液。

(5)一抗的稀释：

按照一抗说明书中推荐的用于免疫荧光染色的稀释比例用一抗稀释液稀释一抗。

(6)荧光标记二抗的稀释：

把荧光标记的二抗，按照1:1000的比例用本试剂盒提供的免疫荧光染色二抗稀释液进行稀释。根据荧光的强弱，稀释的比例可以适当提高或降低。

进一步的，所述缓冲洗涤液的制备方法包括：

S101称取24.2g的三羟甲基氨基甲烷和80g氯化钠混合，得到混合溶液；

S102使用盐酸将所述混合溶液的pH至调节至7.6，得到调整溶液；

S103将1升的所述调整溶液按照1:9的比例用水稀释，得到三乙醇胺缓冲盐水溶液；

S104使用非离子型去垢剂将所述三乙醇胺缓冲盐水溶液的最终浓度调整为0.1％，得到缓冲洗涤液。

所述缓冲封闭液的制备方法包括：

在100毫升的TBST缓冲液中加入5克山羊血清，溶解并混匀，得到缓冲封闭液。

所述小鼠胚胎组织石蜡芯片的免疫荧光染色方法包括：

S201对所述小鼠胚胎组织石蜡芯片依次进行脱蜡、水化和抗原修复，得到脱蜡芯片；

S202用所述固定液固定所述脱蜡芯片固定10分钟；

具体的，所述小鼠胚胎组织并芯片直接从在步骤S202开始，(可4℃过夜)。

S203使用所述洗涤液洗涤所述脱蜡芯片3次，每次3-5分钟，直至将所述脱蜡芯片上的所述固定液去除；

具体的，去固定液，用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

S204使用所述封闭液将洗涤后的所述脱蜡芯片封闭60分钟；

具体的，用封闭液封闭60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。

S205使用所述免疫染色一抗稀释液将所述免疫荧光染色一抗稀释至预设浓度，得到稀释一抗；

S206用所述稀释一抗去除所述脱蜡芯片上的所述封闭液60分钟；

具体的，去封闭液，用稀释的特定一抗作用60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以4℃作用过夜。

S207用所述洗涤液洗涤所述脱蜡芯片3-5次，每次3-5分钟，去除所述脱蜡芯片上的所述封闭液；

具体的，去除一抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

S208用所述免疫荧光染色二抗稀释液按照1:1000的比例稀释所述免疫荧光染色二抗，得到稀释二抗；

S209使用所述稀释二抗对所述脱蜡芯片避光孵育60分钟，去除所述脱蜡芯片上的所述洗涤液；

具体的，去除洗涤液，加入1毫升稀释好的荧光标记的二抗避光孵育60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。

S210回收所述稀释二抗，用所述洗涤液洗涤孵育后的所述脱蜡芯片3-5次，每次3-5分钟，得到封片芯片；

具体的，回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟，期间适当注意避光操作。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

S211将所述封片芯片避光储存，使用所述使用抗荧光淬灭封片液滴加在所述封片芯片上，并使用所述盖玻片盖于所述封片芯片上后，在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察所述封片芯片的小鼠胚胎组织染色状况，拍照以获取小鼠胚胎组织染色图像和数据。

具体的，封片后的小鼠胚胎组织石蜡芯片可避光放入4℃冰箱最长一个月。在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察小鼠胚胎组织染色状况，拍照以获取小鼠胚胎组织染色图像和数据。在使用抗荧光淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍尽量避光，特别是需要尽量缩短在荧光显微镜下的观察时间。荧光物质均易发生淬灭，染色后宜尽快进行荧光显微镜下的观察和拍照。如果不能及时观察，可以4℃避光保存，但存放时间通常不宜超过一周，随着存放时间的延长可能会导致观察效果越来越差。如果观察时发现荧光过弱，可以适当提高一抗的浓度；如果荧光还是比较弱，可以适当提高荧光标记抗体的浓度。

以上所揭露的仅为本发明一种小鼠胚胎组织芯片免疫荧光染色试剂盒较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。