SESN2和chi-miR-130b-3p在调节由玉米赤霉烯酮诱导的颗粒细胞凋亡中的应用
文献发布时间:2024-01-17 01:26:37
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及SESN2和chi-miR-130b-3p在调节由玉米赤霉烯酮诱导的颗粒细胞凋亡中的应用。
背景技术
真菌毒素是真菌产生的有毒次级代谢产物,它们会污染生长中的作物或储存的粮食。玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)作为一种分布广泛、强效的霉菌毒素,给畜牧业和食品加工业带来了不小的麻烦。除类雌激素作用外(Poor,et al.,2015),ZEA还会引起细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累(Feng et al.,2022),导致氧化应激和细胞凋亡(Zhu etal.,2022)。
颗粒细胞(granulosa cells,GCs)对卵母细胞的成熟和卵泡的发育都至关重要。在卵泡发育的早期,GCs会与卵母细胞形成间隙连接(Hasegawa,et al.,2007),用于信息交流和物质交换,为卵母细胞提供合适的微环境(Zhou,et al.,2019)。随着卵泡的发育,GCs开始分化为MGCs和CCs(Fan,et al.,2009)。MGCs分泌类固醇激素和生长调节因子,促进整个卵泡的生长发育(Yamochi et al.,2021)。CCs与卵母细胞形成COCs,cAMP和氨基酸等营养物质通过间隙连接从GCs转运到卵母细胞(Regassa,et al.,2011)。因此,一旦GCs因外界压力条件而受损,整个雌性生殖系统将受到不利影响。
Sestrins(SESNs)是一个进化上高度保守的应激诱导蛋白家族(Kumar,et al.,2020),它由Sesterin 1-3组成,在应激条件下上调(Lee,et al.,2013)。作为各种应激诱导的代谢调节因子,SESN2可以通过激活分解代谢反应、停止合成代谢活动和启动细胞修复机制来帮助细胞维持细胞稳态(Pasha,et al.,2017)。KEAP1/NRF2是一种经典的受SESN2调节的信号通路,可降低细胞内ROS水平(Tu et al.,2019)。通常,NRF2与KEAP1在细胞质中结合,形成复合物,此时NRF2维持一种相对较低的表达水平(Yamamoto et al.,2018)。然而,在氧化应激条件下,NRF2会转移到细胞核中并与抗氧化反应元件(AREs)结合,从而通过激活一系列下游氧化还原酶(包括SOD、CAT、HO-1和GPX)的转录来发挥抗氧化功能(Yang,etal.,2019)。但SESN2对GCs中因为ZEA暴露所造成的损伤具体应对机制尚未得到彻底的研究。
miRNA是一种小的非编码RNA序列,大小从18到25个核苷酸不等,在转录后基因表达调控中发挥着关键作用。随着高通量测序技术的快速发展,miRNA的功能越来越多地被人们所熟知。据研究报道,已经有几种miRNA被证实能够调节SESN2的表达,包括miR-182-5p(Zhang,et al.,2022)、miR-138-5p(An,et al.,2021)和miR-199a-5p(Yang,et al.,2022)等。由于ZEA已被证明可导致ROS积累并上调GCs中SESN2的表达水平(Qin,et al.,2015),因此本研究想了解miRNA是否也参与了这一过程。
发明内容
本发明的目的在于提供SESN2或/和chi-miR-130b-3p在调节GCs凋亡中的应用。
本发明的另一目的在于SESN2或/和chi-miR-130b-3p在调节GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。
本发明的又一目的在于提供一种减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
SESN2或/和chi-miR-130b-3p在以下(1)或(2)或(3)中的应用,
(1)调节GCs凋亡;
(2)调节GCs中ROS的积累和氧化应激损伤;
(3)减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤。
优选的,过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p减弱GCs凋亡;抑制所述的SESN2或/和过表达所述的chi-miR-130b-3p加重GCs凋亡。进一步优选的,所述的GCs凋亡为由ZEA诱导的GCs凋亡。
优选的,过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p能够减轻GCs中ROS的积累和氧化应激损伤;抑制所述的SESN2或/和过表达所述的chi-miR-130b-3p加重GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。进一步优选的,所述的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤为由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。进一步优选的,所述的SESN2或/和chi-miR-130b-3p通过KEAP1/NRF2信号通路影响由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。
优选的,过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p能够减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤。
一种调节由ZEA诱导的GCs凋亡的方法,过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p减弱由ZEA诱导的GCs凋亡;抑制所述的SESN2或/和过表达所述的chi-miR-130b-3p加重由ZEA诱导的GCs凋亡。
一种调节由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤的方法,过表达所述的SESN2或/和干扰所述的chi-miR-130b-3p能够减轻由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤;抑制所述的SESN2或/和过表达所述的chi-miR-130b-3p加重由ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤。
一种减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤的方法,过表达SESN2或/和干扰chi-miR-130b-3p减轻ZEA对GCs造成的细胞损伤。
本发明的有益效果:
随着集约化养殖的规模不断扩大,牛、羊等常规放牧饲养的家畜种类也逐渐转为大规模棚舍集中饲养。因此,ZEA中毒事件的发生也愈发频繁。ZEA不仅会扰乱雌性动物的生殖周期,更会损伤颗粒细胞以及卵母细胞在内的生殖细胞,极大的影响雌性动物繁殖能力。本研究发现SESN2和chi-miR-130b-3p参与调控了ZEA在山羊GCs中引起的氧化应激损伤以及细胞凋亡过程。并且过表达SESN2或抑制chi-miR-130b-3p的表达可以减轻ZEA对山羊GCs造成的细胞损伤。因此,SESN2和chi-miR-130b-3p可以作为减轻ZEA毒性的潜在治疗靶点,在实际生产过程中减弱ZEA对生殖细胞的损伤作用,提高雌性动物的繁殖能力。
附图说明
图1为与SESN2存在潜在互作关系miRNAs的筛选;
其中:(A)chi-miR-17-5p、chi-miR-20b以及chi-miR-130b-3p对SESN2在mRNA水平表达量的影响。(B)chi-miR-17-5p、chi-miR-20b以及chi-miR-130b-3p对SESN2在蛋白水平表达量的影响。
图2为SESN2和chi-miR-130b-3p表达量的检测以及互作关系预测;
其中:(A)阴性对照组和ZEA处理组中NR4A1,CHAC1,TRIB3,PPP1R15A和POLR2E的FPKM值。(B)阴性对照组和ZEA处理组中NR4A1,CHAC1,TRIB3,PPP1R15A和POLR2E mRNA水平表达量。(C)SESN2在差异基因火山图中的定位。
(D)阴性对照组和ZEA处理组中SESN2在mRNA水平表达量。(E)阴性对照组和ZEA处理组中SESN2在蛋白水平表达量。(F)SESN2与miRNAs靶向关系预测。(G)阴性对照组和ZEA处理组中chi-miR-130b-3p的FPKM值。(H)阴性对照组和ZEA处理组中chi-miR-130b-3p mRNA水平表达量。
图3为SESN2和chi-miR-130b-3p靶向关系的验证;
其中:(A)野生型以及突变型SESN2过表达质粒序列的构建。(B)chi-miR-130b-3p模拟物效率验证。(C)chi-miR-130b-3p干扰物效率验证。(D)chi-miR-130b-3p模拟物与野生型以及突变型SESN2过表达质粒共转染后双荧光素酶报告结果。(E)阴性对照组和chi-miR-130b-3p模拟物处理组中SESN2在蛋白水平表达量。(F)阴性对照组和chi-miR-130b-3p干扰物处理组中SESN2在蛋白水平表达量。
图4为SESN2的干扰和过表达效率验证;
其中:(A)三条不同位点的干扰序列SESN2在mRNA水平表达的影响。(B)
SESN2干扰序列对SESN2在蛋白水平表达量的影响。(C)SESN2过表达质粒对SESN2在mRNA水平表达的影响。(D)SESN2过表达质粒对SESN2在蛋白水平表达的影响。
图5为SESN2和chi-miR-130b-3p对ZEA引起的GCs凋亡的影响;
其中:(A-D)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对GCs细胞活力以及细胞凋亡流式结果的影响。(E-H)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对BAX、BCL-2、PCNA等凋亡相关基因在蛋白水平表达量的影响。
图6为SESN2和chi-miR-130b-3p对ZEA引起的GCs氧化应激的影响;
其中:(A-D)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对GCs内ROS积累水平的影响。(E-H)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对CAT和SOD2等凋亡相关基因在蛋白水平表达量的影响。(I-L)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对MDA、CAT、SOD等氧化应激指标的影响。
图7为SESN2和chi-miR-130b-3p对KEAP1/NRF2信号通路的影响;
其中:(A-D)ZEA和SESN2/chi-miR-130b-3p的过表达/干扰联合处理对KEAP1/NRF2信号通路相关蛋白表达量的影响,包括KEAP1、NRF2和HO-1。
图8为SESN2和chi-miR-130b-3p对KEAP1/NRF2信号通路作用模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
1.材料与方法
1.1试验材料
本研究所有操作均严格执行南京农业大学《实验动物管理条例》(SYXK2011-0036)。本研究所用山羊卵巢GCs收集于江苏省海门市海门山羊研究院,GCs样品收集后存于液氮(-196℃)中用于后续试验。
1.2试验方法
1.2.1GCs的培养
GCs在6孔培养板中培养,6孔板补充有由DMEM/F12 glutaMAX(Gibco,ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)、10%胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素/链霉素(P/S)组成的完全培养基。所有细胞在37℃,5% CO
1.2.2过表达载体构建以及基因干扰序列设计
将SESN2的编码结构域序列(CDS)(XM_018056884.1)克隆到pEX过表达载体中(Tsingke,Nanjing,China)。所有微型干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的阴性对照(si-NC)、SESN2的siRNAs(si-SESN2(740)、si-SESN2(1322)、si-SESN2(1661))、模拟物的阴性对照(mimics-NC)、chi-miR-130b-3p的模拟物(mimics-chi-miR-130db-3p)、抑制剂的阴性对照(inhibitor-NC)和chi-miR-130b-3p抑制剂(inhibitor-chi-miR-130b-3p)均由GenePharma(Shanghai,China)设计和合成,siRNA及chi-miR-130db-3p相关序列见下表1,SESN2过表达序列见下表2。
表1siRNA和chi-miR-130b-3p相关序列Table 1Sequences of siRNA andchi-miR-130b-3p mimics/inhibitor used in this study
表2SESN2过表达序列Table 2Overexpression sequence of SESN2 used inthis study
1.2.3GCs处理及转染
将GCs接种到6孔板中进行转染。当GCs密度达到60-70%时,根据转染试剂说明书方案,将与Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen,Waltham,CA,USA)混合的SESN2干扰序列/过表达质粒(南京擎科公司构建合成,NJ0049585-1)或chi-miR-130b-3p的模拟物/抑制剂添加到6孔板中。ZEA粉末(Selleck,Shanghai,China)溶解到200mM二甲基亚砜(DMSO)(Invitrogen,Shanghain,China)中作为浓缩储备溶液,后续试验时用DMEM/F12稀释到处理浓度(200μM)。在收获RNA和蛋白质细胞样品之前12小时,将ZEA添加到完整培养基中。转染后24小时收集细胞进行RNA提取,转染后48小时收集细胞用于蛋白质提取。
1.2.4CCK-8测定细胞活力
将GCs接种在96孔培养板中,培养基含有规定浓度的ZEA(0、50、100和200μmol/L),并在二甲基亚砜(di-methyl sulfoxide,DMSO)中稀释。用ZEA处理8小时后,将10μL细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂添加到每个孔中,并在37℃,5% CO
1.2.5流式细胞仪分析GCs凋亡
细胞凋亡分析样品:收集6孔板中所有细胞,包括悬浮在完全培养基中的细胞,并将其储存在DPBS中。样品在2小时内送往南京良维生物科技有限公司进行流式分析。
1.2.6双荧光素酶报告载体试验
将293T细胞接种在24孔板中,将Lipofectamine 3000和100nM的mimics-NC或mimics-chi-miR-130b-3p和0.5ng SESN2 3’UTR的野生型(WT)或突变型(MUT)过表达质粒转染,详细序列见下表3。转染48小时后收集细胞样品,根据试剂盒说明书,使用双萤光素酶报告基因测定系统(Vazyme,Nanjing,China)测定样品荧光强度。
表3SESN2-3’UTR载体序列Table 3The sequences of SESN2-3’UTR vector
1.2.7ROS水平检测
在转染和ZEA处理后,根据说明书使用ROS测定试剂盒(S0033S,Beyotime,Nanjing,China)评估GCs的ROS水平。使用Image J软件(Wayne Rasband,MD,USA)分析ROS的荧光强度。
1.2.8ELISA检测氧化应激相关指标
在转染48小时和ZEA处理12小时后,收集细胞上清液,并根据说明书方案,使用ELISA测定法(Amresco,Shanghai,China)测定包括MDA、SOD和CAT在内的细胞氧化应激相关指数。
1.2.9总RNA的提取及反转录
(1)总RNA的提取
1)收集6孔板中GCs,置于2mL的离心管内,加入1mL Trizol试剂匀浆,室温下放置5min;
2)向1)中加入0.2mL氯仿,上下混匀离心管10s后室温中放置6min,12000g离心15min;
3)取上清液加等体积的异丙醇,上下混匀,室温静置10min;12000g离心10min;
4)吸走上清液体,留白色沉淀物,加入1mL 75%的乙醇,上下轻轻颠倒洗涤离心管壁。4℃,12000g离心5min;
5)重复步骤4);
6)弃上清,静置10min,晾干EP管中残余酒精。加入10~50μL(视RNA沉淀量估算)无RNA酶水溶解RNA沉淀。
(2)RNA质检
紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度,260/280比值须在1.8-2.0之间,可以进行后续试验。
(3)合成cDNA
用诺唯赞的反转录试剂盒反转录RNA成cDNA,反应体系见表4和表5。其中1*表示在反应体系中根据RNA的浓度来确定加入RNA的体积,保证总RNA的量保持一致(1μg)。
表4去除基因组DNA反应体系
Table 4 The reaction of removing genomic DNA
程序:42℃,2min;4℃保存。
表5反转录反应体系
Table 5 The reverse transcription reaction
程序:37℃15min,85℃5s,4℃恒温。
1.2.10实时荧光定量
使用诺唯赞的荧光定量试剂盒,按说明书操作,反应程序:95℃预变性5min;95℃变性10s,60℃退火30s,共40个循环;最后72℃延伸10min。反应结束后以GAPDH为内参基因,使用2
表6荧光定量PCR的引物序列信息
Table 6 Sequences used for qRT-PCR
1.2.11蛋白样品的收集与变性
(1)蛋白裂解液:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂(100:2:1,v:v:v)混合后裂解样品;
(2)冰上静置10min后于高速离心机内4℃,12000g离心10min,收取上清液即为细胞蛋白原液;
(3)按照BCA试剂盒的说明书测定蛋白浓度;
(4)根据提取的蛋白浓度,加入适量的蛋白原液、超纯水、4×的蛋白上样缓冲液和10×的还原剂,使得变性体系中的蛋白浓度一致;
(5)70℃变性10min,保存于-20℃中。
1.2.12蛋白质免疫印迹
(1)上样:预制胶拔掉梳子,每个胶孔中加入10μL变性蛋白样品,两边各预留一孔加入蛋白Marker;
(2)电泳:电压200V,40min;
(3)转膜:半干转25V恒压13min;
(4)封闭:将转膜后的PVDF膜用5%(v/v)的脱脂奶粉封闭2h;
(5)一抗孵育:将封闭后的PVDF膜用一抗孵育,4℃过夜;
(6)二抗孵育:将一抗孵育后的PVDF膜洗3次;随后室温下孵育二抗1h;随后再洗6次;
(7)ECL显影:将PVDF膜浸泡在ECL发光液中30s,在凝胶成像仪中曝光拍照;
(8)光密度分析:采用Image J软件对各条带进行灰度分析。
所涉及的一抗和二抗的抗体信息见表7。
表7抗体信息表
1.3统计方法
使用SPSS 24.0软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)对数据进行分析。两组之间数据使用t检验,三组或三组以上的数据使用单因素方差分析(one-way ANOVA)来比较样本之间差异的显著性。每个实验至少重复三次。数据表示为“平均值±标准误差(SEM)”。p
<0.05(*)和p<0.01(**)分别表示显著差异和极显著差异。
2.结果与分析
2.1靶向SENS2的miRNA筛选
利用测序结果本研究挑选了最有可能和SENS2之间存在互作关系的三个miRNA进行了试验验证。三条miRNA分别为chi-miR-17-5p、chi-miR-20b以及chi-miR-130b-3p(序列见表8)。本研究分别在mRNA以及蛋白水平进行了检测,定量结果显示只有chi-miR-130b-3p能在mRNA水平极显著降低SESN2的表达量(p<0.01)(图1A),WB结果表明同样只有chi-miR-130b-3p能够在蛋白水平极显著降低SESN2的表达(p<0.01)(图1B),因此后续双荧光报告载体试验以及miRNA功能验证均选择chi-miR-130b-3p作为研究对象。
表8三种miRNAs序列
2.2ZEA改变了GCs SESN2和chi-miR-130b-3p的表达
为了探索ZEA对GCs产生细胞毒性作用的确切机制,并寻找减轻ZEA毒性的潜在治疗靶点,本研究对ZEA处理前后的GCs进行了全转录组测序。为了验证测序结果的准确性,随机选择了五个基因来检测它们的表达趋势。qRT-PCR结果显示,所选5个基因的表达趋势与测序结果完全一致,证明测序结果是可靠的(图2A,B)。根据测序结果,本研究发现在ZEA处理后,459个mRNA上调,而3,620个mRNA下调。ZEA组SESN2的表达水平极显著上调(p<0.01)(图2C-E),表明ZEA可能干扰GCs的细胞内稳态。对miRNA的测序结果分析还表明,几种miRNA可能参与SESN2表达的调节(图2F)。根据miRNA和mRNA相互作用的预测结果,本研究发现chi-miR-130b-3p最有可能与SESN2结合。因此,本研究检测了chi-miR-130b-3p的表达水平,结果发现,在ZEA组中,chi-miR-30b-3p表达水平极显著降低(p<0.01)(图2G,H)。在ZEA组中,chi-miR-130b-3p表达的减少和SESN2表达的增加的趋势初步与chi-miR-30b-3p和SESN2之间可能存在相互作用的预测一致。
2.3chi-miR-130b-3p靶向SESN2 mRNA的3’UTR区域
为了证实chi-miR-130b-3p确实能够对SENS2的表达起到调节作用,本研究进行了双荧光素酶报告测定。测序结果表明chi-miR-130b-3p可以与SESN2 mRNA的3’UTR区域结合。根据这一结果,本研究设计了靶向chi-miRNA-130b-3p和SESN2结合序列的双荧光素酶报告载体,包括野生型(WT)和突变型(MUT)(图3A)。首先本研究通过qRT-PCR结果确定了针对chi-miR-130b-3p设计的模拟序列和干扰序列的有效性(图3B,C)。此后,本研究用chi-miR-130b-3p的模拟序列和SESN2的WT/MUT质粒共同在293T细胞中转染。双荧光素酶报告分析结果显示,chi-miR-130b-3p的模拟序列可显著降低WT-SESN2的荧光强度(p<0.05),而MUT-SESN2的荧光强度没有改变(图3D)。此外,chi-miR-130b-3p的模拟序列可显著降低GCs中SESN2的蛋白表达(p<0.05)(图3E),而chi-miR-30b-3p干扰序列可显著增加GCs中SESN2蛋白的表达(p<0.05)。综上所述,这些结果表明chi-miR-130b-3p可以与SESN2 mRNA的3’UTR结合,下调SESN2的表达。
2.4SESN2干扰序列以及过表达质粒效率验证
为了保证后续针对SESN2功能验证研究的准确性,本研究对于SESN2的干扰以及过表达效率进行了验证。针对SESN2的CDS序列本研究设计了3条干扰序列,位点分别处于SESN2 CDS序列的740bp、1332bp、1661bp。荧光定量结果显示位于1332bp和1661bp处的干扰序列均能极显著降低SESN2在mRNA水平的表达量(p<0.01)(图4A),但是1332bp位点处的干扰序列效果更好。在此基础上本研究进行了蛋白水平的验证,WB结果显示位于1332bp处的干扰序列也能在蛋白水平极显著降低SENS2的表达量(p<0.01)(图4B),因此后续试验本研究将位于SESN2 CDS序列1332bp处的干扰序列定为si-SESN2处理组。同样的本研究也验证了SESN2的过表达效率,定量结果显示过表达质粒能在mRNA水平上极显著上升(p<0.01)(图4C);蛋白水平上增加约2倍(p<0.01)(图4D)。综上所述,针对SESN2构建的干扰序列以及过表达质粒效果均显著,可以用于开展后续试验验证。
2.5SESN2/chi-miR-130b-3p对ZEA引起的GCs凋亡的影响
基于大量已有的研究报道称SESN2对于细胞抵抗外界因素刺激具有正向的调节作用(Li et al.,2021,Park et al.,2022,Wu et al.,2021),本研究尝试研究SESN2是否也可以减轻ZEA在GCs中诱导的细胞毒性损伤。此外,鉴于chi-miR-130b-3p作为SESN2的上游调节因子,本研究猜测chi-miR-130b-3p的表达也可能与ZEA诱导的GCs损伤过程有关。CCK-8结果显示,ZEA会显著降低GC的细胞活力(p<0.01)(图5A-D)。SESN2的过表达和chi-miR-130b-3p的干扰都有恢复受损细胞活力的趋势(图5A,B)。值得注意的是,SESN2的过表达对这一过程有非常显著的影响(p<0.01)(图5A)。相反,SESN2的抑制或chi-miR-130b-3p的过表达会加剧ZEA对GCs细胞活力的损伤,尽管这种影响并不显著(图5C,D)。为了进一步探讨SESN2和chi-miR-130b-3p对ZEA诱导的GCs凋亡的影响,本研究进行了流式分析以检测细胞凋亡水平。结果表明,SESN2的过表达(p<0.05)(图5E)或chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.05)可减弱ZEA诱导的GCs凋亡。然而,SESN2(p<0.01)的抑制(图5G)和chi-miR-130b-3p的过表达(p<0.01)(图5H)会加重GCs的凋亡。为了验证这些表型数据,本研究检测了与细胞活力和凋亡相关的几个基因的表达水平,包括BAX、BCL-2和PCNA。与CCK-8和流式细胞检测结果一致,在ZEA处理的基础上,BAX的表达随着SESN2的过表达(p<0.05)(图5I)或chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.05)下调(图5J),而SESN2的干扰或chi-miR-130b-3p的过表达会进一步使BAX的表达量上升。BCL-2和PCNA的趋势则刚好与BAX的趋势相反。总之,这些结果表明SESN2能够在一定程度上恢复ZEA对GC造成的损伤,而chi-miR-130b-3p则发挥相反的作用。
2.6SESN2/chi-miR-130b-3p对ZEA引起的GCs内氧化应激损伤的影响
SESN2自最初被发现以来,其抗氧化能力就一直被人们所熟知(Wang et al.,2021)。同时有研究表明ZEA可以通过引起GCs中ROS的积累来引起氧化应激损伤(Zheng etal.,2019)。基于这两方面研究的结果,本研究想探索SESN2和chi-miR-130b-3p是否会对ZEA诱导的GCs中ROS的积累和氧化应激损伤过程产生影响。首先本研究分别测定了不同处理组的GCs内ROS水平。本研究观察到ZEA暴露导致GCs中ROS水平显著增加(p<0.01)(图6A-D),而SESN2的过表达(p<0.05)(图6A)和chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.01)(图6B)会减轻GCs内ROS的积累,而SESN2的干扰(p<0.01)(图6C)或chi-miR-130b-3p的过表达(p<0.01)(图6D)会加剧GCs内ROS的积累。然后,本研究通过WB检测了SOD2和CAT的表达水平,结果表明ZEA抑制了CAT和SOD2的表达(图6E-H)。然而,这种损伤可以通过SESN2的过表达(p<0.05)(图6E)或chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.05)来逆转(图6F),而SESN2(p<0.01)的抑制(图6G)和chi-miR-30b-3p的过表达(p<0.01)会加重ZEA对上述抗氧化酶表达的抑制(图6H)。此外,本研究分别使用MDA、SOD和CAT的ELISA试剂盒评估了ZEA处理的GCs的氧化应激水平和抗氧化酶活性。与本研究预期的结果一致,SOD和CAT的活性和WB结果相吻合(图6I-L),ZEA增加的MDA浓度可以通过SESN2的过表达(p<0.05)(图6I)或chi-miR-130b-3p的干扰(p<0.01)来减轻(图6J),但SESN2的抑制(p<0.01)(图6K)和chi-miR-130b-3p的过表达(p<0.01)增强了GCs内MDA的积累水平(图6L)。上述证据表明,SESN2和chi-miR-130b-3p参与了ZEA在GCs中引起的ROS积累和氧化应激损伤过程。
2.7SESN2/chi-miR-130b-3p对KEP1/NRF2信号通路的影响
SESN2由于其抗氧化能力被人们所熟知,之前的研究已经证实SESN2会参与调节KEAP1/NRF2信号通路来发挥其抗氧化功能(Fan,et al.,2020)。鉴于本研究关于SESN2和chi-miR-130b-3p对GCs中ROS积累和氧化应激损伤的研究结果,本研究试图探索SESN2和chi-miR-130b-3p是否通过调节KEAP1/NRF2这一信号通路来对ZEA诱导的GCs中ROS积累和氧化应激损伤产生影响。为此,本研究采用WB分析来评估KEAP1、NRF2和血红素加氧酶1(haeme oxygenase 1,HO-1)蛋白的表达水平。在ZEA处理的基础上,结果如图7所示,KEAP1的表达随着SESN2的过表达(图7A)或chi-miR-130b-3p的干扰而降低(p<0.05)(图7B),但随着SESN2(p<0.05)的抑制(图7C)或chi-miR-130b-3p的过表达(图7D)而升高,而NRF2和HO-1的表达呈与KEAP1相反的趋势(图7A-D)。上述结果可以证实SESN2和chi-miR-130b-3p能够通过KEAP1/NRF2信号通路影响ZEA在GCs中引起的ROS积累和氧化应激损伤,具体调节作用如图8所示。
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